CN106661545A - 从脂肪来源间充质干细胞制备诱导多能干细胞的方法及利用该方法制备的诱导多能干细胞 - Google Patents

从脂肪来源间充质干细胞制备诱导多能干细胞的方法及利用该方法制备的诱导多能干细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含腔昆布(Ecklonia cava)提取物的诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cell)重编程用培养基组合物。并且，本发明涉及利用上述培养基组合物的诱导多能干细胞的制备方法。若利用本发明的培养基组合物，则可通过利用脂肪来源间充质干细胞来安全并简单地有效制备诱导多能干细胞，所制备的多能干细胞可分化成多种细胞，因此，可用作细胞治疗剂。

Description

从脂肪来源间充质干细胞制备诱导多能干细胞的方法及利用 该方法制备的诱导多能干细胞
技术领域
本发明涉及来源于人体脂肪的间充质干细胞的多能干细胞诱导培养基组合物及利用其来制备患者特异性诱导多能干细胞的方法。
背景技术
干细胞是从各个组织获得的被分化之前步骤的未分化细胞的总称。干细胞具有可在未分化状态下在规定期间内持续制造出与自身相同的细胞的性质以及在适当的条件下可分化成构成生物组织的各种细胞的性质。
根据分化能力和生成时期，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(adult stem cell)。其他分类基于干细胞的分化能力，上述干细胞可分为多能(pluripotency)干细胞、多分化能(multipotency)干细胞及单分化能(unipotency)干细胞。
成体干细胞可分为多分化能或单分化能干细胞。具有代表性的成体干细胞为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)。间充质干细胞分化成软骨细胞(chondrocyte)、成骨细胞(osteoblast)、脂肪细胞(adipocyte)、肌肉细胞(myocyte)、神经细胞(neuron)，造血干细胞分化成红细胞、白细胞、血小板等主要血液内的血细胞。
相反，多能干细胞均可被分化成构成生物体的三种胚层(germ layer)，由此，多能干细胞是指具有均可分化成人体的所有细胞或脏器组织的多功能性的干细胞，通常，多功能干细胞为胚胎细胞。人类胚胎干细胞来源于可变为人类生命体的胚胎，因此存在多种伦理问题，但是，与成体干细胞相比，人类胚胎干细胞具有优秀的细胞增殖及分化能力。成体干细胞可从骨髓、血液、大脑、皮肤等获得，因此存在很少的伦理问题，但是，与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有限定的分化能力。
为了解决上述问题，进行了用于通过使来源于成体的细胞重编程来制备与胚胎细胞类似的特异性多功能细胞的多种方法。作为代表性方法，具有细胞融合法(fusion withES cell)、体细胞核移植法(somatic cell nuclear transfer)、特定因子注入法(reprogramming by gene factor)等。细胞融合法因诱导的细胞还具有两对基因，由此在细胞的稳定性方面存在问题，体细胞核移植法存在需要大量卵子且效率极低的问题。而且，特定因子注入法是为了通过插入特定基因来诱导重编程而利用包含致癌基因的病毒的方法，上述方法存在高的致癌危险，且因低效率和方法方面上的难度，而在细胞治疗剂开发可能性方面存在问题。
为了成功且大量获得多能干细胞，在培养分离的来源于脐带的单核细胞的步骤中的培养组合物极为重要，且需要进行通过高效率的诱导方法，以更多的量制备多能干细胞的研究。
另一方面，曾有过将腔昆布使用于治疗或预防过敏性疾病的组合物(韩国公开专利第2009-0043115号)或者氧化染色用染毛剂组合物(韩国公开专利第2012-0126148号)的情况，但尚未以用于将脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stemcell)重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotency stem cell)的用途来使用。
通过上述背景技术说明的事项仅是为了进一步理解本发明的背景，上述背景技术相当于本发明所属技术领域的普通技术人员所知道的现有技术。
发明内容
