ES2790669T3 - Método para la producción de célula madre pluripotente inducida a partir de célula madre mesenquimatosa y célula madre pluripotente inducida producida mediante el método - Google Patents

Método para la producción de célula madre pluripotente inducida a partir de célula madre mesenquimatosa y célula madre pluripotente inducida producida mediante el método Download PDF

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Abstract

Método para la producción de una célula madre pluripotente inducida, comprendiendo el método: añadir un extracto de Ecklonia cava a un medio de cultivo celular; y desdiferenciar una célula madre mesenquimatosa en una célula madre pluripotente inducida en el medio.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la producción de célula madre pluripotente inducida a partir de célula madre mesenquimatosa y célula madre pluripotente inducida producida mediante el método
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para la producción de células madre pluripotentes inducidas.
Antecedentes
Las células madre son un término genérico para células no diferenciadas antes de las etapas diferenciadas, que pueden obtenerse de diversos tejidos. Las células madre tienen propiedades que pueden producir de manera continua células idénticas a ellas mismas durante un determinado periodo de tiempo en un estado no diferenciado, y propiedades que pueden diferenciarse en diversas células que constituyen tejidos biológicos, en condiciones apropiadas.
Las células madre pueden clasificarse en general como células madre embrionarias y células madre adultas, de acuerdo con el potencial de diferenciación y la fase de generación. Como otra clasificación de acuerdo con el potencial de diferenciación de células madre, las células madre pueden dividirse en células madre pluripotentes, multipotentes y unipotentes.
Las células madre adultas pueden clasificarse como células madre multipotentes o unipotentes. Como células madre adultas representativas, existen células madre mesenquimatosas (MSC) y células madre hematopoyéticas (HSC). Se sabe que las células madre mesenquimatosas se diferencian en condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos y neuronas, y que las células madre hematopoyéticas se diferencian principalmente en células sanguíneas, tal como eritrocitos, leucocitos o plaquetas.
Entretanto, las células madre pluripotentes se refieren a células madre con multipotencia que pueden diferenciarse en las tres capas germinales que constituyen el organismo, pudiéndose diferenciar de ese modo en cualquier célula o tejido de órgano de organismos humanos. Generalmente, las células madre embrionarias corresponden a esto. Las células madre embrionarias humanas plantean muchos asuntos éticos, ya que se crean a partir de embriones que pueden desarrollarse en seres humanos. Sin embargo, las células madre embrionarias se conocen por tener una excelente proliferación celular y potencia de diferenciación, en comparación con células madre adultas. Las células madre adultas provocan menos cuestiones éticas, ya que pueden obtenerse de la médula ósea, sangre, cerebro, piel y similares. Sin embargo, las células madre adultas tienen una potencia de diferenciación limitada, en comparación con las células madre embrionarias.
Como solución para superar estos problemas, se han intentado diversas técnicas para producir células madre pluripotentes adaptadas de manera similar a las células madre embrionarias mediante desdiferenciación de células derivadas de células madre adultas. Las técnicas representativas incluyen fusión con célula ES, transferencia nuclear de células somáticas, reprogramación mediante factor génico y similares. De acuerdo con la fusión con célula ES, las células inducidas tienen dos pares de genes adicionales y esto provoca un problema en términos de estabilidad de células. La transferencia nuclear de células somáticas requiere un gran número de óvulos y tiene muy baja eficacia, que son desventajas. La reprogramación mediante factor génico es una técnica de uso de virus que incluye oncogenes mediante inserción de genes específicos para inducir la desdiferenciación y esta técnica tiene un alto riesgo de incidencia de cáncer y es desventajosa en la posibilidad de desarrollo de productos de terapia celular debido a la baja eficacia y dificultad en términos de métodos.
Con el fin de obtener células madre pluripotentes de manera satisfactoria y abundante, son muy importantes las composiciones de medio en la fase de cultivo de células mononucleares derivadas de cordón umbilical aisladas. Por tanto, existe una demanda de estudios para preparar células madre pluripotentes con una cantidad mucho mayor y en un método de inducción de mayor eficacia.
Las cuestiones proporcionadas en la técnica anterior solo pretenden ayudar a un mejor entendimiento de los antecedentes de la presente invención. No debería interpretarse, sin embargo, que la presente invención entra en la técnica relacionada ya conocida por un experto en la materia.
