CN110295138A - 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法 - Google Patents

一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110295138A
CN110295138A CN201910677727.6A CN201910677727A CN110295138A CN 110295138 A CN110295138 A CN 110295138A CN 201910677727 A CN201910677727 A CN 201910677727A CN 110295138 A CN110295138 A CN 110295138A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
cell
vaccine
porcine pseudorabies
pseudorabies virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910677727.6A
Other languages
English (en)
Inventor
侯野
李俊峰
张乾顺
韩丹
邓志平
宋春雨
宋瑞卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liaoning Yishengke Biotechnology Co ltd
Zhuhai Dingan Biological Products Co ltd
Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Liaoning Yishengke Biotechnology Co ltd
Zhuhai Dingan Biological Products Co ltd
Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liaoning Yishengke Biotechnology Co ltd, Zhuhai Dingan Biological Products Co ltd, Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd filed Critical Liaoning Yishengke Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910677727.6A priority Critical patent/CN110295138A/zh
Publication of CN110295138A publication Critical patent/CN110295138A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16751—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种全悬浮细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，属于生物医学技术领域，包括以下步骤：ST单层细胞驯化培养，猪伪狂犬病毒种毒直接接种于ST悬浮细胞培养，可在生物反应器进行扩大培养，收获的培养物，培养至猪伪狂犬病毒活疫苗增殖速度稳定、可控性强、操作简单、不需要载体等一系列优势。培养后，病毒含量每1ml≥109.5TCID50；培养至细胞病变达85％以上时收获病毒液，即得。本发明将猪伪狂犬病毒毒直接接种于经贴壁驯化后ST悬浮细胞培养，有效增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性、连续性与安全性，得到的悬浮毒每1ml病毒含量≥109.5TCID50。

Description

一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法
技术领域
本发明专利涉及生物医学技术领域，具体涉及一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法。
背景技术
猪伪狂犬病是由猪的伪狂犬病病毒Pseudorabies virus,PRV引起的一种猪急性传染病。猪狂犬病病毒可以感染不同年龄段的猪,但以哺乳仔猪和妊娠母猪感染最为严重，导致妊娠母猪流产、木乃伊胎和死胎哺乳仔猪出现神经症状麻痹、衰竭死亡死亡率几乎100％。
我国于上世纪60～70年代从匈牙利引进了PRvBartha-K61株,该病毒株是公认的优良疫苗株。ST细胞，即猪睾丸细胞,属于成纤维细胞体外可连续传代贴壁培养,该细胞系对多种病毒敏感，如：猪细小病毒、猪伪狂犬病毒猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等,是疫苗生产中繁殖病毒的主要原辅材料之一ST细胞培养是病毒类疫苗生产的关键工艺环节，直接影响到疫苗的质量，如何稳定获得足量的细胞对于保证生产能力和产品质量尤为重要。