技术问题
本发明人员为了安全性和生产效率高的细胞治疗剂开发的实用化，而寻找以高效率诱导多能干细胞的方法。结果，在向细胞培养基添加作为安全的天然提取物的腔昆布提取物的情况下，确认了可利用脂肪来源间充质干细胞安全且高效地制备诱导多能干细胞，由此完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供用于将包含腔昆布提取物的脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基组合物。
本发明的再一目的在于，提供包括在包含腔昆布提取物的培养基中，将脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤的诱导多能干细胞的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供通过上述诱导多能干细胞的制备方法来制备的诱导多能干细胞。
本发明的还有一目的在于，提供包含从患者的脂肪分离干细胞并通过上述诱导多能干细胞的制备方法来制备的诱导多能干细胞的患者特异性细胞治疗用组合物。
通过下述的具体实施方式、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供用于将包含腔昆布(Ecklo nia cava)提取物的脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞培养基组合物。
本发明人努力寻找在没有破坏胚胎的伦理问题并不使用病毒的情况下，以高效率诱导用于在形成癌细胞方面没有危险的安全性和生产效率高的细胞治疗剂开发的实用化的多能干细胞的方法。结果，向细胞培养基添加作为安全的天然提取物的腔昆布提取物的情况下，确认了可高效制备诱导多能干细胞。
作为有效成分包含在本发明的培养基组合物的腔昆布(甘苔)为主要在南海岸、济州岛海岸一代及郁陵岛海岸一代栖息的褐藻植物昆布目昆布科的多年生海藻类，主要为鲍鱼和海螺等的食物，且为制备褐藻酸或碘化钾的主要原料或用于食用。
本发明所包含的腔昆布提取物可利用水、(a)碳数1～4的无水或含水低级乙醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇及正丁醇等)、(b)上述低级乙醇和水的混合溶剂、(c)丙酮、(d)乙酸乙酯、(e)氯仿、(f)1，3-丁二醇、(g)己烷、(h)二乙醚等的有机溶剂来提取，优选地，可利用甲醇或乙醇和水和混合溶剂或者利用它们中的各个来提取。在利用混合溶剂提取腔昆布提取物的情况下，优选地，甲醇或乙醇的含量为50～80v/v％。
目前，用于将上述腔昆布提取物适用于化妆品等皮肤组合物的事例子在增加(参照韩国公开专利第2013-0017159号、第2012-0040488号、第2010-0097293号)，但尚未有过将上述腔昆布提取物开发成多能干细胞诱导用培养的事例。
本发明所使用的术语“胚胎干细胞”作为从受精后繁殖初期的胚泡(blastocyst)的内细胞团(inner cell mass)分离并培养的细胞，是指具有多能性的细胞。本发明所使用的术语“多能干细胞”为具有可分化成构成生物体的三种胚层，即，内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)、外胚层(ectoderm)的多能性的干细胞。
本发明所使用的术语“分化(differentiation)”是指在细胞分裂增殖并成长的期间，结构或功能相互特殊化的现象，即，生物的细胞、组织等为了执行各自所负责的任务而发生形态或功能变化。
本发明所使用的术语“细胞治疗剂”为通过从人分离、培养及特殊操作制备的细胞及组织，细胞治疗剂作为用于治疗、诊断及预防的医药品，为了使细胞或组织的功能恢复，在体外增殖或筛选同种或异种细胞，或者用于通过以其他方法改变细胞的生物学特性等一系列的行为来进行治疗、诊断及预防的医药品。根据细胞的分化程度，细胞治疗剂大体分为体细胞治疗剂、干细胞治疗剂，尤其，本发明涉及干细胞治疗剂。
本发明的“间充质干细胞”为从来源于哺乳动物的胚胎干细胞或成体干细胞分离的细胞，优选地，间充质干细胞为脂肪来源间充质干细胞，更加优选地，间充质干细胞为来源于人体的脂肪的间充质干细胞。上述脂肪来源干细胞可从人体的脂肪组织提取。可通过多种方式从脂肪提取间充质干细胞，例如，为了从脂肪组织分离单核细胞而从人体提取脂肪组织并通过杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline，DPBS)冲洗脂肪组织至不再出血，且以手术用刀片铰碎洗完的脐带，在37℃的温度下，进行孵化(incubation)，从而可获得包含单核细胞的溶液。
