CN102925523B - 酶解法制备鹿胎活性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶解法制备鹿胎活性多肽。采用的技术方案是：取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；取鹿胎盘提取液，于30～35℃下预热10～15min，调节pH值为1.5-7.5，于35～50℃下，加入酶，酶解反应5～8h后，于65℃下加热灭菌30min，离心，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉。本发明可从鹿胎中提取更多活性多肽物质，不仅使废弃多糖与脂类资源得到充分利用，又可降低其处理成本，同时避免造成环境污染。
Description
技术领域
本发明属于食品科学和生物工程领域，具体地涉及利用生物蛋白酶制备鹿胎盘活性多肽的方法，以获得具有生物学活性的新产品。
背景技术
鹿胎系指母鹿腹中的带胎衣、胎水的胎儿，或体表无毛、空腹、体内各器官已经发育完整，但是由于机械等原因造成流产的胎儿或产后因缺乳、母鹿拒哺、恶癖等原因死亡的幼鹿。鹿胎的药理作用首载《本草纲目》，言其有益肾阳、补精血之功效。胎盘在免疫学上有增强抵抗力和免疫力的作用。现代生物学及医学研究证明，胎盘中均含有多种免疫球蛋白、活性肽、激素等生物活性物质及氨基酸、矿物质等成分，是一种较为理想的免疫调节剂和营养美容保健品。
虽然，我国在利用动物组织器官及代谢产物进行治病、防病方面有着悠久的历史。但是，国内外对于羊胎、牛胎、猪胎等的研究较为深入，而对于鹿胎的研究较少。我国对于鹿胎的应用非常原始，鹿胎产品加工粗糙，产品初级、种类单一，疗效不显著，造成鹿胎资源的极大浪费。虽然也有研究鹿胎深加工的方法已经公开，其采用的是丙酮提取法，而利用现代生物酶工程技术，以酶解法从鹿胎中提取活性多肽的方法还未有报道。
发明内容
针对上述问题，本发明通过生物酶工程技术，提供一种节约资源，可从鹿胎中提取出更多的鹿胎活性多肽的酶解方法。本发明改变以往的鹿胎蛋白的提取方式，通过生物酶工程技术，科学合理地制备鹿胎活性多肽，实现鹿产品的工业化生产和新产品开发。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：酶解法制备鹿胎活性多肽，包括如下步骤：
1) 取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2) 取鹿胎盘提取液，于30～35℃下预热10～15min，调节pH值为1.5-8.0，于35～50℃下，加入酶，酶解反应5～8h后，于65℃下加热灭菌30min，离心，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3) 所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉；
4) 称取沉淀物，加入2.5倍重量的乙醇，浸泡4次，每次24小时，离心过滤，合并过滤后的上清液，在通风橱中静置5-6小时，使乙醇充分挥发，得到鹿胎盘脂溶性提取液。
上述的酶解法制备鹿胎活性多肽，所述的酶是胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
本发明的有益效果是：本发明解决了以往鹿胎产品多肽提取量少、产品初级、种类单一等问题。本发明充分利用了鹿胎，达到了最大限度地获得鹿胎中的活性多肽，可一次生产出鹿胎活性多肽和鹿胎脂溶性提取液两种活性成分产品，产品种类多样化。本发明利用鹿胎下脚料制备鹿胎脂溶性提取液，不仅节省了工业成本，还大大提高了原料的利用率，使废弃资源得到充分利用，而且也降低了其处理成本，避免造成环境污染。本发明制得的鹿胎活性多肽液具有非常好的抗炎、抗衰老、增强机体免疫力，预防肿瘤、美容、养颜等多种功效，对大肠癌、肺癌、乳腺癌等具有非常好的抑制活性。鹿胎脂溶性提取液中含有丰富的糖类和脂类物质。这些糖类和脂类物质可作为添加剂与引诱剂应用在饲料加工领域。通过本发明实现了对鹿胎活性多肽的最大限度的利用，为进一步新产品开发奠定基础。
具体实施方式
实施例1 酶解法制备鹿胎活性多肽
1) 取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2) 取鹿胎盘提取液，于30℃下预热10min，调节pH值为1.5，于35℃下，加入胃蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应5h，反应过程中维持酶解液的pH为1.5，温度为35℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3) 所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉，其产率为每公斤鹿胎可以得到15 g鹿胎活性多肽纯品。
实施例2 酶解法制备鹿胎活性多肽
1) 取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2) 取鹿胎盘提取液，于35℃下预热10min，调节pH值为7.5，于50℃下，加入菠萝蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应8h，反应过程中维持酶解液的pH为7.5，温度为50℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3) 所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎活性多肽干粉，其产率为每公斤鹿胎可以得到17 g鹿胎活性多肽纯品；
4) 称取沉淀物，加入2.5倍重量的乙醇，浸泡4次，每次24小时，离心过滤，合并过滤后的上清液，在通风橱中静置5-6小时，使乙醇充分挥发，得到鹿胎盘脂溶性提取液。