Divulgación
Problema técnico
Los presentes inventores intentaron buscar un método para inducir células madre pluripotentes con alta eficacia para desarrollar productos de terapia celular con alta seguridad y eficacia de producción en la práctica. Como resultado, los presentes inventores encontraron que cuando se añaden extractos de Ecklonia cava, extractos naturales seguros, a medios de cultivo celular, pueden producirse células madre pluripotentes inducidas de manera segura y altamente eficaz, usando células madre mesenquimatosas y completaron por tanto la presente invención.
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir una célula madre pluripotente inducida, que incluye la desdiferenciación de una célula madre mesenquimatosa en una célula madre pluripotente inducida en un medio que comprende un extracto de Ecklonia cava.
Otros objectos y ventajas de la presente invención pueden entenderse más claramente mediante la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y los dibujos.
Solución técnica
Se proporciona una composición de medio que comprende un extracto de Ecklonia cava para desdiferenciar una célula madre mesenquimatosa en una célula madre pluripotente inducida.
Los presentes inventores intentan buscar un método para inducir células madre pluripotentes de manera altamente eficaz para desarrollar productos de terapia celular con alta seguridad y eficacia de producción en la práctica, sin plantear los asuntos éticos con respecto a la destrucción de embriones. Como resultado, los presentes inventores encontraron que cuando se añaden extractos de Ecklonia cava, extractos naturales seguros, a medios de cultivo pueden producirse células madre pluripotentes inducidas con eficacia sorprendentemente alta.
Ecklonia cava, como principio activo contenido en la composición de medio, es un alga marina marrón perenne que pertenece al orden Laminariales, la familia Lessoniaceae, que se produce principalmente en la costa sur y el océano frente a Jeju-do y Ulleung-do, Corea, se alimenta principalmente por abulones, conchas y similares, y se usa como materias primas principales para preparar ácido algínico, yodo o potasio, o como alimentos.
El extracto de Ecklonia cava usado en la presente invención puede extraerse usando agua o un disolvente orgánico, tal como (a) un alcohol anhidro o hídrico inferior con 1 a 4 átomos de carbono (metanol, etanol, propanol, butanol, normal-propanol, isopropanol y normal-butanol, y similares), (b) un disolvente mixto del alcohol inferior y agua, (c) acetona, (d) acetato de etilo, (e) cloroformo, (f) 1,3-butilenglicol, (g) hexano, (h) dietiléter y similares, y preferentemente un disolvente mixto de metanol o etanol con agua. En el caso de la extracción usando el disolvente mixto, metanol o etanol está contenido preferentemente en una cantidad del 50 al 80 % en v/v.
Recientemente aumentan los casos de aplicación del extracto de Ecklonia cava a una composición para la piel, tal como productos cosméticos (véase la solicitud de patente coreana abierta al público n.os 2013-0017159, 2012­ 0040488, 2010-0097293, y similares). Sin embargo, no hay ningún caso en el que el extracto de Ecklonia cava se desarrolla en un medio para la inducción de una célula madre pluripotente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “célula madre embrionaria” se refiere a una célula que tiene pluripotencia, que puede aislarse y cultivarse a partir de una masa celular interna de un blastocito, un desarrollo de fase temprana tras la fertilización. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula madre pluripotente” se refiere a una célula madre que tiene pluripotencia, que puede diferenciarse en las tres capas germinales, es decir, el endodermo, mesodermo y ectodermo, que constituyen el organismo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “diferenciación” se refiere a un proceso mediante el cual las células se vuelven más especializadas en estructura o función durante el crecimiento celular a través de la división y proliferación, es decir, un proceso mediante el cual las células, tejidos y similares de un organismo vivo cambian de forma o función con el fin de realizar la tarea determinada.
Tal como se usa en el presente documento, el término “producto de terapia celular”, que es un producto farmacéutico usado para el fin de tratamiento, diagnóstico y prevención con células y tejidos preparados de seres humanos mediante aislamiento, cultivo y manipulación específica, se refiere a un producto farmacéutico usado para el fin de tratamiento, diagnóstico y prevención a través de una serie de acciones, tal como cambio de las propiedades biológicas de las células mediante proliferación o selección de células alogénicas o xenogénicas in vitro, o mediante otros modos, con el fin de restaurar funciones de las células o tejidos. El producto de terapia celular se clasifica en general como un producto de terapia celular somática y un producto de terapia celular madre, de acuerdo con el grado de diferenciación de la célula.