目前兽用病毒类疫苗生产中使用最为普遍是使用转瓶培养ST细胞培养的方法，优势是工艺简单、成本低廉,而劣势是，生产效率低、劳动强度高、产品均一度差等问题一直很难从根本上得以解决。由于转瓶培养的一系列弊端,悬浮培养开始应用于生产实际之中。ST细胞悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员,培养需求面积小、污染小成本低等优点，且避免了外源病原污染，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。
目前悬浮培养应用主要是全悬浮培养。全悬浮培养在兽用疫苗方面,率先应用于口蹄疫疫苗的生产，之后悬浮培养工艺在生物制药行业引发一定的效应,疫苗生产企业越来越关注新工艺，现有ST全悬浮细胞培养大多使用含有牛胎血清的培养基进行培养，由于牛胎血清本身价格较高，必然会带来生产成本的高昂，还有血清中的蛋白遗留物或遗留的外源病毒会对培养的病毒产生污染，影响最后疫苗生产的质量。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，是将猪伪狂犬病毒种毒直接接种于ST全悬浮细胞进行培养，ST全悬浮细胞使用无牛胎血清的培养基进行培养，解决了猪圆环病毒疫苗大规模细胞培养的批间差、病毒污染等一系列问题。所述方法为：
(a)驯化ST单层细胞，由含血清培养基培养至无血清培养基培养；继续驯化培养ST单层细胞，使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养；；
(b)取细胞状态良好并经驯化后ST悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养，一般，放大体系为20ml至50ml至100ml至150ml，摇瓶培养阶段最大培养体系不得超过150ml/瓶，待细胞状态稳定，生长良好后接种于2L～8L的生物反应器中进行预培养，随后根据细胞状态，生长情况，逐步放大培养直至终级反应器；
(c)待终级反应器细胞密度达到5.0×106.0～1.2×107.0cells/ml，同时细胞状态稳定，调整反应器细胞密度，使其达到2.5×106.0～6.0×106.0cells/ml，按接种量为1％-5％或按照MOI感染复数10-4～10-6直接接入猪伪狂犬病毒，培养至每0.1ml猪伪狂犬病毒含量≥108.5TCID 50，细胞病变达80％以上时收获病毒液；
(d)将收获的病毒液进行纯化、灭活后得灭活疫苗，得到疫苗半成品，将所述疫苗半成品加入适宣的冻干保护剂混匀后分装、经冷冻真空干燥制成疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。
进一步的，所述步骤(a)中驯化ST单层细胞由含血清培养基培养至无血清培养基培养的方法为：
贴壁ST细胞用胎牛血清含量为7～10％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
用胎牛血清含量为4～6％的1640/D42培养基连续传代培养4次；
用胎牛血清含量为1～2％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中1640/D42培养基的胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养6次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中1640/D42培养基的胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
进一步的，所述步骤(a)中驯化培养ST单层细胞使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养的方法为，取无血清传代培养的ST细胞使用胰酶消化后低速离心，得到的ST细胞用无血清培养基以转速为40-60r/min进行摇床培养，培养过程中测定葡萄糖含量，当低于1～1.5g/L进行换液或补加葡萄糖，待细胞生长良好、生长速率稳定后进行传代培养，每次传代前调整细胞密度为0.45×106～0.65×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的ST细胞株，命名为ST-S细胞株。
进一步的，所述步骤(b)中摇瓶扩大培养的条件参数为：转速100～180转/分、温度36.5±1℃、溶氧40％～70％、pH7.1±0.2。
进一步的，所述步骤(a)中驯化培养ST单层细胞使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养的过程中，传代的次数≥4次，每代的生长时间不低于72小时，每次传代后要提高转速，每次提高的转速不超过30转/分，最高转速为180转/分。
进一步的，所述猪伪狂犬疫苗为活疫苗，所述猪伪狂犬病毒为Bartha-K61株，但包括且不限于此毒株。
