JP2016521990A - 間葉系幹細胞から誘導多能性幹細胞を製造する方法及びその方法によって製造された誘導多能性幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)本発明は、カジメ抽出物を含む誘導多能性幹細胞逆分化用の培地組成物を提供する。
(ii)また、本発明は、前記培地組成物を用いた誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
(iii)本発明に係る培地組成物を利用すると、間葉系幹細胞を利用して誘導多能性幹細胞を効率的に製造することができ、製造された多能性幹細胞は、様々な細胞への分化が可能なので、細胞治療剤として有用に使用することができる。
実施例1:カジメ抽出物の製造
実験に使用された生薬試料は、済州島で購入して専門家の正確な鑑定を経た後、実験に使用した。乾燥された生薬試料100 gを70%メタノール1リットルに入れ、16時間還流抽出し、ろ紙を使用して濾過した。ろ液を回転減圧蒸発器で濃縮させて、すぐに凍結乾燥した。
実施例2-1:人体臍帯採取
臍帯組織は、出産直後すぐに収集される。試料が実験室に移される前に、まずきれいに洗った後、直ちに移送用培地(50 IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogenから購入))が添加されたF-12培地が入っている500mlの滅菌ガラスびんに移される。実験室では、滅菌状態の下でclass100のフローフードで幹細胞の抽出が行われる。試料は、まず滅菌ステンレス鋼の容器に移される。PBSで数回洗浄した後、臍帯組織試料は、その後、2cmの長さに切られて10cm径の細胞培養皿に移され、ここで追加の洗浄及び70%エタノールで抗感染処理して、抗生剤混合物(50 IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン(Invitrogenから購入))が添加されたPBSで前記溶液がきれいになるまで数回洗浄する。
臍帯の血管や他の内部要素からホウォートンゼリー(臍帯の基質)を分離するために臍帯組織の切開がまず行われる。血管を除去した後分離されたホウォートンゼリーは、細胞の抽出のために小さな断片(0.5cmx 0.5cm)のサイズにカットされる。外植(explant)は、上皮幹細胞又は間葉系幹細胞の抽出に適した細胞培養条件が揃っている互いに異なる組織培養皿に臍帯ホウォートンゼリーの断片を入れて実行される。
実験例1-1:カジメ抽出物の濃度に応じたヒト由来の間葉系幹細胞の多能性幹細胞の製造
済州カジメ抽出物の濃度に応じて、ヒト臍帯由来の幹細胞から多能性幹細胞を誘導するための実験で、対照群は、MSCの専用培地でDMEM F-12(Gibco)、10%FBS、100 unit/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを基本培地として使用し、実験群は、継代培養を三回したヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を使用して、培地に済州カジメ抽出物を1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1000μg/mlの濃度とエネルギーウォーター(SiO2、Al2O3、TiO3、Fe2O3、CaO、Na2O、K2O、LiOを含有する精製脱イオン水、STCナラ)0.1 v/v%を添加した(図1)。ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を分離して洗浄された単球細胞を6-ウェルプレート(dish)に1 x104個の細胞を接種して、37℃、5%CO2を維持して培養した。
前記実施例2-1で製造された多能性幹細胞を顕微鏡で見ながら200μlピペットを使用してコロニーのみはがした後、TRIzol試薬(Invitrogen社製)を使用して全体RNAを分離した。逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いてcDNAを合成した後、OCT4、Sox-2、Nanog、c-Myc及び対照遺伝子であるGAPDH(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase)遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRを行った。Nanog、OCT4、Sox-2は、胚性幹細胞から見られる特徴的遺伝子であり、c-Myc遺伝子は、胚性幹細胞と成体細胞の両方で陽性と見られる非特異的な遺伝子である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析して、これらの遺伝子の発現を確認した結果を図4に示した。図4によれば、誘導過程を介さない間葉系幹細胞は、多能性幹細胞の特徴的な遺伝子であるOCT4の発現度が低いのに対し、本発明の方法によって誘導された多能性幹細胞(STC2013-F002)では、これらの特徴的な遺伝子が著しく高く発現された。幹細胞遺伝子であるSOX2とNanogは似たような水準で発現され、非特異的な遺伝子であるc-Mycは誘導過程を経た細胞(STC2013-F002)が誘導過程を経ていない細胞よりも低く発現されることが確認された。
本発明の方法で誘導された多能性幹細胞の生体内分化能を分析するために、支持細胞上で培養した未分化多能性幹細胞コロニーを培養5日目にトリプシン-EDTAを処理してはがした後、コラーゲン分解酵素(collagenase)に入れてインキュベーターに30分間置いた。未分化多能性幹細胞を回収し、1 x106細胞を重症複合免疫不全症(severe combined immune deficiency、SCID)マウスに皮下注射(subcutaneous injection)した。4週間後に形成された奇形腫を収穫して4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)で固定させた後、通常のパラフィン包埋(embedding)を実施した。10μmの厚さに組織を切ってヘマトキシリン(Hematoxylin)とエオシン(Eosin)染色を行った。
Claims (7)
- カジメ(Ecklonia cava)抽出物を含む間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を誘導多能性幹細胞(induced pluripotency stem cell)に逆分化するための培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI1640、F-10、F-12、DMEM F-12、α-MEM(α-Minimal Essential Medium)、G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、MacCoy’s 5A培地、AmnioMax、AminoMax II complete Medium、及びChang's Medium MesenCult-XF Mediumからなる群から選択される培地に含まれることを特徴とする請求項1に記載の培地組成物。
- 前記カジメ抽出物は、培地組成物を基準に100〜400μg/ml含まれることを特徴とする請求項1に記載の培地組成物。
- 前記培地組成物は、エネルギーウォーターを0.01〜10 v/v%でさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の培地組成物。
- カジメ(Ecklonia cava)抽出物を細胞培養培地に添加する段階と、前記培地で間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を誘導多能性幹細胞(induced pluripotency stem cell)に逆分化させる段階とを含む誘導多能性幹細胞の製造方法。
- 請求項第5項の製造方法で製造された誘導多能性幹細胞。
- 請求項第6項の誘導多能性幹細胞を含む細胞治療用組成物。
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