JP2017518772A - 脂肪由来間葉系幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造する方法およびその方法により製造された誘導多能性幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(ii)また、本発明は、前記培地組成物を用いた誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
(iii)本発明に係る培地組成物を使用すると、脂肪由来間葉系幹細胞を用いて、誘導多能性幹細胞を効率的に製造することができ、製造された多能性幹細胞は、様々な細胞への分化が可能なので、細胞治療剤として有用に使用することができる。
(iv)本発明は、胚性幹細胞と同じ分化能を有する多能性幹細胞を製造することにより、胚性幹細胞を使用しないため、胚の破壊による倫理的問題をなくし、癌を誘発しうるウイルスを使用しないため、癌細胞形成の危険がない安全な多能性幹細胞を製造することができる。
(v)さらに、天然抽出物を使用するため、従来の方法に比べて非常に容易に、顕著に高い効率で多能性幹細胞を製造することができ、患者の脂肪細胞に分離した間葉系幹細胞を用いるので、患者カスタマイズ型幹細胞治療剤の実用化を早めることができると期待される。本発明は、神経系疾患、免疫疾患などの様々な難病疾患を治療するのに大きく寄与するものと考えられる。
実施例1−1:エタノール溶媒を用いたカジメ抽出物の製造
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を受けた後、実験に使用した。乾燥された生薬試料100gを70%メタノール1Lに入れ、エタノールは16時間還流抽出し、ろ過紙を使用してろ過した。ろ液を回転減圧蒸発器で濃縮させて直ちに凍結乾燥した。
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を受けた後、実験に使用した。乾燥された生薬試料100gを水1Lに入れて、水は16時間超音波抽出器を適用して抽出し、ろ紙を使用してろ過した。ろ液を回転減圧蒸発器で濃縮させて直ちに凍結乾燥した。
実施例2−1:人体脂肪組織の採取
脂肪組織は、脂肪吸引した後、 直ちに収集される。試料は、実験室に移動される前に、500mlの滅菌ガラス瓶に吸引された脂肪組織を集める。その後、殺菌ガラス瓶を密封した後、実験室に移される。実験室では、滅菌状態の下でclass 100のフローフードで間葉系幹細胞の抽出が行われる。試料は、まず滅菌ステンレス鋼の容器に移される。PBSは、数回洗浄した後、脂肪組織試料は、その後2cmの長さに切って50mlチューブに移され、ここで、さらなる洗浄および70%エタノールで抗感染処理して、抗生剤混合物(50IU/mlのペニシリン、50ug/mlのストレプトマイシン(Invitrogenから購入))が添加されたPBSで前記溶液がきれいになるまで数回洗浄する。
分離された脂肪組織をPBSで洗浄した後、組織を切り刻み、collagenase type1(1mg/ml)を添加したDMEM培地を用いて37℃で10分に1回振り混ぜながら1時間切断(digestion)した。次に、PBSで洗浄した後、1000rpmで5分間遠心分離した。上澄み液は吸引(suction)し、底に残ったペレットはPBSで洗浄した後、1000rpmで5分間遠心分離した。100μmメッシュ(mesh)サイズのフィラーでフィルタリングして残骸(debris)を除去した後、PBSで洗浄した。
実験例1−1:実施例1−1のカジメ抽出物濃度によるヒト脂肪由来間葉系幹細胞の多能性幹細胞の製造
済州カジメ抽出物の濃度により、ヒト脂肪由来幹細胞から多能性幹細胞を誘導するための実験で、対照群は、MSCの専用培地でDMEM F−12(Gibco)、10%FBS、100unit/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを基本培地として使用し、実験群は、継代培養を三回目したヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いて培地に実施例1−1で製造した済州カジメ抽出物をNormal、1μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1mg/mlの濃度とエネルギーウォーター(SiO2、Al2O3、TiO3、Fe2O3、CaO、Na2O、K2O、LiOを含有する精製脱イオン水、エスティーシーナラ)0.1v/v%を添加した(図1)。ヒト脂肪由来の間葉系幹細胞を分離して洗浄された単核球細胞を6ウェルプレート(dish)に1×104個の細胞を接種して、37℃、5%CO2を維持して培養した。
実験例1−1と同様の方法で実験するが、済州カジメ抽出物を実施例1−2で製造したものを用いた。その結果、実験群では、済州カジメ抽出物の濃度が20〜50μg/mlの場合にのみ、10日後にコロニーが形成されることが観察され(図3)、このとき顕微鏡倍率は200倍の割合で観察したものである。
前記実験例1および2の方法によって誘導された多能性幹細胞に対して胚性幹細胞の特異遺伝子であるOCT4、SOX2、蛋白質であるSSEA−4(stage−specific embryonic antigen−4)が発現するかどうかを、これに対する抗体を用いて、免疫化学的染色法を用いて蛋白質が発現するかどうかを分析した。
前記実験例1−1と1−2で製造された多能性幹細胞を顕微鏡で見ながら、200μlピペットを使用してコロニーのみを取り出した後、TRIzol試薬(Invitrogen社製)を使用して全体RNAを分離した。逆転写−重合酵素連鎖反応(RT−PCR)を用いてcDNAを合成した後、OCT4、Sox−2、Nanog、および対照遺伝子であるGAPDH(glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを行った。Nanog、OCT4、Sox−2は、胚性幹細胞で見られる特徴的遺伝子である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析して、これらの遺伝子の発現を確認した結果を図6および7に示した。
Claims (9)
- カジメ(Ecklonia cava)抽出物を含む、脂肪由来間葉系幹細胞(adipose−derived mesenchymal stem cell)を誘導多能性幹細胞(induced pluripotency stem cell)に逆分化するための培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、F−10、F−12、DMEM−F12、α−MEM (α−Minimal Essential Medium)、G−MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、MacCoy's 5A培地、AmnioMax、AminoMaxiicomplete MediumおよびChang's Medium MesemCult−XF Mediumから構成された群から選択される培地に含まれることを特徴とする、請求項1に記載の培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、培地組成物基準10〜400μg/ml含まれることを特徴とする、請求項1に記載の培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、エタノール溶媒で抽出したもので培地組成物基準100〜400μg/ml含まれることを特徴とする、請求項1に記載の培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、水で抽出したもので培地組成物基準20〜50μg/ml含まれることを特徴とする、請求項1に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、エネルギーウォーター0.01〜10v/v%をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の培地組成物。
- カジメ(Ecklonia cava)抽出物を細胞培養培地に添加するステップ;および前記培地で脂肪由来間葉系幹細胞(adipose−derived mesenchymal stem cell)を誘導多能性幹細胞(induced pluripotency stem cell)に逆分化させるステップを含む誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 請求項7の製造方法で製造された誘導多能性幹細胞。
- 請求項8の誘導多能性幹細胞を含む細胞治療用組成物。
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