CN105264066A - 由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使诱导性多能干细胞去分化的培养基组合物，所述培养基组合物含有腔昆布提取物。另外，本发明涉及使用该培养基组合物生产诱导性多能干细胞的方法。根据本发明，当使用该培养基组合物时，可安全、容易且高效地使用间充质干细胞生产诱导性多能干细胞，并且所生产的多能干细胞通过能够分化成多种细胞而可用作细胞治疗剂。

Description

由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞
技术领域
本发明涉及用于从间充质干细胞诱导出多能干细胞的培养基组合物以及使用该培养基组合物生产诱导性多能干细胞的方法。
背景技术
干细胞是用于分化阶段前的未分化细胞的通用术语，干细胞可从多种组织中获得。干细胞具有能够在一定量的时间中连续生产与其本身相同的处于未分化状态的细胞的特性，并具有能够在适当的条件下分化为构成生物组织的各种细胞的特性。
根据分化能力和生成阶段，干细胞可大体上分为胚胎干细胞和成体干细胞。按照视干细胞分化能力而定的另一分类，干细胞可分为多能(pluripotency)干细胞、多潜能(multipotency)干细胞和单能(unipotency)干细胞。
成体干细胞可分为多潜能干细胞或单能干细胞。作为代表性的成体干细胞，存在间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。已知间充质干细胞分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元，造血干细胞主要分化成血液中的血细胞，例如红血球、白血球或血小板。
同时，多能干细胞是指具有多种分化能力的干细胞，该多能干细胞能够分化成构成机体的所有三种胚层(germlayer)，由此能够分化成人体的各种细胞或器官组织。通常，胚胎干细胞与此相符。人胚胎干细胞引发了许多伦理问题，因为它们是由能够发育成人的胚胎产生。然而，已知胚胎干细胞相比成体干细胞而言具有优异的细胞增殖和分化能力。成体干细胞引起较少的伦理问题，因为它们可从骨髓、血液、脑、皮肤等中获得。然而，相比于胚胎干细胞而言，成体干细胞具有有限的分化能力。
作为用于克服这些问题的解决方案，已尝试了多种技术，以通过使来源于成体干细胞的细胞去分化来生产与胚胎干细胞类似的定制的多能干细胞。代表性的技术包括与ES细胞融合、体细胞核转移、通过基因因子进行的重编程(reprogrammingbygenefactor)等。根据与ES细胞融合，诱导的细胞具有另外两对基因，这将导致细胞稳定性方面的问题。体细胞核转移需要大量卵细胞，并且效率非常低(这些都是缺点)。通过基因因子进行的重编程是使用病毒(包括癌基因)通过插入特定基因来诱导去分化的技术，而这一技术具有高的癌症发生风险，并且由于方法方面的低效和困难度，在开发细胞治疗产品的可能性方面不利。
为了成功且大量地获得多能干细胞，在培养分离的脐带来源的单核细胞的阶段中的培养基组合物非常重要。因此，需要关于以更高效的诱导方法制备更多量的多能干细胞的研究。
上述背景技术中所提供的事项仅意在帮助更好地理解本发明的背景。然而，不应该被解释为本发明落入了本领域技术人员已知晓的相关技术。
发明内容
技术问题
本发明人尝试寻找以高效率诱导出多能干细胞的方法，以用于开发在实践中具有高的安全性和生产效率的细胞治疗产品。结果，本发明人发现当将腔昆布(Eckloniacava)提取物(安全的天然提取物)加入到细胞培养基中时，能够使用间充质干细胞安全且高效地生产诱导性多能干细胞，从而完成了本发明。
就此而言，本发明的目的是提供用于使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞的培养基组合物，该培养基组合物含有腔昆布提取物。
本发明的另一目的是提供用于生产诱导性多能干细胞的方法，该方法包括在含有腔昆布提取物的培养基中，使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞。
本发明的又一目的是提供通过上述方法生产的诱导性多能干细胞。
本发明的又一目的是提供用于细胞治疗的组合物，该组合物包含诱导性多能干细胞。
通过本发明的以下详细描述、权利要求书和附图，可更清楚地理解本发明的其它目的和优势。
技术方案
根据本发明的实施方式，提供了用于使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞的培养基组合物，该培养基组合物含有腔昆布提取物。
本发明人尝试寻找高效地诱导出多能干细胞的方法，以用于开发在实践中具有高的安全性和生产效率的细胞治疗产品，而不会产生关于破坏胚胎的伦理问题。结果，本发明人发现当将腔昆布提取物(安全的天然提取物)加入到细胞培养培养基中时，能够以出乎预料的高效率生产诱导性多能干细胞。
