CN111718974B - 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用，属于活性肽技术领域，所述绿豆肽的制备方法包括：将绿豆分离蛋白与水混合，将混合物在50～55℃下处理50～70min，得到处理物；调节处理物的pH值为8.5，与碱性蛋白酶混合后酶解，调节酶解物的pH值为5，将调节物灭酶，得到灭酶物，将所述灭酶物在55～60℃下经活性炭吸附50～70min，再依次过30000Da的陶瓷膜和1KD有机膜，干燥后，得到绿豆肽。采用本发明提供的绿豆肽和活性肽具有促排铅作用、具有促进铅中毒引起的运动神经损伤再生作用和具有保护铅中毒引起的轴索损伤作用。

Description

绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，尤其涉及绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用。

背景技术

铅污染物广泛存在于人们的生活环境中，当发生铅中毒时，人体的神经、心血管、骨骼、生殖和免疫系统的损伤。并引起胃肠、肝脏、肾脏等恶劣性疾病。铅中毒的预防主要措施还是远离铅污染区和改变人们现有的饮食习惯。目前，铅毒的治疗主要分为两大类，临床治疗和保健治疗。开发和利用天然性特医保健食品，对于体内积累了一定量的铅，不符合临床中毒治疗标准的人来说，具有更加重要的意义。

目前，符合这些条件并广泛应用于临床的除铅药物品种相对稀少。治疗药物主要是巯基竞争性解毒剂和卵羧基金属螯合剂。注射和口服治疗方法主要针对铅中毒的临床治疗。这些药物在去除体液和组织细胞中的铅和其他重金属离子时的无差别性，还具有肝肾毒性和给药不方便的特点。

作为预防和治疗药物，也有简单的中药处方和营养保健饮料等。虽然有一定疗效，但都存在起效慢、周期长、停药后复发率高、不足以达到有效促进排铅的目的等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用，对铅具有促排作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用，所述绿豆肽的制备方法包括以下步骤：

1)将绿豆分离蛋白与水混合，得到混合物，将所述混合物在50～55℃下处理50～70min，得到处理物；

2)调节所述步骤1)得到的处理物的pH值为8.5，与碱性蛋白酶混合后在55～65℃下酶解2.5～3.5h，得到酶解物，调节所述酶解物的pH值为5，得到调节物；

3)将所述步骤2)得到的调节物灭酶，得到灭酶物，将所述灭酶物在55～60℃下经活性炭吸附50～70min，再依次过30000Da的陶瓷膜和1KD有机膜，干燥后，得到绿豆肽。

优选的，所述步骤1)绿豆分离蛋白的质量与水的体积比为1000kg:10000L。

优选的，所述步骤2)处理物与碱性蛋白酶的质量比为100:3。

本发明还提供了绿豆肽在制备促进铅中毒引起的运动神经损伤再生的药物中的应用。

本发明还提供了绿豆肽在制备保护铅中毒引起的轴索损伤的药物中的应用。

本发明还提供了一种活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述活性肽的制备包括：将权利要求1所述的绿豆肽与水混合，得到混合液，将所述混合液经Sephadex G-50层析柱分离纯化，收集保留时间为18.5min的组分，得到活性肽。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备促排铅的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备促进铅中毒引起的运动神经损伤再生的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备保护铅中毒引起的轴索损伤的药物中的应用。

本发明提供了绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用，所述绿豆肽的制备方法包括以下步骤：1)将绿豆分离蛋白与水混合，得到混合物，将所述混合物在50～55℃下处理50～70min，得到处理物；2)调节所述步骤1)得到的处理物的pH值为8.5，与碱性蛋白酶混合后在55～65℃下酶解2.5～3.5h，得到酶解物，调节所述酶解物的pH值为5，得到调节物；3)将所述步骤2)得到的调节物灭酶，得到灭酶物，将所述灭酶物在55～60℃下经活性炭吸附50～70min，再依次过30000Da的陶瓷膜和1KD有机膜，干燥后，得到绿豆肽。

