CN106867973A - 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法 - Google Patents

一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106867973A
CN106867973A CN201710082116.8A CN201710082116A CN106867973A CN 106867973 A CN106867973 A CN 106867973A CN 201710082116 A CN201710082116 A CN 201710082116A CN 106867973 A CN106867973 A CN 106867973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
cells
pseudorabies
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710082116.8A
Other languages
English (en)
Inventor
张连秀
巩志宏
闵庆如
周忠涛
于宗幸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu Animal Health Products Co ltd
Original Assignee
Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu Animal Health Products Co ltd filed Critical Qilu Animal Health Products Co ltd
Priority to CN201710082116.8A priority Critical patent/CN106867973A/zh
Publication of CN106867973A publication Critical patent/CN106867973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16751—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法。本发明涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺，其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪伪狂犬病病毒HZ株的大规模培养，具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。

Description

一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
技术领域
本发明涉及一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种猪急性传染病。猪伪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重：导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率几乎高达100％。(邓仕伟，汪勇，薛春芳。我国伪狂犬病流行现状及新特点.动物医学进展，2006,27(9)：105-107)(Tamba M,Calabrese R,Finelli E,et al.Risk factors forAujeszky’s-disease seropositivity of swine herds of a region of northernItaly.Prev Vet Med,2002,54(3):203-212)。我国于上世纪70年代从匈牙利引进了PRVBartha-K61株，该病毒株是公认的优良疫苗株，上世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该疫苗进行防治，对猪伪狂犬病起到了很好的控制作用。
但是，自2011年以来，在我国华北、华中、华东、东北等地区的许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病的流行，发病猪场数量多，损失较大，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，母猪产弱仔、死胎，仔猪出现神经症状及死亡等。通过对发病猪群组织器官中PRV病毒的序列分析及致病性研究，科学家发现猪伪狂犬病病毒的抗原性发生了一定程度的变异，变异伪狂犬毒株对猪的致病性更强。(赵鸿远等.猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及其gE基因的分子特征.中国预防兽医学报，1008-0589(2014)07-0506-04)。
ST细胞，即猪睾丸细胞，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养，该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等，是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一。ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。
转瓶培养ST细胞技术是目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍的细胞培养方法，优势是工艺简单、成本低廉，然而生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。(陈文庆,王建超,刘华杰等.悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析[J].中国兽药杂志,2010,44(10):37-41)。
基于转瓶培养的弊端，悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小、成本低等优点，且避免了BVDV等外源病原污染，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。
目前悬浮培养应用主要是微载体悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面，率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应，疫苗生产企业越来越关注新工艺。