本发明所使用的术语“培养基”是指在包含糖、氨基酸和各种营养物、血清、生长因子、无机物等的细胞的成长及增殖等所需要的要素的体外(in vitro)，用于干细胞等的细胞的培养或分化的混合物。
尤其，本发明的培养基为用于培养间充质干细胞的培养基。此时，间充质干细胞为从来源于哺乳动物的胚胎干细胞或成体干细胞分离的细胞，上述间充质干细胞为具有可无限定地增殖的能力及可分化成多种细胞形态(例如，脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞、骨细胞等)的细胞。并且，在本发明中，使用具有对CD44、CD73、CD90的抗体产生阳性反应且对CD34、CD45的抗体产生阴性反应的免疫表型的多分化能间充质干细胞。
在本发明所属技术领域中销售多种培养基，也可人工制备培养基来使用。作为一例，正在销售的培养基具有达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium)、最小必需培养基(MEM，Minimal Essential Medium)、伊格尔基本培养基(BME，Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F-10，F-12、达尔伯克改良伊格尔培养基-F12(DMEM-F12)、α-最小必需培养基(α-MEM，α-Minimal Essential Medium)、G-最小必需培养基(G-MEM，Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMPM(IMDM，Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)、AmnioMax、新型二代羊水培养基(AminoMaxⅡcomplete Medium，Gibco，Newyork，USA)、Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基(STEMCELL Technologies，Vancouver，Canada)等，间充质干细胞无血清培养基等，能够与可人工制备的培养基一同使用包含在本发明的培养基组合物中的基本培养基。
可向上述基本培养基添加通常添加的血清成分(例如，胎牛血清(FBS，FetalBovine Serum))及抗生剂(例如，青霉素、链霉素)等。向上述基本培养基添加的血清成分或抗生剂成分的浓度可在实现本发明的效果的范围内改变，优选地，可添加10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素等。
并且，本发明的培养基还可包含营养混合物(Nutrient Mixture)。上述营养混合物为包含通常用于细胞培养的各种氨基酸、维生素、无机盐等的混合物，混合上述氨基酸、维生素、无机盐等来制备营养混合物，或者可使用商业性制备的营养混合物。商业性制备的营养混合物可举M199、MCDB110、MCDB202、MCDB302等，但并不局限于此。
并且，本发明的培养基为了多能干细胞的诱导和稳定化而还可包含能量水。优选地，还包含0.01至10v/v％的上述能量水，更加优选地，还包含0.05至0.5v/v％的能量水。
本发明的培养基组合物为对多能干细胞诱导特异性培养基，可通过向上述基本培养基添加腔昆布提取物来形成培养基混合物，优选地，以总培养基组合物为基准，能够以1至1000μg/ml的浓度包含腔昆布提取物，更加优选地，以10至400μg/ml的浓度包含腔昆布提取物。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供诱导多能干细胞的制备方法，包括：向细胞培养基添加腔昆布提取物的步骤；以及在上述培养基中，将脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤。
根据本发明的一实施例，作为实验组，利用包含本发明的腔昆布提取物培养基组合物(在达尔伯克改良伊格尔培养基-F12包含有腔昆布提取物及能量水的培养基)，作为对照组，仅利用达尔伯克改良伊格尔培养基-F12，与这些情况不同地，第8～10天可确认到形成了多能干细胞集落(图2及图3).