本发明实施例的结果显示：采用本发明提供的绿豆肽和活性肽具有促排铅作用、具有促进铅中毒引起的运动神经损伤再生作用和具有保护铅中毒引起的轴索损伤作用。

附图说明

图1为治疗组斑马鱼体内铅含量与模型对照组比较，*p<0.05

图2为成分一和成分二对斑马鱼外周运动神经损伤的促再生作用表型图红色虚线代表外周运动神经长度；

图3为成分一和成分二对斑马鱼外周运动神经长度，与模型对照组比较，*p<0.05；

图4为成分一和成分二对斑马鱼外周运动神经损伤的促再生作用，与模型对照组比较，*p<0.05；

图5为成分一和成分二对斑马鱼轴索损伤的保护作用表型图，黄色虚线内红色荧光标记代表脑部的轴索束；

图6为成分一和成分二对斑马鱼对头部轴索荧光强度的影响，与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p≤0.001；

图7为成分一和成分二对斑马鱼对轴索损伤的保护作用与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p≤0.001。

图8为绿豆肽(Tyr-His-Asp-Ile-Phe-Met-Pro-Tyr)液相色谱-QEXACTIVE质谱联用二级质谱图。

具体实施方式

本发明提供了绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用，所述绿豆肽的制备方法包括以下步骤：

1)将绿豆分离蛋白与水混合，得到混合物，将所述混合物在50～55℃下处理50～70min，得到处理物；

2)调节所述步骤1)得到的处理物的pH值为8.5，与碱性蛋白酶混合后在55～65℃下酶解2.5～3.5h，得到酶解物，调节所述酶解物的pH值为5，得到调节物；

3)将所述步骤2)得到的调节物灭酶，得到灭酶物，将所述灭酶物在55～60℃下经活性炭吸附50～70min，再依次过30000Da的陶瓷膜和1KD有机膜，干燥后，得到绿豆肽。

将绿豆分离蛋白与水混合，得到混合物，将所述混合物在50～55℃下处理50～70min，得到处理物。

在本发明中，所述绿豆分离蛋白的质量与水的体积比优选为1000kg:10000L。在本发明中，所述水优选为去离子水。

本发明将所述混合物在50～55℃下处理50～70min，优选在50～55℃下处理60min。

本发明调节得到的处理物的pH值为8.5，与碱性蛋白酶混合后在55～65℃下酶解2.5～3.5h，得到酶解物，调节所述酶解物的pH值为5，得到调节物。

本发明优选使用1M的氢氧化钠溶液调节处理物的pH值。在本发明中，所述处理物与碱性蛋白酶的质量比优选为100:3。在本发明中，所述酶解的时间优选为3h，所述酶解的温度优选为60℃。本发明优选使用1M的盐酸溶液调节酶解物的pH值。

本发明将得到的调节物灭酶，得到灭酶物，将所述灭酶物在55～60℃下经活性炭吸附50～70min，再依次过30000Da的陶瓷膜和1KD有机膜，干燥后，得到绿豆肽。

在本发明中，所述灭酶的温度优选为110℃，所述灭酶的时间优选为5min。在本发明中，所述干燥优选为喷雾干燥。

本发明还提供了绿豆肽在制备促进铅中毒引起的运动神经损伤再生的药物中的应用。

本发明还提供了绿豆肽在制备保护铅中毒引起的轴索损伤的药物中的应用。

本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用绿豆肽在医学上可接受的剂型即可。

本发明还提供了一种活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

YHDIFMPY。

在本发明中，所述活性肽的制备优选包括：将上述技术方案所述的绿豆肽与水混合，得到混合液，将所述混合液经Sephadex G-50层析柱分离纯化，收集保留时间为18.5min的组分，得到活性肽。

在本发明中，所述混合液中活性肽的浓度优选为120mg/ml。在本发明中，所述Sephadex G-50层析柱的规格为3×100cm。在本发明中，所述分离纯化的参数优选为：流动相为10％甲醇，流速为1ml/min，洗脱液214nm处测定吸光度。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备促排铅的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备促进铅中毒引起的运动神经损伤再生的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的活性肽在制备保护铅中毒引起的轴索损伤的药物中的应用。

本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用活性肽在医学上可接受的剂型即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