本发明进一步规范了猪伪狂犬疫苗的生产规范，能够最大程度使疫苗生产更加的，规范、安全、高效、低成本的生产猪伪狂犬疫苗，最重要的减少了加入血清所产生的一系列安全性及操作多等缺点与不足，减少不必要操作与成本，通过使用驯化的ST悬浮细胞培养猪伪狂犬病毒不仅解决了血清蛋白遗留物和外源病毒污染等一系列问题，而且培养的病毒免疫原性更为稳定及持久。
附图说明
图1是本发明经减低血清含量ST细胞状态图
图2是本发明ST细胞初上摇瓶细胞状态图
图3是本发明经完全驯化后ST细胞状态图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明专利做进一步的说明。
实施例中提及的无血清培养基均购自北京鼎持生物有限公司及壹生科(深圳)有限公司。D42培养基成分复杂，含有多种微量元素及细胞生长必要元素，和购自为赛默飞世尔(gibco)1640以1：1结合，称为1640/D42培养基，为市售产品。
ST细胞由北京鼎持生物有限公司从ATCC引进，引进时间：2016年08月，ATCC编号：CCL-34，代次：P17，保存号：58766746。
该株细胞被命名为猪睾丸细胞系(porcine testis)悬浮适应株,简称ST-S株。该株细胞已于2019年07月04送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC NO.18183。。
使用的猪伪狂犬病毒为Bartha-K61株，本发明涉及到的猪伪狂犬病病毒购自：中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
1、ST细胞驯化
使用含10％的进口胎牛血清的1640/D42培养液复苏ST冻存贴壁细胞，待细胞生长致密后进行传代。
传代后，挑选形状良好且生长良好的细胞，逐步进行驯化培养，具体步骤如下：
用进口胎牛血清含量为6％的1640/D42培养基连续传代培养4次；
用进口胎牛血清含量为2％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为2％，连续传代培养6次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次，得适应无血清培养基的ST细胞。
将无血清培养基贴壁培养的ST细胞经消化、离心，得到ST细胞悬液，调整初始细胞密度为0.8×106cells/ml、转速设定为25r/min、温度设定为37℃、CO2含量5％，进行摇床培养，适时测定培养基的葡萄糖含量，低于1g/L进行离心换液操作。
待细胞比生长速率及细胞状态稳定后，每培养72H后进行传代，每次传代前需将密度调整为约0.5×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，第一次提高转速20r/min至45r/min，再提高转速25r/min至70r/min，每次提高转速后，需进行适应培养4代，最终将转速提高到170r/min；
将转速提高到170r/min后，需进行连续传代5次，保证细胞的稳定性及适应性，即可得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的ST细胞株，细胞被命名为猪睾丸细胞系(porcine testis)悬浮适应株,简称ST-S株；
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮ST细胞培养72小时可达到峰值1.2×107cells/ml左右，曲线特征为近“S”型曲线，72小时后细胞进入衰退期，细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间45小时。可见，本发明培养得到的无血清全悬浮培养ST细胞性能优异。
2、全悬浮培养ST细胞的扩大培养
取经过上述步骤驯化得到悬浮ST细胞，置于摇瓶培养，转速160转/分、温度37±1℃、CO25％，培养72H后，待细胞密度达到1.0×107cells/ml左右时，进行离心后，弃去上清，使用无血清培养基进行重悬，进行扩增培养，逐级放大，放大体系为20ml至50ml至100ml至150ml逐级进行，每次放大细胞密度不得低于0.55×106cells/ml，，达到生物反应器的接种要求时，接种于10L生物反应器进行悬浮培养，随后进行逐级放大培养直至最终200L生物反应器，生物反应器中培养参数为：转速120转/分、pH值7.2±0.2、溶氧60％、温度37±0.5℃。
3、接种猪伪狂犬种毒
待最终生物反应器细胞密度达到1.2×107.0cells/ml时，调整细胞密度使细胞密度调整为6.0×106.0cells/ml，按照MOI感染复数10-4直接接入猪伪狂犬种毒，所述猪伪狂犬种毒效价不低于每1ml病毒含量≥108.5TCID50，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于每1ml病毒含量≥109.5TCID50,细胞病变达80％以上时收获病毒液。
4、制作疫苗成品
将按照上述方法制备的病毒液采用β-丙内酯灭活，之后加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成，即可得到疫苗成品。