本发明的另一实施方式，本发明提供通过上述诱导多能干细胞的制备方法来制备的诱导多能干细胞。
本发明的诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞相同的分化能力，而且，诱导多能干细胞的细胞模样也几乎与胚胎干细胞相同(图2及图3)。根据本发明的一实施例，调查在胚胎干细胞中是否存在特异性基因(Oct4、Sox)及蛋白质(阶段特异性胚胎表面抗原-4(SSEA-4))的表达的结果，在通过本发明诱导的多能干细胞中，与胚胎干细胞相同，确认了上述基因及蛋白质的表达(图4及图5)。
根据另一实施例，在未经过诱导过程的间充质干细胞中，作为多能干细胞的特异性基因的OCT4、SOX2和Nanog的表达度低，相反，在通过本发明的方法诱导的多能干细胞(实验列1-1：EtOH EPN，实验列1-2：Sonic EPN)中，这些特异性基因的表达度明显高(图6及图7)。
根据还有一实施方式，本发明提供包含通过上述诱导多能干细胞的制备方法来制备的诱导多能干细胞的细胞治疗用组合物。
本发明的组合物可通过任意的给药路径，具体地，可通过腹腔或胸腔给药、皮下给药、静脉或动脉血管内给药、肌肉内给药、基于注射的局部给药等的方法给药。
在本发明中，上述组合物可基于通常的方法，以注射剂、悬浮剂、乳化剂等的形式给药，根据需要，上述组合物悬浮在弗氏完全佐剂等的佐剂，或者与具有如BCG的佐剂活性的物质一同给药。上述组合物可被灭菌，或者可包含稳定剂、可湿性粉剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐或缓冲剂等的佐剂及其他治疗性有效物质。
本发明的细胞治疗用组合物可适用于关节炎、神经系统疾病、内分泌疾病、肝病等，之后，根据对于人的临床实验结果，也可用作对于人的同种细胞治疗剂。
发明的效果
概述本发明的特征及优点如下。
(i)本发明提供包含腔昆布提取物的诱导多能干细胞重编程用培养基组合物。
(ii)并且，本发明提供利用上述培养基组合物的诱导多能干细胞的制备方法。
(iii)若利用本发明的培养基组合物，则可通过利用脂肪来源间充质干细胞来有效制备诱导多能干细胞，所制备的多能干细胞可分化成多种细胞，因此，可用作细胞治疗剂。
(iv)在本发明中，制备具有与胚胎干细胞相同的分化能力的多能干细胞，从而不使用胚胎干细胞，因此消除因胚胎的破坏而产生的伦理问题，并且不使用可致癌的病毒，因而可制备在形成癌细胞方面没有危险的安全的多能干细胞。
(v)进而，使用天然提取物，因此相比于以往的方法，可非常容易并以明显高的效率来制备多能干细胞，利用从患者的脂肪细胞分离的间充质干细胞，因而期待可提前实现患者特异性干细胞治疗剂的实用化。本发明被认为在治疗神经系统疾病、免疫疾病等多种疑难病疾病的方面，将会作出巨大奉献。
附图说明
图1为示出在脂肪来源间充质干细胞中通过注入腔昆布提取物培养基来培养时，几乎与胚胎干细胞相同的多能干细胞被诱导的图。
图2示出通过本发明的方法(实验例1-1)形成根据腔昆布提取物(乙醇提取物)的浓度诱导的多能干细胞集落。
图3示出通过本发明的方法(实验例1-2)形成根据腔昆布提取物(水提取物)的浓度诱导的多能干细胞集落。
图4为利用特异性蛋白质的表达来将通过本发明的方法(实验例1-1)诱导的多能干细胞确认为多能干细胞的图。
图5为利用特异性蛋白质的表达来将通过本发明的方法(实验例1-2)诱导的多能干细胞确认为多能干细胞的图。
图6示出通过本发明的方法(实验例1-1)诱导的多能干细胞的基因表达并通过曲线图来图示。
图7示出通过本发明的方法(实验例1-2)诱导的多能干细胞的基因表达并通过曲线图来图示。
具体实施方式
以下，通过实施例，更加详细说明本发明。上述实施例仅用于更加详细说明本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员知道，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于上述实施例。
实施例
实施例1：腔昆布提取物的制备
实施例1-1：利用乙醇溶剂的腔昆布提取物的制备
实验中使用的生药试样从济州岛购买并经过专家的准确鉴定之后用于实验。将100g的干燥的生药试样放入1l的70％乙醇中并对乙醇进行回流提取16小时，并利用过滤纸进行了过滤。在旋转式汽化器中，对滤液进行浓缩，并即时进行冷冻干燥。
实施例1-2：利用水的腔昆布提取物的制备
实验中使用的生药试样从济州岛购买并经过专家的准确鉴定之后用于实验。将100g的干燥的生药试样放入1l的水中并利用超声波提取仪提取16小时，并利用过滤纸进行了过滤。在旋转式汽化器中，对滤液进行浓缩，并即时进行冷冻干燥。
实施例2：从人体脂肪组织分离间充质干细胞及培养
实施例2-1：人体脂肪组织的提取