腔昆布(作为包含在本发明的培养基组合物中的活性成分)是多年生褐色海藻，属于昆布目(Laminariales)巨藻科(Lessoniaceae)，主要存在于韩国Jeju-do和Ulleung-do的远洋、南部海岸，主要用于饲喂鲍鱼、海螺等，并且被用作制备海藻酸、碘或钾的主要原料，或者被用作食品。
本发明中使用的腔昆布提取物可使用水或有机溶剂进行提取，所述有机溶剂例如(a)无水或含水的具有1-4个碳原子的低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇等)；(b)低级醇与水的混合溶剂；(c)丙酮；(d)乙酸乙酯；(e)氯仿；(f)1,3-丁二醇；(g)己烷；(h)乙醚等，优选甲醇或乙醇与水的混合溶剂。在使用混合溶剂进行提取的情况中，优选以50v/v％-80v/v％的量包含甲醇或乙醇。
近来，将腔昆布提取物应用到皮肤组合物(例如化妆品)的情况增多(参见韩国专利申请公开Nos.2013-0017159、2012-0040488、2010-0097293等)。然而，不存在将腔昆布提取物开发成用于诱导出多能干细胞的培养基的情况。
本文所用的术语“胚胎干细胞”是指从囊胚(受精后的早期发育阶段)的内细胞团中分离和培养的具有多能性的细胞。本文所用的术语“多能干细胞”是指具有多能性的干细胞，该干细胞能够分化为构成机体的所有三种胚层，即，内胚层、中胚层和外胚层。
本文所用的术语“分化(differentiation)”是指在细胞生长期间通过分裂和增殖使细胞在结构或功能方面变得更特化的过程，即，活体的细胞、组织等在形状或功能方面发生改变以履行给定任务的过程。
本文所用的术语“细胞治疗产品”是用于以通过分离、培养和具体操作从人中制备的细胞和组织进行治疗、诊断和预防的药品，是指用于通过一系列动作(例如，通过体外增殖或选择同种异体细胞或异种细胞或者通过其它方式改变细胞的生物学性质)进行治疗、诊断和预防以恢复细胞或组织的功能的药品。根据细胞的分化程度，将细胞治疗产品大体上分为体细胞治疗产品和干细胞治疗产品。本发明特别涉及干细胞治疗产品。
本发明的间充质干细胞是分离自如下干细胞的细胞：来源于哺乳动物的胚胎干细胞或成体干细胞、优选脐带来源的间充质干细胞、更优选人脐带来源的间充质干细胞。干细胞可通过收集人体中的连接胎儿和胎盘的脐带来获得。来自脐带的间充质干细胞可使用多种方法进行收集。例如，含有单核细胞的溶液可通过以下方式获得：从人体中收集脐带，用DPBS洗涤所收集的脐带直到血液不再出现，用手术刀片切割经洗涤的脐带，并使其接受在37℃下进行的孵育。
本文所用的术语“培养基”是指用于细胞(例如干细胞等)的体外(invitro)培养或分化的混合物，培养基含有细胞生长和增殖所必需的元素，例如糖、氨基酸、各种营养素、血清、生长因子、矿物质等。
本领域中的多种培养基已市售，并且可人工生产待使用的培养基。市售的培养基可包括：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、Eagle基础培养基(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、DMEMF-12、α-最小必需培养基(α-MEM)、Glasgow最小必需培养基(G-MEM)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、AmnioMax完全培养基(Gibco，Newyork，USA)、AminoMaxII完全培养基(Gibco，Newyork，USA)、Chang’sMediumMesenCult-XF培养基(STEMCELLTechnologies，Vancouver，加拿大)等。可将这些培养基以及可人工生产的培养基用作本发明的培养基组合物中所包含的基础培养基。
可将通常添加的血清组分(例如胎牛血清(FBS))、抗生素(例如，青霉素、链霉素)等加入到基础培养基中。基础培养基中所含的血清组分或抗生素组分的浓度可在能够实现本发明的效果的范围内变化，并且可优选加入10％FBS、100单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素等。
另外，本发明的培养基可进一步含有营养成分混合物。营养成分混合物(包含常用于细胞培养中的多种氨基酸、维生素、矿物盐等的混合物)可通过将氨基酸、维生素、矿物盐等混合来制备，或者可使用商业化制备的营养成分混合物。商业化生产的营养成分混合物的实例可包括但不限于M199、MCDB110、MCDB202和MCDB302等。