本申请人在为猪场提供疾病诊断的过程中，从送检病料中分离到一株gE基因自然缺失的变异株弱毒HZ株。我们用HZ株作为制苗用毒株，在对HZ株进行安全性、免疫原性等研究的基础上，尝试了ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬疫苗的工艺。该工艺关键技术在于细胞驯化，ST细胞全悬浮驯化成功后，可用于猪伪狂犬病毒的培养。较其它微载体悬浮培养系统，该系统具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
发明内容
本发明的目的是提供一种ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬病疫苗的工艺，从而降低生产成本，进行规模化、均一性生产，以应对目前国内猪伪狂犬病毒病流行形势。
本发明的技术方案
1.一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。
2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪伪狂犬病病毒。
3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法具体为：
(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞再悬浮后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；
(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液，并按照体积比1％～5％接种伪狂犬病病毒种毒；
(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待80％左右的细胞出现典型CPE时，收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀后分装，经冷冻真空干燥制成疫苗。
4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的病毒为保藏号为CGMCC No.11912的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株。
5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病的方法，其特征在于所述ST细胞株的建立，是由猪睾丸传代细胞(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养液悬浮驯化过程而获得，该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(Porcine testis)悬浮适应株，简称ST-1株。该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12698。
以上本发明所述的细胞培养液系指低血清细胞培养液，其血清含量(V/V)为0.5％～2％。
使用的细胞生物反应器为APPLIKON公司30L～2000L细胞生物反应器。
本发明公开的ST细胞全悬浮培养猪伪狂犬病疫苗的工艺，其操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体，可以在低血清培养基中悬浮培养，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
具体实施方式
一、全悬浮培养的ST细胞株的建立驯化过程
1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(降低血清)：
从液氮罐中取ST贴壁细胞种子(CVCC，No.CL27，购自中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心，见《中国兽医菌种目录》(第二版)，p171))，在T75培养瓶中加入10％新生牛血清的细胞生长液，进行ST细胞复苏，并贴壁培养，使用逐步降低血清的贴壁培养基进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％。
2.ST细胞(低血清培养基)的悬浮驯化
将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。
ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳定增值到1.2×106/ml，细胞活力达到90％以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化，确定了pH7.0±0.1、转速120r/min，实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养，并对生物反应器中的溶氧量进行了改进，从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程，并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系(Porcine testis)悬浮适应株(简称ST-1株)。该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCC No.12698。(详见实施例1)
二、全悬浮细胞的制备
1.细胞摇瓶扩大培养：细胞复苏后以5×105/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至1.2×106/ml时，进行传代，按照比例补加新鲜培养基，使细胞初始密度为5×105/ml。
2.细胞接种生物反应器：细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.1，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用200ml(200ml/1000ml)细胞培养液回悬后接入生物反应器。
三、制苗用毒液的制备及配苗
1.接毒：待ST细胞全悬浮培养密度约6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液，注入新的细胞培养液，并接种2％(V/V)生产用毒种(保藏编号为CGMCC No.11912的猪伪狂犬病病毒HZ株)。
2.收获病毒液及配苗：在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待80％左右的细胞出现典型CPE时，收获病毒液，加适宜耐热冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。
3.猪伪狂犬病疫苗的检验
(1)性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行检验，应无菌生长。
(3)支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