绿豆肽的生产方法：

步骤一.取绿豆分离蛋白1000kg进行调浆，加入无离子水10000L，底物浓度为10％。

步骤二.将步骤一的绿豆分离蛋白溶液搅拌均匀，并升温至55℃，保温1h。

步骤三.将步骤二的溶液用1MNaOH调pH至8.5，并升温至60℃。

步骤四.将步骤三种的溶液加入质量百分含量为3％的碱性蛋白酶(30Kg)，酶解3h后加入1M HCl，调pH至5。

步骤五.将步骤四中的溶液升温至110℃，保持5min。

步骤六.将步骤五的灭酶溶液降温至55～60℃，加入活性炭，保温1h后过30000Da陶瓷膜，然后过1Kd有机膜，喷雾干燥，得到绿豆肽。

实施例2

绿豆肽的分离纯化

步骤一.将实施例1中生产的绿豆肽加水溶解，配制成120mg/mL，采用Sephadex G-50层析柱(3*100cm)进行分离纯化，流动相为10％甲醇，流速为1ml/min，洗脱液214nm处测定吸光度，按照色谱峰收集流份并将各流份浓缩后用真空干燥机冷冻干燥成粉。

步骤二.将步骤一中所得到的不同组分利用斑马鱼铅中毒模型，验证不同组分的排铅效果，发现保留时间为18.5min的色谱峰具有良好的促排铅效果。首先将此组分利用高效液相色谱进一步分离纯化，再进行结构鉴定。

步骤三.纯度及结构的鉴定：采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对步骤一所得到的不同组分进行纯度和结构鉴定。

色谱条件：

(1)流动相:A相:100％纯净水+0.1％甲酸；B相:100％乙腈+0.1％甲酸；

(2)流动相流速:300nl/min

(3)进样量:1μL上清

(4)流动相梯度程序：

表1流动相梯度程序

时间(分)	0	2.0	36.0	38.0	41.0	42.0	45.0
								A(％)	97	97	63	10	10	97	97
B(％)	3	3	37	90	90	3	3

利用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用，鉴定其结构为YHDIFMPY(Tyr-His-Asp-Ile-Phe-Met-Pro-Tyr)的单链多肽。通过液质联用技术测定此多肽单链在绿豆肽中占比为7.9％，经过Sephadex G-50层析柱分离纯化后其占比达到了89％。因此，将实施例2中经过Sephadex G-50层析柱分离纯化后得到的绿豆肽命名为成分一；将实施例2中通过Sephadex G-50层析柱分离纯化得到的18.5色谱峰组分经过纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用鉴定其序列为YHDIFMPY(Tyr-His-Asp-Ile-Phe-Met-Pro-Tyr)，并通过上海强耀生物公司合成此肽并命名为成分二(即活性肽)。

实施例3

斑马鱼铅中毒模型评价成分一和成分二促排铅作用

随机选取240尾受精后2小时(2hpf)野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每个孔30尾，每孔容量为3mL，共处理6个平行组。水溶给予成分一27.8、83.3、250μg/mL、成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度，阳性对照药注射给予依地酸钙钠125ng/尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组。水溶给予醋酸铅建立铅中毒模型，给药70h后，用EP管收集斑马鱼样本(洗净药液、吸干养鱼用水)，每60尾斑马鱼为1份样本，用ICP-MS检测每份斑马鱼样本的含铅量，用含铅量与斑马鱼湿重的比值换算出斑马鱼体内铅含量(C)，以铅含量的统计学意义评价纯肽即活性肽()和绿豆肽复方的促排铅作用。统计学处理结果用mean±SE表示；供试品促排铅作用计算公式如下：

统计学分析采用独立样本T检验，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

结果显示：铅中毒模型对照组斑马鱼体内铅含量(9.01μg/g)显著高于正常对照组(3.11μg/g)，提示模型构建成功(p<0.01)。阳性对照药依地酸钙钠125ng/尾体内铅含量(8.38μg/g)与模型对照组(9.01μg/g)比较p>0.05，促排铅作用为7％，表明本实验剂量条件下依地酸钙钠有一定的促排铅作用趋势。

成分一27.8、83.3和250μg/mL浓度斑马鱼体内铅含量为8.69、8.28和6.43μg/g，与模型对照组两两比较p>0.05&p<0.05，促排铅作用为3.6％、8％和29％；成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度斑马鱼体内铅含量分别为8.39、7.95和6.31μg/g，与模型对照组两两比较p>0.05&p>0.05&p<0.05，促排铅作用分别为6.9％、11.8％和30％。表明成分一和成分二复方具有明显的促排铅作用。