另外，本发明的培养基可进一步含有用于诱导和稳定多能干细胞的能量水(energywater)。可优选以0.01v/v％-10v/v％的量、更优选以0.05v/v％-0.5v/v％的量含有能量水。
作为专门用于多能干细胞的诱导的培养基，本发明的培养基组合物可通过向基础培养基中加入腔昆布提取物而得到，并且相对于总的培养基组合物而言，可优选以1-1000μg/mL的浓度、更优选以100-400μg/mL的浓度包含腔昆布提取物。
根据本发明的另一方面，提供了用于生产诱导性多能干细胞的方法，该方法包括向细胞培养基中加入腔昆布提取物；以及在该培养基中使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞。
根据本发明的实施方式，与单独使用DMEMF-12培养基的情况不同，当使用本发明的含有腔昆布提取物的培养基组合物时，多能干细胞集落在第8-10天形成(图2-图5)。
根据本发明的另一方面，本发明提供了通过上述生产方法制备的诱导性多能干细胞。
本发明的诱导性多能干细胞具有与胚胎干细胞相同的分化能力，并具有与胚胎干细胞几乎相同的细胞形状。根据本发明的实施方式，依据对胚胎干细胞特异性的基因(Nanog、Oct4、Sox-2、Klf)和蛋白(SSEA4)的表达进行的研究，证实了所述基因和蛋白在由本发明诱导的多能干细胞中以与在胚胎干细胞中的方式相同的方式表达(图4)。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用于细胞治疗的组合物，该组合物含有通过上述方法生产的诱导性多能干细胞。
本发明的诱导性多能干细胞具有与胚胎干细胞相同的多能性。根据本发明的实施方式，证实了本发明的诱导性多能干细胞具有能够分化成内胚层、中胚层和外胚层的多能性(图5)。
因此，可将本发明的诱导性多能干细胞用作有效的细胞治疗产品。
可经由任何给予途径注射本发明的组合物，具体而言，通过注射经由腹膜内或胸内给予、皮下给予、静脉内或动脉内给予、肌内给予、局部给予等。
根据本发明，可将组合物根据一般方法以注射剂、混悬剂、乳剂等形式给予，并且如果必要，可将组合物悬浮于佐剂(例如，完全弗氏佐剂)中或者可将组合物与具有佐剂活性的物质(例如BCG)一起给予。组合物可是无菌的，或者组合物可包含助剂(例如，稳定剂、可湿性粉剂或乳化促进剂)、或用于渗透控制的盐或缓冲液剂、以及其它治疗上有用的物质。组合物可根据一般的混合方法、制粒方法或涂覆方法来生产。本发明所述的用于细胞治疗的组合物可含有药学上可接受的载体或添加剂，并且该组合物除活性成分外可包含稀释剂(例如，右旋糖、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸、乳糖、蔗糖、甘露糖醇)、粘结剂(例如，硅酸镁铝、淀粉糊、黄蓍胶、羧甲基纤维素钠)、崩解剂(例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、或沸腾混合物(boliingmixture)和/或吸附剂、甜味剂、矫味剂以及着色剂。
可将本发明所述的用于细胞治疗的组合物应用至关节炎、神经系统疾病、内分泌病、肝病等，并且根据针对人的临床测试结果，进一步可用作对于人而言的同种异体细胞治疗产品。
有益效果
本发明的特征和优势概括如下：
(i)本发明提供了含有腔昆布提取物的用于使诱导性多能干细胞去分化的培养基组合物。
(ii)另外，本发明提供了使用培养基组合物生产诱导性多能干细胞的方法。
(iii)使用本发明所述的培养基组合物使得能够使用间充质干细胞高效地生产诱导性多能干细胞，并且可将所生产的多能干细胞用作细胞治疗产品，因为该多能干细胞能够分化成多种细胞。
附图说明
图1为表明如下的视图：当将间充质干细胞在腔昆布提取物培养基中培养时，诱导出了与胚胎干细胞几乎相同的多能干细胞；
图2通过使用特异性蛋白质表达，证实了根据本发明的方法诱导出的多能干细胞为多能干细胞；
图3表明了根据本发明的方法，取决于腔昆布提取物浓度的诱导出的多能干细胞集落的形成；
图4表明了根据本发明的方法诱导出的多能干细胞的基因表达；以及
图5表明了根据本发明的方法诱导出的多能干细胞的体内分化能力的测试结果。
具体实施方式
下文，将参考实施例，对本发明进行详细描述。这些实施例仅意在具体描述本发明，并且对本领域技术人员而言显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围并不限于这些实施例。
实施例
实施例1：腔昆布提取物的制备
实验中使用的草药样品购自Jeju-do，并在经专家的准确鉴定后用于实验中。将100g干燥的草药样品放入1L的70％甲醇中，在回流下提取16小时，并使用滤纸进行过滤。在旋转蒸发器中将滤液在减压下浓缩，并立即冷冻干燥。
实施例2：从人脐带及其培养物中分离间充质干细胞
实施例2-1：收集人脐带