(4)外源病毒检验将疫苗与猪伪狂犬病病毒特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。
(5)鉴别检验
1)血清中和试验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。中和组和细胞对照组应不出现CPE，不中和对照组应全部出现CPE。
2)病毒基因鉴定采用基因鉴定PCR检测法，用扩增gB基因的引物(序列1、序列2)进行PCR检测，应扩增出大小约为600bp的特异性条带。
用扩增gE基因的引物(序列3、序列4)进行PCR检测，应扩增不出大小约为298bp的特异性条带。
(6)安全检验用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头肌肉接种疫苗10头份，观察14日，仔猪应全部健活。
(7)效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头3～4周龄健康易感仔猪，每头肌肉接种疫苗1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后21日，连同对照猪用猪伪狂犬病病毒S12株强毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后观察10日。对照猪应全部发病，免疫猪应全部保护。
(8)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
(9)剩余水分测定按《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明涉及到的猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株，系本申请人自行由菏泽某猪场采集病死猪脑和扁桃体组织病料中分离、鉴定而获得，该毒株为gE基因自然缺失的变异株弱毒。该毒株已于2016年05月10日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.11912；猪睾丸传代细胞ST株，保藏编号为CVCC，No.CL27，(中国微生物菌种保藏管理中心编著《中国兽医菌种目录》(第二版)，中国农业出版社，2002，p171)，购自中国兽医药品监察所；猪睾丸细胞系(Porcine testis)悬浮培养适应株(简称ST-1株)该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为此CGMCC No.12698。
本发明的积极意义
本发明一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法。本发明涉及的ST细胞全悬浮培养的工艺，其关键技术在于ST细胞全悬浮驯化成功后可在生物反应器进行猪伪狂犬病毒的大规模培养，具有操作简单、可控性强、培养效率和自动化程度高、不需要载体等优势，为细胞或疫苗的规模化生产提供了一条新的路径。
实施例
以下是本发明具体的实施方案，以进一步阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。本领域技术人应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
——全悬浮培养的ST细胞株的建立
1.ST细胞贴壁培养阶段的驯化(低血清驯化过程)
从液氮罐中取ST贴壁细胞种子，在T75培养瓶中加入10％MEM细胞生长液，进行细胞复苏培养，接种比例为1:1，24h后换液。待细胞长成致密单层且生长状态良好时，0.05％胰酶消化2遍，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，按照1:3的比例传代，进行ST细胞贴壁培养，并向下继续传代至F3。用0.05％胰酶消化液将细胞进行分离，500～1000r/min离心，使用低血清贴壁培养基重新混合均匀，以3×105～5×105个/ml进行传代培养驯化。血清含量从10％、8％、5％、3％、2％、1％降至0.5％，每个血清含量细胞状态稳定后继续传代三代，然后转到下一个血清含量。观察细胞的生长情况。见表1。
表1 ST细胞贴壁培养低血清驯化试验结果
血清含量 接种密度 贴壁情况 生长状况 数量 活力
10％ ++++ ++++ 98％
8％ ++++ ++++ 99％
5％ +++ ++++ 96％
3％ +++ ++++ 97％
2％ +++ ++++ 97％
1％ +++ ++++ 96％
0.5％ +++ ++++ 98％
经过缓慢(37代)的细胞驯化传代培养，试验结果显示用10％～5％血清含量的培养基培养细胞，48h左右即可长成致密细胞单层；从3％降至0.5％血清含量的培养基培养细胞，传第1代时，有少许死细胞，但不影响细胞贴壁和生长，传3到5代后可按照常规方法进行分瓶传代，驯化稳定后，72h左右长成致密细胞且细胞状态良好。考虑到生产成本问题，将细胞生长液的血清含量定为0.5％～2％。
2.ST细胞(含0.5％～2％新生牛血清的低血清培养基)的悬浮驯化
(1)不同代次细胞悬浮培养的驯化
将驯化好的低血清细胞培养液(0.5％～2％新生牛血清的细胞培养液)培养的长成致密单层的ST贴壁细胞稳定传代3代后，记为ST F0。
1)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F5)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2％新生牛血清的细胞培养液)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
2)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F8)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2％新生牛血清的细胞培养液)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
3)待驯化好的低血清细胞培养液培养ST贴壁细胞(F11)生长成致密细胞单层时，0.05％胰酶消化，用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液，以5×105个/ml的密度接入到125ml三角培养瓶中，用低血清培养液补足至40ml，以120r/min转速于37℃、5％CO2培养箱中培养。每隔72h离心换液(含2％新生牛血清的细胞培养液)，并依此方法连续培养传代，直至50代，培养过程中对每代细胞取样计数并观察细胞形态。
试验结果：从上述第2)项F8开始将贴壁细胞驯化为悬浮细胞，刚开始细胞死亡数较多，经过不断地离心换液传代，传至F39时，全悬浮培养72h，细胞密度达到2.26×106/ml，细胞活力达到94％。第1)项和第3)项的细胞均未驯化成功。将驯化成功的ST细胞F39的一部分收获，并冻存，记为ST-1F0。