在吸入脂肪之后直接收集脂肪组织。向实验室移动试样之前，在500ml的灭菌玻璃瓶中收集已吸入的脂肪组织。之后，密封灭菌玻璃瓶后向实验室移动。在实验室，在灭菌状态下，在class100的流罩中提取间充质干细胞。首先，向灭菌不锈钢容器移动试样。利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)数次清洗之后，脂肪组织试样被截断成2cm的长度并向50ml的试管移动，在这里，进一步清洗及通过70％的乙醇进行抗感染处理，通过添加抗生剂混合物(50IU/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素(从Invitrogen购买))的磷酸缓冲盐溶液清洗数次上述溶液，直到上述溶液变干净。
实施例2-2：从人体脂肪组织分离间充质干细胞及培养
利用磷酸缓冲盐溶液清洗已分离的脂肪组织后切细组织，利用添加有collagenase type1(1mg/ml)的达尔伯克改良伊格尔培养基在37℃的温度下每隔10分钟摇动一次并进行截断(digestion)1小时。然后，利用磷酸缓冲盐溶液清洗后在1000rpm下离心分离5分钟。抽吸(suc tion)上层液，利用磷酸缓冲盐溶液清洗剩在底面上的颗粒后，在1000rpm下离心分离5分钟。利用网孔大小为100μm目(mesh)的过滤器进行过滤来去除残渣(debris)后，利用磷酸缓冲盐溶液清洗。
为了进行间充质细胞的分离/培养，将上述移植的组织浸渍于添加10％的胎牛血清(FBS，Hyclone)的5ml的达尔伯克改良伊格尔培养基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素，由此在95％的氮和5％的二氧化碳细胞培养基中维持37℃的温度，来维持低氧血症(Hypoxic)状态，以使除了干细胞以外的细胞致死，从而提高间充质干细胞的纯度。每3日或4日更换上述培养基。通过光学显微镜监视源自移植的组织的细胞的成长(outgrowth)。为了追加的扩张及冷冻保管(利用达尔伯克改良伊格尔培养基/10％的胎牛血清)成长的细胞而对成长的细胞进行了胰蛋白酶处理(0.125％的胰蛋白酶/0.05％的乙二胺四乙酸(EDTA))
为了间充质干细胞的提取，细胞的颗粒再次悬浮及计数在达尔伯克改良伊格尔培养基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素，并按1×106细胞/皿的密度接种在10cm的组织培养皿。每3日或4日更换上述培养基。通过光学显微镜监视源自移植的组织的细胞的成长及克隆形成。如上所述，约为90％的细胞数(confluence)的细胞被亚培养(sub-culture)。
实验例1：从脂肪来源间充质干细胞诱导多能干细胞
实验例1-1：制备基于实施例1-1的腔昆布提取物浓度的来源于人体脂肪的间充质干细胞的多能干细胞
作为用于根据济州腔昆布提取物的浓度从来源于人体脂肪的干细胞诱导多能干细胞的实验，在对照组中将达尔伯克改良伊格尔培养基F-12(Gibco)、10％的胎牛血清、100unit/ml的青霉素、50μg/ml的链霉素作为间充质干细胞的基本培养基来使用，在实验组中使用进行了三次继代培养的来源于人体脂肪的间充质干细胞并向培养基添加了标准(Normal)、1μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1mg/ml浓度的在实施例1-1中制备的济州腔昆布提取物和0.1v/v％的能量水(含有SiO2、Al2O3、TiO3、Fe2O3、CaO、Na2O、K2O、LiO的纯化脱离子水，STCnara)(图1)。在6孔板(dish)接种1×104个分离来源于人体脂肪的间充质干细胞并清洗的单核细胞，并以维持37℃的温度和5％的CO2的方式培养了上述单核细胞。
结果，在实验组中，仅当济州腔昆布提取物的浓度为100至400μg/ml时，才能在10日之后，观察到形成集落(图2)。此时，显微镜的放大倍数为200倍。
实验例1-2：制备基于实施例1-2的腔昆布提取物浓度的来源于人体脂肪的间充质干细胞的多能干细胞
以与实验例1-1相同的方法来实验，但使用了在实施例1-2中制备的济州腔昆布提取物。结果，在实验组中，仅当济州腔昆布提取物的浓度为20至50μg/ml时，才能在10日之后，观察到形成集落(图3)。此时，显微镜的放大倍数为200倍。
实验例1-3：通过本发明的方法诱导的多能干细胞的免疫化学染色分析
对于通过上述实验例1及2的方法诱导的多能干细胞，使用与作为胚胎干细胞的特异性基因的OCT4、SOX2和作为蛋白质的阶段特异性胚胎表面抗原-4(stage-specificembryonic antigen-4)的表达与否有关的抗体并使用免疫化学染色法来分析蛋白质的表达与否。
首先，在染色过程中，利用4％的多聚甲醛(Paraformaldehyde)固定细胞之后，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，并以1％的牛血清白蛋白(BSA)溶液进行了阻塞(blocking)。处理对于OCT4、SOX2、阶段特异性胚胎表面抗原-4的第一个抗体并在4℃的温度下，反应18小时之后，利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，且处理对于第一个抗体的附着有异硫氰酸荧光素(FITC，fluorescein isothiocyanate)的第二个抗体并在室温条件下反应了的1小时。