实施例3 酶解法制备鹿胎活性多肽
1) 取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2) 取鹿胎盘提取液，于35℃下预热10min，调节pH值为8.0，于45℃下，加入木瓜蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应8h，反应过程中维持酶解液的pH为8.0，温度为45℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3) 所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉，其产率为每公斤鹿胎可以得到17 g鹿胎活性多肽纯品；
4) 称取沉淀物，加入2.5倍重量的乙醇，浸泡4次每次24小时，离心过滤，合并过滤后的上清液，在通风橱中静置5-6小时，使乙醇充分挥发，得到鹿胎盘脂溶性提取液。
实施例4 酶解法制备鹿胎活性多肽
（一）鹿胎活性多肽的制备
1) 取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2) 取鹿胎盘提取液，于30℃下预热10min，调节pH值为7.0，于40℃下，加入胰凝乳蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应6h，反应过程中维持酶解液的pH为7.0，温度为40℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3) 所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉，其产率为每公斤鹿胎可以得到18 g鹿胎活性多肽纯品；
检测结果：
用MTT法测定鹿胎盘活性多肽提取液的抑瘤活性和淋巴细胞增殖活性。通过体外淋巴细胞增殖实验发现，鹿胎盘活性多肽提取液具有显著促淋巴细胞增殖的功能，并表现出一定的剂量效应，平均淋转率为20％，E-玫瑰花结试验结果显示，花结恢复率达到95％。随着浓度升高其免疫生物学活性逐渐增强，至40ng/ ml浓度附近时免疫生物活性达到最高峰，之后逐渐减弱。抑瘤实验的结果表明，鹿胎活性多肽提取液具有抑制肿瘤细胞生长的作用，有剂量依赖性，随着浓度升高其免疫生物学活性逐渐增强，在40ng/ ml达到最佳效果，抑瘤率为72.43%，之后逐渐减弱。
采用平板法，检测了鹿胎盘活性多肽提取液样品中是否存在需氧菌、厌氧菌、真菌和支原体，结果表明，鹿胎活性多肽提取液液中没有任何微生物感染，研究结果符合《中国生物制品规程》之规定。
采用家兔法，对鹿胎盘活性多肽液中是否存在热原进行了必要的检测，在每只家兔耳静脉注射1 ml鹿胎盘活性多肽提取液样品（100 mg/ml）后，测定的3只家兔体温未见有超过0.6℃的，3只家兔体温升温总和也没有超过1.6℃，研究结果符合《中国生物制品规程》之规定。小鼠急性毒性试验，取同龄雌雄小鼠20只，随机分成2组。反应组腹腔注射1 ml鹿胎盘活性多肽提取液（50 mg/ml），对照组注射生理盐水，连续注射10天，用药后无毒性反应。小鼠慢性毒性试验，取同龄雌雄小鼠40只，随机分成2组。反应组腹腔注射1 ml鹿胎盘活性多肽提取液（50 mg/ml），对照组注射生理盐水，连续注射30天，未见毒性反应，结果符合《中国生物制品规程》之规定。
（二）鹿胎盘脂溶性提取液的制备
4) 称取沉淀物，加入2.5倍重量的乙醇，浸泡4次，每次24小时，离心过滤，合并过滤后的上清液，在通风橱中静置5-6小时，使乙醇充分挥发，得到鹿胎盘脂溶性提取液。
检测结果：
苯酚-硫酸法测定鹿胎盘脂溶性提取液中多糖含量，随着浸提时间与次数的增加，多糖含量先逐渐增加后保持不变，在浸提四次，每次24小时后鹿胎脂溶性提取液中的多糖含量最高，为2.66mg/ml。索氏抽提法测定梅花鹿胎盘脂溶性提取液中粗脂肪含量，利用公式X（％）=（m1-m0）/m×100
式中：X—样品中粗脂肪的质量百分数，单位(％)；
m—样品的质量，单位(g)；
m0 —脂肪烧瓶的质量，单位(g)；
m1 —脂肪和脂肪烧瓶的质量，单位(g)。
得到鹿胎盘脂溶性提取液中粗脂肪含量为3.05%。
Claims (2)
1.鹿胎活性多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2）取鹿胎盘提取液，于30℃下预热10min，调节pH值为7.0，于40℃下，加入胰凝乳蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应6h，反应过程中维持酶解液的pH为7.0，温度为40℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3）所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎盘活性多肽干粉。
2.鹿胎活性多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）取新鲜鹿胎盘除去筋、膜，剪碎；研磨机中研磨、充分匀浆；-40～-20℃冷冻，室温下融化，反复冷冻和融化3～5次，离心，上清液为鹿胎盘提取液，沉淀物备用；
2）取鹿胎盘提取液，于30℃下预热10min，调节pH值为1.5，于35℃下，加入胃蛋白酶，加入量为1600u/ml，酶解反应5h，反应过程中维持酶解液的pH为1.5，温度为35℃，反应后于65℃下加热灭菌30min，8000 r/min离心15min，取上清液，即为鹿胎活性多肽提取液；
3）所得鹿胎活性多肽提取液经冷冻干燥制得鹿胎活性多肽干粉。
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