在分娩后立刻收集脐带组织。在将样品转移到实验室之前，将脐带组织彻底清洗，并立即转移到含有F-12培养基的500mL无菌玻璃瓶中，该F-12培养基中添加有运送培养基(50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素(购自Invitrogen))。在实验室中，干细胞的提取在无菌条件下于级别为100的流罩(flowhood)中进行。首先将样品转移到不锈钢灭菌容器。将脐带组织样品由PBS洗涤数次，将它们切成2cm长，并转移到直径为10cm的细胞培养皿中。此时，将样品进行另外的洗涤，用70％乙醇进行抗感染处理，并用加入有抗生素混合物(50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素(购自Invitrogen))的PBS洗涤多次，直到溶液干净。
实施例2-2：从人脐带及其培养物中分离干细胞
为了从脐带的血管和其它内部元件中分离华顿氏胶质(Wharton’sjelly)(脐带的基质)，首先将脐带切开。移出血管后，将分离的华顿氏胶质切成小块(0.5cm×0.5cm)以提取细胞。通过将脐带的华顿氏胶质的块放入的不同的组织培养皿(具有适合于提取上皮干细胞或间充质干细胞的细胞培养条件)中，进行组织培养(explant)。
为了分离/培养间充质干细胞，将经组织培养的组织浸入补充有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)的5mL的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)F-12(Gibco)、10％FBS、100单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素中，并于37℃下维持在CO2培养箱中。每三天或四天更换培养基。用光学显微镜监测细胞的生长。用胰蛋白酶(0.125％胰蛋白酶/0.05％EDTA)处理生长的细胞，以用于进一步扩增和冷冻存储(使用DMEM/10％FBS)。
每三天或四天更换培养基。用光学显微镜监测来自经组织培养的组织的细胞生长。
为了提取间充质干细胞，将细胞团在培养基DMEMF-12(Gibco)、10％FBS、100单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素中重悬并计数，并以1×106细胞/平皿的密度接种到直径为10cm的组织培养皿中。每三天或四天更换培养基。用光学显微镜监测细胞生长和集落形成。处于约90％汇合时，按如上所述将细胞进行传代培养。
实验实施例1：由间充质干细胞诱导出多能干细胞
实验实施例1-1：依赖于腔昆布提取物的浓度，由人源性间充质干细胞制备多能干细胞
在取决于Jeju的腔昆布提取物浓度而由人脐带来源的干细胞诱导出多能干细胞的实验中，对于对照组，将MSC的专用培养基DMEMF-12(Gibco)、10％FBS、100单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素用作基础培养基。对于实验组，使用经历过三次传代培养的人脐带来源的间充质干细胞，向培养基中加入浓度为1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL以及1000μg/mL的Jeju的腔昆布提取物以及0.1v/v％能量水(含有SiO2、Al2O3、TiO3、Fe2O3、CaO、Na2O、K2O和LiO的纯净去离子水，STCNaraCo.,Ltd)(图1)。分离人脐带来源的间充质干细胞，并将1×104的经洗涤的单核细胞接种到6孔板(皿)中，并维持在37℃和5％CO2下以进行培养。
关于根据本发明的方法诱导出的多能干细胞，使用针对如下蛋白的抗体通过免疫化学染色对胚胎干细胞特异性的蛋白OCT4、SOX2和阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)的表达进行分析。作为染色的过程，将细胞用4％多聚甲醛固定，用PBS洗涤，并用1％BSA溶液封闭。然后，用针对OCT4、SOX2和SSEA4的一抗进行处理，在4℃下反应18小时，并用PBS洗涤，然后用针对一抗的连接有荧光素(FITC)的二抗进行处理，并在室温下反应1小时。用PBS洗涤后，使用共聚焦显微镜对蛋白表达进行分析，并将结果示于图2中。BF表示明视场，第二幅图表示各蛋白表达的染色结果，第三幅图将前两幅图进行了组合(图2)。
结果，在实验组中，观察到仅当Jeju的腔昆布提取物的浓度为100-400μg/mL时，集落在10天后形成(图3)。此外，仅集落中的多能干细胞特异性标志物OCT4、SOX2和SSEA4被染色时，证实是多能干细胞。
实验实施例1-2：多能干细胞的基因比较分析