在利用磷酸缓冲盐溶液进行清洗之后，使用荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)分析了表达与否，在图4及图5中示出其结果。BF意味着明视场(brightfield)，第二张图意味着对于各个蛋白质表达的染色结果，在第三张图中，利用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色来表示细胞的核。
结果，利用乙醇提取的腔昆布提取物(实验例1-1)和利用水提取的腔昆布提取物(实验例1-2)均仅在作为多能干细胞特异性标记的OCT4、SOX2、阶段特异性胚胎表面抗原-4的集落中产生阳性反应，从而确认到多能干细胞(图4及图5)。
实验例1-4：多能干细胞基因分析比较
在显微镜下，使用200μl的吸液管仅摘除在上述实验例1-1和1-2中制备的多能干细胞中的集落后，使用TRIzol试剂(Invitrogen公司制备)分离整个RNA。利用逆转录-聚合酶链反应((RT-PCR)合成互补DNA(cDNA)后，利用对OCT4、Sox-2、Nanog及作为对照基因的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)基因具有特异性的引物进行聚合酶链反应。Nanog、OCT4、Sox-2为从胚胎干细胞所看到的特异性基因。利用琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链反应产物，确认这些基因的表达的结果在图6和图7中示出。
结果，根据图6和图7，在未经过诱导过程的间充质干细胞(对照组，间充质干细胞)中，作为多能干细胞的特异性基因的OCT4、SOX2和Nanog的表达度低，相反，在通过本发明的方法诱导的多能干细胞(通过实验例1-1(由EtOH EPN表示)及实验例1-2(由Sonic EPN表示)来制备的多能干细胞中，这些特异性基因的表达度明显高。可通过图6及图7的曲线图来明确地确认作为干细胞基因的OCT4、SOX2和Nanog的表达程度。
以上，详细记述了本发明的特定部分，但要明确，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这些具体的记述仅为优选实例，本发明的范围并不限定于此。因此，本发明的实质性范围应根据所附的发明要求保护范围和与该发明要求保护范围等同的内容而定。

Claims (9)

1.一种培养基组合物，其特征在于，用于将包含腔昆布提取物的脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，上述腔昆布提取物包含在选自由达尔伯克改良伊格尔培养基、最小必需培养基、伊格尔基本培养基、RPMI 1640、F-10、F-12、达尔伯克改良伊格尔培养基-F12、α-最小必需培养基、G-最小必需培养基、依斯考夫改良达尔伯克培养基、MacCoy’s 5A培养基、AmnioMax、新型二代羊水培养基及Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基组成的组中的培养基。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，以培养基组合物为基准，包含10至400μg/ml的上述腔昆布提取物。
4.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，利用乙醇溶剂提取上述腔昆布提取物，以培养基组合物为基准，包含100至400μg/ml的上述腔昆布提取物。
5.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，利用水提取上述腔昆布提取物，以培养基组合物为基准，包含20至50μg/ml的上述腔昆布提取物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的培养基组合物，其特征在于，上述培养基组合物还包含0.01至10v/v％的能量水。
7.一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括：
向细胞培养基添加腔昆布提取物的步骤；以及
在上述培养基中，将脂肪来源间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的步骤。
8.一种诱导多能干细胞，其特征在于，通过权利要求7所述的诱导多能干细胞的制备方法来制备。
9.一种细胞治疗用组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的诱导多能干细胞。
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