表2成分一和成分二对斑马鱼体内铅含量的影响

注：每个实验组检测3份平行样本，每份收集60尾斑马鱼；与模型对照组比较，*p<0.05

实施例4

评价成分一和成分二对铅中毒引起的运动神经损伤的促再生作用

随机选取240尾2hpf转基因运动神经元荧光斑马鱼NBT品系于六孔板中，每个孔30尾，每孔容量为3mL，水溶给予成分一27.8、83.3、250μg/mL、成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度，阳性对照药注射给予依地酸钙钠125ng/尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组。水溶给予醋酸铅建立铅中毒模型，给药70h后，在荧光显微镜下拍照，采集斑马鱼泄殖孔上方三个体节所在区域的外周运动神经长度平均值(L)，以运动神经长度统计学意义评价纯肽和绿豆肽复方的运动神经促再生作用。运动神经损伤的促再生作用计算公式如下：

统计学分析采用T检验和单因素方差分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

结果显示：铅中毒模型对照组斑马鱼外周运动神经长度(204像素)明显小于正常对照组(228像素)，提示外周运动神经损伤模型构建成功(p<0.001)；阳性对照药依地酸钙钠斑马鱼外周运动神经长度(215像素)与模型对照组(204像素)相比有显著增加(p<0.05)，运动神经促再生作用为46％，表明依地酸钙钠对铅中毒引起的运动神经损伤有明显促再生作用。

水溶给予成分一27.8、83.3、250μg/mL浓度，浓度斑马鱼外周运动神经长度为206、211和214像素，与模型对照组比较p>0.05&p<0.05，对铅中毒引起的运动神经损伤的促再生作用8.3％、29％和42％；成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度斑马鱼外周运动神经长度分别为215、216和216像素，与模型对照组比较p均<0.05，对铅中毒引起的运动神经促再生作用分别为46％、50％和50％。表明成分一和成分二对铅中毒引起的外周运动神经损伤具有明显的促再生作用。详见表3、图2、图3和图4。

表3成分一和成分二对斑马鱼外周运动神经损伤的促再生作用(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05

实施例5

评价成分一和成分二对铅中毒引起的轴索损伤的保护作用

随机选取240尾2hpf转基因野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每个孔30尾，每孔容量为3mL，水溶给予成分一27.8、83.3和250μg/mL浓度、成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度，阳性对照药注射给予依地酸钙钠125ng/尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组。水溶给予醋酸铅建立铅中毒模型，给药70h后，用轴索特异性抗体染色，在荧光显微镜下拍照，采集斑马鱼头部轴索荧光强度(S)，以头部轴索荧光强度统计学意义评价纯肽和绿豆肽复方的轴索保护作用。轴索损伤的保护作用计算公式如下：

统计学分析采用T检验和单因素方差分析，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。124372

结果显示，铅中毒模型对照组斑马鱼头部轴索荧光强度(707955像素)明显弱于正常对照组(832327像素)，提示头部轴索损伤模型构建成功(p<0.001)。阳性对照药依地酸钙钠斑马鱼头部轴索荧光强度(813117像素)与模型对照组(707955像素)相比明显增强(p<0.05)，对轴索损伤的保护作用为85％，表明依地酸钙钠对铅中毒引起的轴索损伤具有明显的保护作用。

成分一27.8、83.3和250μg/mL浓度斑马鱼头部轴索荧光强度分别为814069、805023和824010像素，与模型对照组比较p<0.01&p<0.01&p≤0.001，对铅中毒引起的轴索损伤的保护作用分别为85％、78％和93％。成分二27.8、83.3和250μg/mL浓度斑马鱼头部轴索荧光强度为813960、829757和833368，与模型对照组比较p均<0.01，对铅中毒引起的轴索损伤的保护作用为85％、98％和101％；表明纯肽和绿豆肽复方对铅中毒引起的轴索损伤具有明显的保护作用。详见表4、图4、图5和图6。

表4成分一和成分二对斑马鱼轴索损伤的保护作用(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p≤0.001

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的绿豆肽和活性肽具有促排铅作用、具有促进铅中毒引起的运动神经损伤再生作用和具有保护铅中毒引起的轴索损伤作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中食都庆（山东）生物技术有限公司

<120> 绿豆肽在制备促排铅的药物中的应用、活性肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr His Asp Ile Phe Met Pro Tyr

1 5

Claims (4)

1.一种活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的活性肽在制备促排铅的药物中的应用。

3.权利要求1所述的活性肽在制备促进铅中毒引起的运动神经损伤再生的药物中的应用。

4.权利要求1所述的活性肽在制备保护铅中毒引起的轴索损伤的药物中的应用。

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