La célula madre mesenquimatosa de la presente invención es una célula aislada de una célula madre embrionaria o una célula madre adulta derivada de mamíferos, preferentemente una célula madre mesenquimatosa derivada de cordón umbilical y más preferentemente una célula madre mesenquimatosa derivada de cordón umbilical humano. La célula madre puede obtenerse mediante recogida de un cordón umbilical que conecta el feto y la placenta en organismos humanos. La célula madre mesenquimatosa del cordón umbilical puede recogerse usando diversos métodos. Por ejemplo, una solución que contiene una célula mononuclear puede obtenerse recogiendo el cordón umbilical de organismos humanos, lavando el cordón umbilical recogido usando DPBS hasta que la sangre ya no sale más, cortando el cordón umbilical lavado usando un bisturí quirúrgico y sometiéndolo a incubación a 37 °C.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio” se refiere a una mezcla para el cultivo in vitro o diferenciación de una célula, tal como célula madre y similar, que contiene elementos esenciales para el crecimiento y proliferación de la célula, tal como azúcares, aminoácidos, diversos nutrientes, sueros, factores de crecimiento, minerales y similares.
Se venden diversos medios en el mercado en la técnica y un medio puede producirse artificialmente para usarse. Los medios en el mercado pueden incluir medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, medio esencial a-mínimo (a-MEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMPM), medio completo AmnioMax (Gibco, Nueva York, EE.UU.), medio completo AminoMaII (Gibco, Nueva York, EE.UU.), medio de Chang, medio MesenCult-XF (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá), y similares. Estos medios, así como medios que pueden producirse artificialmente, pueden usarse como un medio basal contenido en la composición de medio.
Un componente de suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS)), un antibiótico (por ejemplo, penicilina, estreptomicina), y similares, que se añaden normalmente, pueden añadirse al medio basal. Las concentraciones del componente de suero o componente antibiótico contenido en el medio basal pueden variar dentro del intervalo que puede lograr el efecto de la presente invención, y preferentemente puede añadirse el 10 % de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, y similares.
Además, el medio puede contener adicionalmente una mezcla de nutrientes. La mezcla de nutrientes, una mezcla que incluye diversos aminoácidos, vitaminas, sales minerales y similares, que se usan generalmente en el cultivo celular, puede prepararse mediante mezclado de los aminoácidos, vitaminas, sales minerales y similares, o puede usarse una mezcla de nutrientes preparada comercialmente. Ejemplos de mezclas de nutrientes producidas comercialmente pueden incluir, pero no se limitan a, M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 y similares.
Además, el medio puede contener adicionalmente agua energética para la inducción y estabilización de células madre pluripotentes. El agua energética puede contenerse preferentemente en una cantidad del 0,01 al 10 % en v/v, y más preferentemente en una cantidad del 0,05 al 0,5 % en v/v.
La composición del medio puede conseguirse mediante adición del extracto de Ecklonia cava al medio basal, como medio específico para la inducción de células madre pluripotentes, y pueden incluir el extracto de Ecklonia cava preferentemente en una concentración de 1 a 1,000 pg/ml y más preferentemente en una concentración de 100 a 400 pg/ml, con respecto a la composición de medio total.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para producir una célula madre pluripotente inducida, incluyendo la adición de un extracto de Ecklonia cava a un medio de cultivo celular; y la desdiferenciación de una célula madre mesenquimatosa en una célula madre pluripotente inducida en el medio.
De acuerdo con una realización de la presente invención, a diferencia del caso de usar medio DMEM F-12 solo, cuando se usa la composición de medio que contiene el extracto de Ecklonia cava de la presente invención, se formaron colonias de células madre pluripotentes en los días 8 a 10 (figuras 2 a 5).
La presente invención proporciona una célula madre pluripotente inducida preparada mediante el método de producción anterior.
La célula madre pluripotente inducida tiene la misma potencia de diferenciación que la célula madre embrionaria, y tiene casi la misma forma celular que la célula madre embrionaria. De acuerdo con una realización de la presente invención, tras la investigación de la expresión de genes (Nanog, Oct4, Sox-2, Klf) y proteína (SSEA4) específicos para la célula madre embrionaria, se confirmó que los genes y la proteína se expresan en la célula madre pluripotente inducida mediante la presente invención, de igual manera que en la célula madre embrionaria (figura 4). La presente invención proporciona una composición para tratar una célula que contiene la célula madre pluripotente inducida producida mediante el método anterior.
La célula madre pluripotente inducida tiene la misma pluripotencia que la célula madre embrionaria. De acuerdo con una realización de la presente invención, se confirmó que la célula madre pluripotente inducida tiene pluripotencia que puede diferenciarse en el endodermo, mesodermo y ectodermo (figura 5).