按照上述实例重复进行5次操作，猪伪狂犬病毒均可达到预期结果，结果情况如表1所示。
表1实施例1猪伪狂犬SS株测毒结果
实施例2
1、ST细胞驯化
使用含7％的进口胎牛血清的1640/D42培养液复苏ST冻存贴壁细胞，待细胞生长致密后进行传代。
传代后，挑选形状良好且生长良好的细胞，逐步进行驯化培养，具体步骤如下：
用进口胎牛血清含量为4％的1640/D42培养基连续传代培养4次；
用进口胎牛血清含量为1％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为1％，连续传代培养6次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为1％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次，得适应无血清培养基的ST细胞。
将无血清培养基贴壁培养的ST细胞经消化、离心，得到ST细胞悬液，调整初始细胞密度为0.8×106cells/ml、转速设定为25r/min、温度设定为37℃、CO2含量5％，进行摇床培养，适时测定培养基的葡萄糖含量，低于1g/L进行离心换液操作。
待细胞比生长速率及细胞状态稳定后，每培养72H后进行传代，每次传代前需将密度调整为约0.45×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，第一次提高转速30r/min至55r/min，再提高转速30r/min至85r/min，每次提高转速后，需进行适应培养4代，最终将转速提高到160r/min；
将转速提高到160r/min后，需进行连续传代5次，保证细胞的稳定性及适应性，即可得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的ST细胞株；
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮ST细胞培养72小时可达到峰值1.2×107cells/ml左右，曲线特征为近“S”型曲线，72小时后细胞进入衰退期，细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间40小时。可见，本发明培养得到的无血清全悬浮培养ST细胞性能优异。
5、全悬浮培养ST细胞的扩大培养
取经过上述步骤驯化得到悬浮ST细胞，置于摇瓶培养，转速160转/分、温度37±1℃、CO25％，培养72H后，待细胞密度达到1.0×107cells/ml左右时，进行离心后，弃去上清，使用无血清培养基进行重悬，进行扩增培养，逐级放大，放大体系为20ml至50ml至100ml至150ml逐级进行，每次放大细胞密度不得低于0.45×106cells/ml，，达到生物反应器的接种要求时，接种于10L生物反应器进行悬浮培养，随后进行逐级放大培养直至最终200L生物反应器，生物反应器中培养参数为：转速120转/分、pH值7.2±0.2、溶氧40％、温度37±0.5℃。
6、接种猪伪狂犬种毒
待最终生物反应器细胞密度达到8.0×106.0cells/ml时，调整细胞密度使细胞密度调整为4.0×106.0cells/ml，按照MOI感染复数10-1直接接入猪伪狂犬种毒，所述猪伪狂犬种毒效价不低于每1ml病毒含量≥108.5TCID50，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于每1ml病毒含量≥109.5TCID50,细胞病变达80％以上时收获病毒液。
7、制作疫苗成品
将按照上述方法制备的病毒液采用β-丙内酯灭活，之后加入适宜的冻干保护剂混匀分装后经真空冻干而成，即可得到疫苗成品。
按照上述实例重复进行5次操作，猪伪狂犬病毒SS株均可达到预期结果，结果情况如表2所示。
表2实施例2猪伪狂犬SS株测毒结果
实施例3
1、将实施例1、实施例2制得的疫苗本成品按照《中国兽药典》附录进行检验，得结果；
(1)无菌生长；
(2)病毒含量每毫升病毒含量均≥109.5TCID50；
2、将实施例1、实施例2制得的疫苗本成品按照《中国兽药典》附录进行检验，得结果：
(1)性状微黄白色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解；
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,均无菌生长；
所述方法如下：
将冻干制品恢复原量直接接种硫乙醇酸盐培养基(TG)小管、酪胨琼脂(GA)斜面各2支,每支0.2ml,1支置37℃,1支置25℃,另用1支GP小管,接种0.2ml,置25℃,
均培养7日,应无菌生长。
(3)支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,均无支原体生长；
所述方法如下(以下两种方法都需进行检验)：