使用200μl移液管，将集落从实施例2-1中制备的多能干细胞中切下，同时通过显微镜观察多能干细胞，然后使用TRIzol试剂(由Invitrogen制造)分离总RNA。使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)合成cDNA，然后使用OCT4、Sox-2、Nanog、c-Myc以及对照基因(甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))的特异性引物进行PCR。Nanog、OCT4和Sox-2是胚胎干细胞中示出的特征基因，并且c-Myc为能够在胚胎干细胞和成体干细胞二者中显示出阳性的非特异性基因。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，将证实基因表达的结果示于图4中。根据图4，在未经历诱导过程的间充质干细胞中，OCT4(多能干细胞的特征基因)的表达较低，而在通过本发明的方法诱导的多能干细胞(STC2013-F002)中，特征基因的表达显著很高。比起未经历诱导过程的细胞，在经历了诱导过程的细胞(STC2013-F002)中，SOX2和Nanog(干细胞基因)以相似的水平表达，c-Myc(非特异性基因)以较低水平进行表达。
实验实施例2.由畸胎瘤测试证实多能干细胞
为了分析由本发明的方法诱导的多能干细胞在体内的分化能力，在培养后第5天，将未分化的多能干细胞集落(在支持细胞上培养)用胰蛋白酶-EDTA进行处理，并从中切出，然后放入胶原酶中，并在培养箱中保持30分钟。收集未分化的多能干细胞，并经由皮下注射向患有严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠给予1×106个细胞。在4周后，收获所形成的畸胎瘤，并用4％多聚甲醛固定，以进行经典的石蜡包埋。将组织切成10μm厚，并用苏木精和伊红进行染色。
根据图5，在注射由本发明的方法生产的诱导性多能干细胞的地方形成肉眼可见的畸胎瘤。具体而言，在组织学上证明了形成畸胎瘤，该畸胎瘤能够分化成来源于外胚层的神经组织(图5a)、来源于中胚层的肌肉组织(图5b)、以及来源于内胚层的胃组织(柱状上皮，图5c)等。由实验可证实，由本发明的方法诱导的细胞具有与体内的胚胎干细胞实质上相同的多能性，即，能够分化成外胚层、中胚层和内胚层的多能性。
以上对本发明的特定部分进行了详细描述。对于具有本领域普通知识的人员而言显而易见的是，这些具体描述仅为期望的实施方式，并且本发明的范围并不限于这些实施方式。因此，本发明的实质范围应被解释为由所附的权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种用于使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞的培养基组合物，所述培养基组合物含有腔昆布提取物。
2.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述腔昆布提取物包含在选自于由以下培养基所组成的组中的培养基中：DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、MEM(最小必需培养基)、BME(Eagle基础培养基)、RPMI1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM(α-最小必需培养基)、G-MEM(Glasgow最小必需培养基)、IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)、MacCoy’s5A培养基、AmnioMax完全培养基、AminoMaxII完全培养基、以及Chang’sMediumMesenCult-XF培养基。
3.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，相对于所述培养基组合物，以100-400μg/mL的量包含所述腔昆布提取物。
4.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物进一步包含0.01v/v％-10v/v％的能量水。
5.一种用于生产诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括：
向细胞培养培养基中加入腔昆布提取物；以及
在所述培养基中使间充质干细胞去分化成为诱导性多能干细胞。
6.通过权利要求5所述的方法制备的诱导性多能干细胞。
7.一种用于细胞治疗的组合物，所述组合物含有权利要求6所述的诱导性多能干细胞。
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