CN105255818A - 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 - Google Patents
一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105255818A CN105255818A CN201510783971.2A CN201510783971A CN105255818A CN 105255818 A CN105255818 A CN 105255818A CN 201510783971 A CN201510783971 A CN 201510783971A CN 105255818 A CN105255818 A CN 105255818A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- roller bottle
- nutrient solution
- defoamer
- passage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种改良的PK-15细胞传代培养方法，在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且能有效减少细胞聚团。本发明还把所述改良的PK-15细胞传代培养方法用于猪圆环病毒2型的增殖，增殖后猪圆环病毒2型病毒含量高。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养工程技术领域，具体涉及一种改良的PK-15细胞传代方法及其应用。
背景技术
PK-15细胞由猪肾细胞驯化而来的传代细胞系，可用于多种动物病毒的培养，猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒等。目前，PK-15细胞最大的应用即用于猪圆环病毒2型培养，灭活后制备疫苗。
研究发现，PK-15培养时，尤其大规模培养时，容易聚团，导致细胞生长不均匀，且猪圆环病毒2型培养时大多采用同步方式接种，即将细胞消化分散的细胞分装后直接接种猪圆环病毒2型病毒悬液，然后共同培养，同步接种方式较分步接种产毒量高，更适合于大生产，但同步接种更容易导致细胞聚团，从而影响细胞的生产及病毒的增殖效率。培养操作过程中发现，细胞传代时产生的泡沫是导致细胞聚团的主要原因，尤其利用滚瓶大规模培养细胞时，泡沫粘附于瓶壁，培养时，细胞不断聚集于此，最终成团。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种能减少细胞聚团，细胞分散均匀,生产效率高的改良的PK-15细胞传代培养方法。
本发明的另一目的在于将上述改良的PK-15细胞传代培养方法应用于猪圆环病毒2型的繁殖中。
本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
根据本发明所提供的一种改良的PK-15细胞传代培养方法，包括以下步骤:
1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，混匀后于37℃、6r/h转瓶机中培养，至融合状态达到80％以上。
本发明中，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
其中，PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。
本发明中，所述消泡剂购买于Sigma公司，其型号为Antifoam204(A8311)。优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。
本发明的另一个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，包括以下步骤：
1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL；按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h转瓶机培养24h；
3)弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。
其中，步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
其中，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。
优选地，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。
本发明所提供的技术方案可以包括以下技术效果：
(1)在PK-15细胞传代培养过程中，加入消泡剂，消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，使细胞生长状态保持良好，且能有效减少细胞聚团。
(2)采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，有利于猪圆环病毒2型(JM株)的增殖。
附图说明
图1为PK-15细胞扩繁培养后的状态图；
图2为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；
图3为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)；
图4为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；
图5为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)。
此处的附图并列入说明书并构成说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
1.试剂与材料
细胞：PK-15细胞(肇庆大华农生物药品有限公司保存)；
病毒：猪圆环病毒2型(JM株)，由肇庆大华农生物药品有限公司保存；
培养基与血清：DMEM培养基(Gibco公司)，血清(Hyclone公司)；
消泡剂：型号Antifoam204(A8311)，购买于Sigma公司；
其它试剂：青链霉素(广州美津生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，猪圆环病毒2型多克隆抗体(VMRD公司)，FITC标记的羊抗猪二抗(KPL公司)。
2、PK-15细胞传代培养方法的改良
2.1改良方法具体操作步骤
2.2.1PK-15细胞的扩繁