(2)培养液pH对悬浮培养细胞的影响
在其他培养条件一致的条件下，将细胞培养液的pH分别设置为6.8±0.1、7.0±0.1、7.2±0.1和7.4±0.1，37℃培养72h后，取样计数并观察细胞形态。
当ST细胞培养液pH为7.0±0.1时，培养液的pH下降较快，细胞生长快，细胞密度比同期其他试验组高，细胞活性也较好。当pH在6.8±0.1或7.4±0.1时，培养48h后细胞生长缓慢，细胞密度显著低于其他试验组。所以ST细胞培养液理想pH为7.0±0.1。
(3)转速对悬浮培养细胞的影响
培养条件同“(2)”，以不同转速进行悬浮培养，第1种:80r/min，第2种:120r/min，均在37℃培养72h后，取样计数并观察细胞形态。
80r/min转速培养ST细胞，细胞聚团严重，细胞贴覆在罐壁和罐底的情况较多，而采用120r/min转速更有利于ST细胞的生长。
3.低血清全悬浮培养ST-1细胞在生物反应器中放大
细胞接种前一天，生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)细胞培养液(含2％新生牛血清)，通饱和空气过夜。用常规方法从液氮中复苏驯化好的ST-1悬浮细胞，经500～1000r/min进行离心，将细胞加入到250ml三角瓶内，加入0.5％～2％MEM悬浮培养液，将细胞密度调整为5×105/ml，置于37℃，120rpm在摇床内进行培养。细胞生长到1.2×106/ml以上即可进行传代培养，以此方法进行放大培养。待细胞培养体积达到200ml时，可以将悬浮细胞转至3L生物反应器中进行培养。依此将细胞转入10L、30L生物反应器中，摸索细胞生长的最佳条件。将pH分别设定为7.0±0.1，溶氧量设定为40％、80％，观察在两种情况下低血清悬浮细胞ST-1在生物反应器中的增殖情况。溶氧量为40％与80％时，最高细胞密度均大于2.0×106/ml，且活力均能达到90％以上，二者相差不大。因此，选择40％溶氧量作为ST细胞全悬浮培养通气量。试验结果见表2。
表2 ST-1悬浮细胞在各反应器中生长试验结果
从ST细胞驯化过程可以看出，该细胞在贴壁阶段血清含量由10％降至低血清水平(0.5％～2％)，细胞的数量和活力均能达到实验要求。而从贴壁到悬浮，通过39代的驯化培养，细胞才能适应悬浮培养状态，并能稳定增值到1.2×106/ml，细胞活力达到90％以上。通过对全悬浮培养条件(pH、转速)的工艺优化，确定了pH7.0±0.1、转速120r/min，实现了ST细胞从三角培养瓶到生物反应器的扩大培养，并对生物反应器中的溶氧量进行了改进，从而完成了ST细胞从贴壁到全悬浮的整个驯化过程，并将驯化成功后的悬浮细胞命名为猪睾丸细胞系(Porcine testis)悬浮适应株(简称ST-1株)。该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12698。
实施例2
——适应全悬浮培养的ST细胞株的扩增培养
将液氮保存的猪睾丸细胞悬浮适应株ST-1复苏传代培养，后接种到生物反应器中进行全悬浮放大培养，得到ST-1细胞悬浮培养液。具体步骤如下：
1.取液氮冻存的ST-1细胞株，快速复苏后加入装有培养液的摇瓶中，于36～37℃培养60～72h，按照1:3～1:5的比例传代放大培养；
2.细胞接种前一天，生物反应器中打入800ml(800ml/1000ml)培养基(含2％新生牛血清)，通饱和空气过夜。
3.细胞接种：细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.1，培养温度为36～37℃，转速120r/min，溶氧量为40％，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用200ml(200ml/1000ml)培养基回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养。
实施例3
——ST细胞全悬浮生产猪伪狂犬病疫苗的工艺
1.生产用毒种制备取生长良好的ST细胞单层，弃去生长液，换以含1％～5％毒种的维持液，置34～35℃继续培养，待80％左右的细胞出现典型CPE时收获。定量分装，注明收获日期、毒种代数等，冷冻保存。
2.制苗用毒液的繁殖
(1)细胞生物反应器清洗、灭菌：将细胞生物反应器清洗干净，121℃灭菌30min。
(2)细胞接种：在摇瓶中悬浮培养扩增ST-1细胞，达到一定密度1.2×106/ml后，接种入生物反应器，细胞培养条件为：反应器工作体积30L，细胞接种前矫正溶氧电极，通CO2调整pH至7.0±0.2，培养温度为36～37℃，溶氧量为40％，取需要量的摇瓶细胞(密度约1.2×106/ml)离心后，用细胞培养液回悬后接入生物反应器中进行悬浮培养，连续培养2～3日。
(3)接毒及收获：待ST-1细胞全悬浮培养至密度约1.2×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，1/3换1％～2％新生牛血清的MEM(低血清)病毒培养维持液，并按照病毒培养维持液培养基终体积的1％～5％接种猪伪狂犬病毒HZ株，病毒培养条件为温度33～35℃，pH值为7.0±0.2，溶氧为40％，待80％左右的细胞出现典型CPE时收获并撤罐。共生产3批病毒液。
3.半成品检验
(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥106.8TCID50。
4.配苗及分装将检验合格的病毒液与适宜保护剂按一定比例混合均匀后，定量分装。每头份疫苗含猪伪狂犬病病毒≥106.5TCID50。
5.冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。
实施例4
——猪伪狂犬病疫苗成品检验
1.性状微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。
3.支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。
4.外源病毒检验将疫苗与猪伪狂犬病病毒特异性抗血清中和后，接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无外源病毒污染。
5.鉴别检验
(1)血清中和试验将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合，经37℃中和1小时后，接种已长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板，共接种12孔，每孔100μl。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID50/0.1ml，与等量培养液混合)和正常细胞对照组，各接种6孔，每孔100μl。每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100μl。将细胞培养板置37℃、含5％CO2培养箱中培养，观察96～120小时。中和组和细胞对照组未出现CPE，不中和对照组全部出现CPE。