Por tanto, la célula madre pluripotente inducida puede usarse como un producto de terapia celular eficaz.
La composición puede inyectarse por medio de cualquier vía de administración, específicamente, por medio de administración por vía intraperitoneal o intratorácica, administración por vía subcutánea, administración por vía intravenosa o intraarterial, administración por vía intramuscular, administración por vía tópica mediante inyección y similares.
La composición puede administrarse en forma de inyección, suspensión, emulsión y similares, de acuerdo con un método general, y la composición puede suspenderse en un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund o puede administrarse con una sustancia que tiene una actividad adyuvante, tal como BCG, si es necesario. La composición puede esterilizarse o incluir un adyuvante, tal como un estabilizador, un polvo humectable o promotor emulsificador o una sal o tampón para control osmótico y otras sustancias terapéuticamente útiles. La composición puede producirse de acuerdo con un método general de mezclado, granulación o recubrimiento. La composición para tratar una célula puede contener un vehículo o aditivo farmacéuticamente aceptable, y puede incluir un diluyente (por ejemplo, dextrosa, sorbitol, celulosa, glicina, lactosa, sacarosa, manitol), un aglutinante (por ejemplo, silicato de aluminio y magnesio, pasta de almidón, goma tragacanto, carboximetilcelulosa sódica), un agente disgregante (por ejemplo, almidón, agar, ácido algínico o su sal de sodio) o una mezcla de ebullición y/o un absorbente, un edulcorante, un aroma y un colorante, además de principios activos.
La composición para tratar una célula puede aplicarse a artritis, enfermedades neurológicas, enfermedades endocrinas, enfermedades hepáticas y similares y puede usarse posteriormente como producto de terapia de célula alogénica para seres humanos, de acuerdo con los resultados de ensayo clínico en seres humanos.
Efectos ventajosos
Las características y ventajas de la presente invención se resumen tal como sigue:
(i) La presente invención proporciona un método para la producción de una célula madre pluripotente inducida usando la composición de medio.
(iii) El uso de la composición de medio permite una producción eficaz de una célula madre pluripotente inducida usando una célula madre mesenquimatosa, y la célula madre pluripotente producida puede ser útil como producto de terapia celular, ya que puede diferenciarse en una variedad de células.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista que ilustra que cuando una célula madre mesenquimatosa se cultiva en un medio de extracto de Ecklonia cava, se induce una célula madre pluripotente casi igual a una célula madre embrionaria; la figura 2 confirma que una célula madre pluripotente inducida de acuerdo con el método de la presente invención es una célula madre pluripotente, mediante el uso de expresión de proteína específica;
la figura 3 ilustra la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas dependiendo de las concentraciones de un extracto de Ecklonia cava, de acuerdo con el método de la presente invención;
la figura 4 ilustra expresiones de genes de una célula madre pluripotente inducida de acuerdo con el método de la presente invención; y
la figura 5 ilustra resultados de ensayo de potencia de diferenciación in vivo de una célula madre pluripotente inducida de acuerdo con el método de la presente invención.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
A continuación, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos. Los ejemplos pretenden solo describir específicamente la presente invención, y será evidente para un experto en la técnica que el alcance de la presente invención no se limita a estos ejemplos, de acuerdo con la idea de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de extracto de Ecklonia cava
Se adquirieron muestras de hierbas medicinales usadas en experimentos de Jeju-do y se usaron en experimentos después de tener la evaluación exacta del experto. Se pusieron 100 g de las muestras de hierbas medicinales secadas en 1 l de metanol al 70 %, se extrajeron bajo reflujo durante 16 horas y se filtraron usando un papel de filtro. El filtrado se concentró en un evaporador rotatorio bajo presión reducida y se liofilizó inmediatamente.
Ejemplo 2: Aislamiento de célula madre mesenquimatosa de cordón umbilical humano y cultivo de la misma Ejemplo 2-1: Recogida del cordón umbilical humano
Se recogen tejidos de cordón umbilical justo después del parto. Antes de que las muestras se transfieran al laboratorio, los tejidos de cordón umbilical se lavan minuciosamente, y se transfieren inmediatamente a 500 ml de una botella de vidrio esterilizado que contiene medio F-12 al que se añade un medio de transporte (50 UI/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (adquirida de Invitrogen)). En el laboratorio, se realiza la extracción de células madre en una campana de flujo, clase 100, en condiciones estériles. Las muestras se transfieren en primer lugar a un recipiente de esterilización de acero inoxidable. Las muestras de tejido de cordón umbilical se lavaron varias veces en PBS, y se cortan en 2 cm de largo y se transfieren a discos de cultivo celular que tienen un diámetro de 10 cm. Aquí, las muestras se lavan adicionalmente y se someten a tratamiento anti-infeccioso con etanol al 70 % y se lavan varias veces con PBS al que se añade una mezcla de antibióticos (50 UI/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (adquirida de Invitrogen)), hasta que la solución está pura.