从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42℃水浴中快速解冻，1000rpm离心5min，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置37℃、5％CO2的培养箱中，培养至融合状态为100％的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
2.2.2消泡剂工作浓度确定
2.2.2.1在2000mL滚瓶中培养PK-15细胞
将2.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装至7个2000ml的滚瓶中，然后添加培养液至200ml，细胞浓度为5×104个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素。接着，分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶中的浓度分别为0.5μL/200mL、1μL/200mL、1.5μL/200mL、2μL/200mL、2.5μL/200mL、3μL/200mL，另外一个滚瓶作为对照例，不添加消泡剂；加入消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7个滚瓶置于37℃、6r/h滚瓶机中培养，培养至融合状态到达80％以上。分别用肉眼和在显微镜下观察细胞聚集状态。如此重复三次，以确定消泡剂的最佳浓度。
2.2.2.2在15000mL滚瓶中培养PK-15细胞
将2.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装至7个15000mL滚瓶中，然后添加培养液至15000ml，细胞浓度为1×104个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素。接着，分别往其中6个滚瓶中加入消泡剂，消泡剂在6个滚瓶中的浓度分别为0.5μL/200mL、1μL/200mL、1.5μL/200mL、2μL/200mL、2.5μL/200mL、3μL/200mL，另外一个作为对照例，不添加消泡剂，加入消泡剂的6个滚瓶混匀后，把7个滚瓶置于37℃、6r/h滚瓶机中培养，培养至融合状态到达80％以上。分别用肉眼和在显微镜下观察细胞聚集状态。如此重复三次，以确定消泡剂的最佳浓度。
2.2结果与讨论
如图1所示，为PK-15细胞扩繁培养后的状态图。从图中可得，从液氮中复苏的PK-15细胞生长良好，在处于静止状态的方瓶中传代培养，PK-15细胞出现部分聚集现象。
如图2所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；如图3所示，为未使用消泡剂处理在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)。从图2、图3中可得，将在方瓶中扩繁后的PK-15细胞消化分散后，分装至滚瓶中培养，在操作过程中产生的泡沫未及时消除，粘附于瓶壁，导致细胞在泡沫附着位置大量聚集，最终导致细胞大量聚集成团。
如图4所示，为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(肉眼观察)；如图5所示，为使用消泡剂(浓度：3μL/200mL)处理后在滚瓶(2000ml)培养的PK-15细胞状态图(显微镜观察)。从图4、图5中可得，PK-15细胞在滚瓶传代培养时加入消泡剂处理后，细胞生长状态良好，且能有效减少细胞聚团。
表1所示，为在使用消泡剂和不使用消泡剂的情况下，PK-15细胞分别在2000ml和15000ml滚瓶中的生长状况。
表1.PK-15细胞在滚瓶中的生长状况
从表1中可以看出，本发明实施例在0.5-3.0μL/200mL的范围内进行试验，当消泡剂浓度为0.5-1μL/200mL时，细胞的生长状态欠佳，细胞出现团聚现象；当消泡剂浓度为1.5-3μL/200mL时，细胞生长状态良好，无团聚现象。因此，确定1.5-3μL/200mL为消泡剂的最佳浓度。消泡剂能有效消除细胞传代操作过程中产生的泡沫，但消泡剂为去污剂，对细胞具有毒性。当消泡剂的浓度高时，毒性较大，容易导致细胞死亡；而浓度低时，虽然毒性降低，但消泡效果较差，不能有效地在短时间内消除泡沫。研究表明，当消泡剂浓度为1.5-3.0μL/200mL时，消泡效果佳，细胞团聚少，且生长状态良好，为最佳浓度。
3、改良的PK-15细胞传代培养方法的应用
3.2方法与操作步骤
3.2.1PK-15细胞的扩繁
从液氮中取出冻存的PK-15细胞，于42℃水浴中快速解冻，1000rpm离心5min，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置37℃、5％CO2的培养箱中，培养至融合状态为100％的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散后分装扩大培养。
3.2.2猪圆环病毒2型(JM株)的增殖
将3.2.1中扩大培养的细胞用含胰蛋白酶的消化液分散后，分装至15000mL的滚瓶中，添加培养液至1500ml，细胞浓度为1×104个/mL，其中培养液含10wt％胎牛血清和1wt％青链霉素；加入2μL/200mL消泡剂，同时设非处理对照组，分别按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h滚瓶机中培养24h，弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。按此方法重复3批。
3.2.3猪圆环病毒2型(JM株)的病毒滴度测定
将3.2.1获取的单层PK-15细胞消化分散，用含10wt％胎牛血清的DMEM培养液制成浓度约为2×105个/ml的细胞悬液，按每孔200μl加入到48孔细胞培养板。取3.2.2中收获的病毒液，用DMEM培养液做10倍系列稀释至10-7，每个稀释度病毒液以每孔200μl接种,分别接种4孔至分装在48孔培养板中的PK-15细胞，非处理对照组执行相同的操作；置37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48h。
弃细胞维持液，用磷酸缓冲盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH值7.4)洗涤3次，每次2-3min，用200μl80％冷丙酮固定30min，弃去固定液，再用PBS洗2次，每次5min，每孔加入200μl的PCV2多克隆抗体，其中PCV2多克隆抗体用PBS作1∶200稀释，置37℃作用1h，PBS洗涤5次，每次5min。最后每孔加入200μlFITC标记的羊抗猪二抗，其中FITC标记的羊抗猪二抗用PBS作1∶100稀释，37℃作用1h，PBS洗涤5次，每次5min。