(2)病毒基因鉴定采用基因鉴定PCR检测法，用扩增gB基因的引物(序列1、2)进行PCR检测，均扩增出大小约为600bp的特异性条带。
用扩增gE基因的引物(序列3、4)进行PCR检测，均扩增不出大小约为298bp的特异性条带。
扩增gB基因的引物：gB-P1:5’-GGATCCGCGCACGTGAACGACAT-3’23(序列1)；gB-P2:5’-AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT-3’24(序列2)。扩增片段大小为600bp。
扩增gE基因的引物：gE-P1:5’-GCCCACGCACGAGGACTACTACGA-3’24(序列3)；gE-P2:5’-TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAG-3’24(序列4)。扩增片段大小为298bp。
6.安全检验用3～4周龄健康易感仔猪5头，每头肌肉接种疫苗10头份，观察14日，仔猪全部健活。
7.效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后，免疫5头3～4周龄健康易感仔猪，每头肌肉接种毒种1头份，同时设对照仔猪5头。免疫后21日，连同对照猪用猪伪狂犬病病毒S12株强毒(106.5TCID50/ml)攻毒，每头滴鼻2ml、肌肉注射2ml，攻毒后观察10日。结果对照猪全部发病，免疫猪全部保护。
8.真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均为紫色辉光。
9.剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，均低于4％。
序列表
<110>齐鲁动物保健品有限公司
<120>一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
<130>
<160>6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213>扩增gB基因的引物gB-P1
<400> 1
GGATCCGCGCACGTGAACGACAT 23
<210>2
<211> 24
<212> DNA
<213>扩增gB基因的引物gB-P2
<400>2
AAGCTTGAGCGCGTGCAGCTGGTT 24
<210>3
<211> 24
<212> DNA
<213>扩增gE基因的引物 gE-P1
<400>3
GCCCACGCACGAGGACTACTACGA 24
<210>4
<211> 24
<212> DNA
<213>扩增gE基因的引物 gE-P2
<400>4
TTAAGCGGGGCGGGACATCAACAG 24。
1

Claims (5)

1.一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于其制备方法包括细胞培养、更换细胞培养液并接毒和收获工序，即先将ST细胞用摇瓶进行悬浮培养扩增后接入生物反应器进行悬浮培养，当细胞生长至病毒接种密度后更换一部分细胞培养液并接入病毒种子液，在生物反应器内继续培养至结束后收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成。
2.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述更换细胞培养液并接毒工序为使用ST细胞在生物反应器中悬浮培养至可接毒状态时，将细胞培养液的1/3换成新的细胞培养液，并接种猪伪狂犬病病毒。
3.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病病毒的方法，其特征在于所述方法具体为：
(1)将ST细胞用摇瓶悬浮培养48h～72h后离心，用细胞培养液将经离心的细胞重悬后以密度3×105～3×106/ml接入生物反应器，进行ST细胞全悬浮培养；
(2)待ST细胞全悬浮培养至密度为6×105/ml～6×106/ml，生物反应器15℃沉降2小时，泵出上层1/3的原培养液注入新的细胞培养液，并按照体积比1％～5％接种伪狂犬病病毒种毒；
(3)在生物反应器中继续培养悬浮细胞，待80％左右的细胞出现典型CPE时，收获病毒液，加入适宜的冻干保护剂混匀后分装、经冷冻真空干燥制成疫苗。
4.如权利要求1-3所述一种使用全悬浮技术生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的病毒为保藏号为CGMCC No.11912的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)HZ株。
5.如权利要求1所述一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病的方法，其特征在于所述ST细胞株，是由猪睾丸传代细胞系(ST细胞系)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和低血清培养液悬浮驯化过程而获得，该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(Porcine testis)悬浮适应株，简称ST-1株。该株细胞已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12698。
CN201710082116.8A 2017-02-15 2017-02-15 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法 Pending CN106867973A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710082116.8A CN106867973A (zh) 2017-02-15 2017-02-15 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710082116.8A CN106867973A (zh) 2017-02-15 2017-02-15 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106867973A true CN106867973A (zh) 2017-06-20

Family