Ejemplo 2-2: Aislamiento de célula madre de cordón umbilical humano y cultivo de la misma
Con el fin de aislar la gelatina de Wharton (base de cordón umbilical) de vasos sanguíneos y otros elementos internos de cordón umbilical, en primer lugar se hace una incisión en el cordón umbilical. Después de eliminar los vasos sanguíneos, la gelatina de Wharton aislada se corta en piezas pequeñas (0,5 cm x 0,5 cm) con el fin de extraer células. Se realiza el explante mediante colocación de las piezas de la gelatina de Wharton de cordón umbilical en diferentes discos para cultivo tisular con condiciones de cultivo celular adecuadas para la extracción de células madre epiteliales o células madre mesenquimatosas.
Con el fin de aislar/cultivar células madre mesenquimatosas, los tejidos explantados se sumergen en 5 ml de medios Eagle modificados por Dulbecco (DMEM) F-12 (Gibco) complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS, Hyclone), 10 % de FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina, y se mantienen en un incubador de CO2 a 37 °C. Los medios se sustituyeron cada tres o cuatro días. El crecimiento de células se controla con un microscopio óptico. Las células en crecimiento se tratan con tripsina (0,125 % de tripsina/0,05 % de EDTA) para expansión adicional y almacenamiento en congelación (usando DMEM/10 % de FBS).
Los medios se sustituyen cada tres o cuatro días. El crecimiento de células de los tejidos explantados se controla con un microscopio óptico.
Con el fin de extraer células madre mesenquimatosas, se resuspenden pellets de células y se recuentan en medios DMEM F-12 (Gibco), 10 % de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, y 50 pg/ml de estreptomicina y se inoculan en discos de cultivo tisular que tienen un diámetro de 10 cm en una densidad de 1 x 106 célula/disco. Los medios se sustituyen cada tres o cuatro días. El crecimiento de células y la formación de clones se controlan con un microscopio óptico. En aproximadamente un 90 % de confluencia, las células se sub-cultivan tal como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo experimental 1: Inducción de célula madre pluripotente a partir de célula madre mesenquimatosa Ejemplo experimental 1-1: Preparación de célula madre pluripotente de célula madre mesenquimatosa derivada de humano dependiendo de concentraciones de extracto de Ecklonia cava
En un experimento para inducir células madre pluripotentes a partir de células madre derivadas de cordón umbilical humano dependiendo de las concentraciones de extractos de Ecklonia cava de Jeju, para un grupo control, se usaron medios específicos para MSC, DMEM F-12 (Gibco), 10 % de FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina como medios basales. Para un grupo experimental, usando células madre mesenquimatosas derivadas de cordón umbilical humano sometidas a subcultivos tres veces, se añadieron a los medios extractos de Ecklonia cava de Jeju en las concentraciones de 1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml, 800 pg/ml, y 1000 pg/ml, y 0,1 % en v/v de agua energética (agua desionizada purificada que contiene SiO2, ALO3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O, y LiO, STC Nara Co., Ltd) (figura 1). Las células madre mesenquimatosas derivadas de cordón umbilical humano se aislaron y se inocularon 1 x 104 células mononucleares lavadas en placas (discos) de 6 pocillos y se mantuvieron a 37 °C y el 5 % de CO2 para cultivarse.
Con respecto a las células madre pluripotentes inducidas de acuerdo con el método de la presente invención, la expresión de proteínas OCT4, SOX2, y antígeno 4 embrionario específico de fase (SSEA4) específico para células madre embrionarias se analizó usando anticuerpos contra el mismo a través de tinción inmunoquímica. Como proceso para la tinción, las células se fijaron con un 4 % de paraformaldehído, se lavaron con PBS, y se bloquearon con solución de BSA al 1 %. Entonces, los anticuerpos primarios contra OCT4, SOX3 y SSEA4 se trataron y se hicieron reaccionar a 4 °C durante 18 horas y se lavaron con PBS, y se trataron anticuerpos secundarios que adjuntan fluorescencia (FITC) contra los anticuerpos primarios y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con PBS, se analizó la expresión de la proteína usando un microscopio confocal y los resultados se muestran en la figura 2. BF indica campo claro, la segunda figura indica los resultados de la tinción de cada expresión de proteína y la tercera figura combina las dos figuras (figura 2).