在倒置显微镜下观察结果，如果出现绿色荧光信号，判为PCV2阳性；否则判为阴性。按Reed-Muench法计算其TCID50。
3.2结果与讨论
采用改良的PK-15细胞传代培养方法培养细胞后，增殖猪圆环病毒2型(JM株)的病毒含量情况如表2所示。从表2可看出，经过消泡剂处理后，细胞增殖病毒的病毒含量显著高于对照组，表明消泡剂处理后细胞均匀生长，有利于病毒增殖。
表2猪圆环病毒2型(JM株)病毒含量
| 第一批 | 第二批 | 第三批 | |
| 对照组 | 105.5 | 105.1 | 104.7 |
| 消泡剂处理组 | 106.3 | 106.4 | 106.7 |
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)将PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，混匀后于37℃、6r/h转瓶机中培养，至融合状态达到80％以上。
2.根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。
3.根据权利要求1所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
4.根据权利要求3所述的改良的PK-15细胞传代培养方法，其特征在于，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。
5.如权利要求1-4任一项所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于：
1)取PK-15细胞分装至滚瓶中，添加培养液，直至滚瓶内溶液体积达到滚瓶体积的10％，PK-15细胞在培养液中的浓度为1-5×104个/mL，所述培养液含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素；
2)加入消泡剂，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为0.5-3.0μL/200mL，按滚瓶内培养液体积的5％接种猪圆环病毒2型病毒悬液，混匀后于37℃、6r/h转瓶机培养24h；
3)弃去培养液，用300mMD-氨基葡糖糖溶液处理30min后，弃去液体，加含2wt％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养72h，冻融收获病毒液。
6.根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述消泡剂在滚瓶中的浓度为1.5-3.0μL/200mL。
7.根据权利要求5所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述步骤1)中的PK-15细胞为扩繁的PK-15细胞，所述扩繁的PK-15细胞按照如下方法获得：将在液氮中冻存的PK-15细胞复苏后，用含10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素的DMEM生长液悬浮，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，形成100％融合状态的细胞单层，用含胰蛋白酶的消化液分散，然后扩大培养，获取所述扩繁的PK-15细胞。
8.根据权利要求7所述的改良的PK-15细胞传代培养方法的应用，其特征在于，所述PK-15细胞复苏的步骤如下：将PK-15细胞于42℃水浴中快速解冻，然后1000rpm离心5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510783971.2A CN105255818A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510783971.2A CN105255818A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105255818A true CN105255818A (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=55095749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510783971.2A Pending CN105255818A (zh) | 2015-11-13 | 2015-11-13 | 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105255818A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624499A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-10-09 | 佛山安普泽生物医药股份有限公司 | 一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02242673A (ja) * | 1989-03-15 | 1990-09-27 | Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho | 新規な豚コレラ弱毒ウイルス株、その作出法並びに豚コレラ生ワクチン及その製造法 |
| CN101289655A (zh) * | 2007-12-17 | 2008-10-22 | 上海佳牧生物制品有限公司 | 一种制备猪圆环病毒的工艺 |
| US20090042244A1 (en) * | 2004-03-25 | 2009-02-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Protein expression yield enhancement in cell-free protein synthesis systems by addition of antifoam agents |
| CN103898044A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-07-02 | 河南农业大学 | 猪圆环病毒2型高敏感性pk15细胞系l8的制备方法 |