ID=59167327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710082116.8A Pending CN106867973A (zh) 2017-02-15 2017-02-15 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106867973A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295138A (zh) * 2019-07-25 2019-10-01 北京鼎持生物技术有限公司 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法
CN110564698A (zh) * 2019-09-29 2019-12-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112352A (zh) * 2015-07-13 2015-12-02 郑州爱科生物科技有限公司 一株适应全悬浮培养的st细胞及其应用和培养疫苗病毒的方法
CN105903011A (zh) * 2016-06-01 2016-08-31 齐鲁动物保健品有限公司 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN106237324A (zh) * 2016-08-30 2016-12-21 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112352A (zh) * 2015-07-13 2015-12-02 郑州爱科生物科技有限公司 一株适应全悬浮培养的st细胞及其应用和培养疫苗病毒的方法
CN105903011A (zh) * 2016-06-01 2016-08-31 齐鲁动物保健品有限公司 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN106237324A (zh) * 2016-08-30 2016-12-21 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295138A (zh) * 2019-07-25 2019-10-01 北京鼎持生物技术有限公司 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法
CN110564698A (zh) * 2019-09-29 2019-12-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法
CN110564698B (zh) * 2019-09-29 2021-03-16 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种利用悬浮细胞系制备塞内卡病毒的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108904796B (zh) 兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN110093307A (zh) 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法
CN108220221A (zh) 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法
CN101869702B (zh) 以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法
CN108220227A (zh) 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN102690791A (zh) 应用生物反应器微载体培养st细胞生产猪伪狂犬病病毒的方法
CN107460156A (zh) 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用
CN105969737B (zh) 一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法
CN109913404A (zh) 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN105274064B (zh) 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用
CN104587460A (zh) 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用
CN110368490B (zh) 貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法
CN107823639B (zh) 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
CN106867973A (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
CN108421037A (zh) 一种猪伪狂犬病/猪细小病毒病二联灭活疫苗及其悬浮培养制备方法
CN105838683A (zh) 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法
CN105903011B (zh) 一种猪伪狂犬病活疫苗及其制备方法
CN105535958B (zh) 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗
CN109207436A (zh) 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用
CN103285385A (zh) 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法
CN106237324A (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN106367399B (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法
CN108635574A (zh) 一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品
CN106267181B (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪瘟疫苗的方法
CN106318899B (zh) 一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170620

RJ01 Rejection of invention patent application after publication