Como resultado, en el grupo experimental, se observó que se formaron colonias después de 10 días solo cuando la concentración de extracto de Ecklonia cava de Jeju se encuentra entre 100 y 400 pg/ml (figura 3). Además, marcadores específicos para células madre pluripotentes, OCT4, SOX2, y SSEA4, se tiñeron solo en colonias y se confirmaron que eran células madre pluripotentes.
Ejemplo experimental 1-2: Análisis de comparación aénica de célula madre pluripotente
Se sacaron colonias de las células madre pluripotentes preparadas en el ejemplo 2-1 anteriormente, usando pipeta de 200 pl, mientras se observaba las células madre pluripotentes a través de un microscopio y entonces se aisló ARN total usando reactivo TRIzol (producido por Invitrogen). Se sintetizó ADNc usando reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), y entonces se procedió la PCR usando cebadores específicos para OCT4, Sox-2, Nanog, c-Myc, y el gen control, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Nanog, OCT4, y Sox-2 son genes característicos mostrados en células madre embrionarias, y c-Myc es un gen no específico que puede mostrarse positivo tanto en células madre embrionarias como células madre adultas. Los productos de PCR se analizaron usando electroforesis en gel de agarosa y los resultados que confirman la expresión de los genes se muestran en la figura 4. De acuerdo con la figura 4, la expresión de OCT4, que es un gen característico de células madre pluripotentes, es baja en células madre mesenquimatosas que no experimentaron un proceso de inducción, mientras que la expresión de los genes característicos era significativamente alta en células madre pluripotentes (STC2013-F002) inducidas por el método de la presente invención. SOX2 y Nanog, genes de células madre, se expresaron en un nivel similar y c-Myc, un gen no especifico, se expresó en un nivel inferior en células (STC2013-F002) que experimentaron un proceso de inducción, que en células que no experimentaron un proceso de inducción.
Ejemplo experimental 2. Confirmación de célula madre pluripotente mediante ensayo de teratoma
Con el fin de analizar la potencia de diferenciación in vivo de células madre pluripotentes inducidas mediante el método de la presente invención, colonias de células madre pluripotentes no diferenciadas que se cultivaron en células de apoyo, se trataron con tripsina-EDTA en el día 5 después del cultivo y se sacaron del mismo, entonces se colocaron en colagenasa, y se mantuvieron en un incubador durante 30 minutos. Se recogieron las células madre pluripotentes no diferenciadas y se administraron 1 x 106 células por medio de inyección subcutánea a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se recogieron los teratomas formados después de 4 semanas y se fijaron con paraformaldehído al 4% para someterse a incrustación en parafina típica. Los tejidos se cortaron en 10 pm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina.
De acuerdo con la figura 5, los teratomas se formaron macroscópicamente en un lugar donde se inyectaron las células madre pluripotentes inducidas producidas mediante el método de la presente invención. De manera específica, se demostró que histológicamente se formaron teratomas que pueden diferenciarse en tejidos nerviosos derivados del ectodermo (figura 5a), tejidos musculares derivados del mesodermo (figura 5b), tejidos del estómago derivados del endodermo (epitelio cilíndrico, figura 5c), y similares. A partir de los experimentos puede confirmarse que las células inducidas por el método de la presente invención tienen pluripotencia que es prácticamente la misma que las células madre embrionarias in vivo, es decir, pluripotencia que puede diferenciarse en el ectodermo, mesodermo y endodermo.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Método para la producción de una célula madre pluripotente inducida, comprendiendo el método:
añadir un extracto de Ecklonia cava a un medio de cultivo celular; y
desdiferenciar una célula madre mesenquimatosa en una célula madre pluripotente inducida en el medio.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo celular comprende medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (Bm E), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, medio esencial a-mínimo (a-MEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio MacCoy 5A, medio completo AMINOMAX, medio completo AMINOMAX II, medio de CHANG o medio MESENCULT-XF.
3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el extracto de Ecklonia cava está comprendido en el medio en una cantidad de 100 a 400 mg/ml con respecto a la composición del medio.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio comprende además del 0,01 al 10 % en v/v de agua energética, en el que el agua energética consiste en agua desionizada purificada que contiene SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3 , CaO, Na2O, K2O y LiO.
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