| CN104593334A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-05-06 | 成都天邦生物制品有限公司 | 低血清培养pk-15细胞生产猪圆环ⅱ型dbn-sx07株病毒的方法 |
-
2015
- 2015-11-13 CN CN201510783971.2A patent/CN105255818A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02242673A (ja) * | 1989-03-15 | 1990-09-27 | Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho | 新規な豚コレラ弱毒ウイルス株、その作出法並びに豚コレラ生ワクチン及その製造法 |
| US20090042244A1 (en) * | 2004-03-25 | 2009-02-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Protein expression yield enhancement in cell-free protein synthesis systems by addition of antifoam agents |
| CN101289655A (zh) * | 2007-12-17 | 2008-10-22 | 上海佳牧生物制品有限公司 | 一种制备猪圆环病毒的工艺 |
| CN103898044A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-07-02 | 河南农业大学 | 猪圆环病毒2型高敏感性pk15细胞系l8的制备方法 |
| CN104593334A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-05-06 | 成都天邦生物制品有限公司 | 低血清培养pk-15细胞生产猪圆环ⅱ型dbn-sx07株病毒的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 付世新 等: "不同培养基对PK15细胞增殖影响的研究", 《黑龙江八一农垦大学学报》 * |
| 陆有飞 等: "不同浓度胰蛋白酶对PK15细胞传代消化的影响", 《广西畜牧兽医》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108624499A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-10-09 | 佛山安普泽生物医药股份有限公司 | 一种哺乳动物细胞大规模生产培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101979518B (zh) | 一种制备伪狂犬病病毒的方法 | |
| CN101875917A (zh) | 生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法 | |
| CN102690791A (zh) | 应用生物反应器微载体培养st细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法 | |
| CN101979514B (zh) | 猪蓝耳病病毒与疫苗及二者的生产方法 | |
| CN102861329A (zh) | 一种利用生物反应器生产犬细小病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN103520715B (zh) | 利用wave波浪生物反应器生产猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 | |
| CN105543113B (zh) | 一种生产柠檬酸的黑曲霉的控制培养方法 | |
| CN102807964A (zh) | 一种动物细胞放大培养的方法 | |
| CN105749270A (zh) | 轮状病毒疫苗及其制备方法 | |
| CN103285385B (zh) | 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 | |
| CN105255818A (zh) | 一种改良的pk-15细胞传代培养方法及其应用 | |
| CN105838683A (zh) | 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法 | |
| CN104830764A (zh) | 羊水间充质干细胞的原代分离培养方法 | |
| CN105441350B (zh) | 产具有多种酶活性的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN106916780A (zh) | 高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株 | |
| CN106834209A (zh) | 高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株 | |
| CN105288608A (zh) | 猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法 | |
| CN105779373A (zh) | 一种适宜稻曲病菌产孢的核糖培养基及其应用方法 | |
| CN104740627B (zh) | 一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法 | |
| CN102743749B (zh) | 应用篮式生物反应器制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法 | |
| CN103865885A (zh) | 猪细小病毒的培养方法 | |
| CN204981904U (zh) | 一种管道式细胞培养装置 | |
| CN104232563A (zh) | 含猪圆环病毒2型细胞的培养方法 | |
| CN106867973A (zh) | 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法 | |
| CN103087993B (zh) | 一种猪传染性胃肠炎病毒的大规模生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160120 |