1.将冻干制品恢复原量取疫苗5.0ml接种装有20ml液体培养基的小瓶,播匀后,再从小瓶中取0.4ml移植到含有1.8ml培养基的2支小管(1.0cm×10cm),每支各接种0.2ml,将小瓶与小管置37℃培养,分别于接种后5日、10日、15日从小瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内,每日观察培养物有无颜色变黄或变红,如果无变化,则在最后一次移植小管培养、观察14日后停止观察。在观察期内,如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化,在原pH值变化达±0.5时,应立即将小瓶中的培养物移植于小管液体培养基和固体培养基,观察在液体培养基中是否出现恒定的pH值变化,及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落
2 琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时,取培养物0.2m接种琼脂平板,置含5％-10％二氧化碳潮湿的环境、37℃下培养。在液体培养基颜色出现变化,在原pH值变化达±0.5时,也同时接种琼脂平板。每3～5日,在低倍显微镜下,观察检查各琼脂平板上有无原体菌落出现,经14日观察,仍无菌落者时,停止观察
(4)外源病毒检验将疫苗与猪伪狂犬病病毒特异性扰血清中和后,接种Vero细胞、MDBK细胞、ST细胞单层,按现行《中国兽药典》附录进行检验,均无外源病毒污染。所述方法如下：
取样品至少1.0ml接种到已长成良好单层的上述细胞,另至少设一瓶正常细胞对照,每一种细胞总培养时间应不少于14日。培养期间细胞培养物应至少继代1次。最后一次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。
在14日的培养期内,要对细胞培养物进行常规检查,如果培养期间出现细胞病变,则判为不符合规定。如无细胞病变,培养结束时,细胞单层应按下述方法进行检验。检查方法取最后一次继代的细胞单层应培养5～7日后用于荧光抗体检査。对每一种特定外源病毒的检验应至少包含三组细胞单层:(1)被检样品细胞培养物；(2)在最后一次继代时接种100～300FAID特定病毒的阳性对照；(3)正常细胞对照。每一组细胞单层检面积应不小于6.0cm2
3、血清中和试验将疫苗稀释至200TCID0.1ml,与等量1:10稀释的猪伪狂犬病病毒特异性抗血清混合,经37℃中和1小时后,接种己长成单层的ST细胞96孔微量细胞培养板,共接种12孔,每孔100u1。同时设不中和对照组(将疫苗稀释至200TCID0/0.1m1,与等量培养液混合)和正常细胞对照组,各接种6孔,每孔100u1每孔补加含2％新生牛血清的细胞培养液100ul将细胞培养板置37℃、含5％02培养箱中培养,观察96-120小时。中和组和细胞对照组未出现CPE,不中和对照组全部出现CPE。
4、安全检验用3～4周龄健康易感仔猪10头,分两组分别每头肌肉接种疫苗10头份,观察14日,仔猪全部健活。
5、效力检验将疫苗稀释至1头份/ml后,免疫5头3～4周龄健康易感仔猪,每头肌肉接种毒种1头份,同时设对照仔猪5头,免疫后21日,连同对照猪用猪伪狂犬病病毒强毒(含1000LD50)攻毒,每头滴鼻2ml、肌肉注射2m1,攻毒后观察10日结果对照猪全部发病,免疫猪全部保护。
6、真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定,均为紫色辉光。
7、剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定,均不得高于4％。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

Claims (6)

1.一种全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)驯化ST单层细胞，由含血清培养基培养至无血清培养基培养；继续驯化培养ST单层细胞，使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养；使猪伪狂犬病毒适应全悬浮培养环境下的ST细胞培养；
(b)取细胞状态良好并经驯化后ST悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养，待细胞状态稳定，生长良好后接种于2L～8L的生物反应器中进行预培养，随后根据细胞状态，生长情况，逐步放大培养直至终级反应器；
(c)待终级反应器细胞密度达到5.0×106.0～1.2×107.0cells/ml，同时细胞状态稳定，调整反应器细胞密度，使其达到2.5×106.0～6.0×106.0cells/ml，按接种量为1％-5％或按照MOI感染复数10-4～10-6直接接入猪伪狂犬病毒，培养至每0.1ml猪伪狂犬病毒含量≥108.5TCID50，细胞病变达80％以上时收获病毒液；
(d)将收获的病毒液进行纯化、灭活后得灭活疫苗，得到疫苗半成品，将所述疫苗半成品加入冻干保护剂混匀后分装，经冷冻真空干燥制成疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。
2.根据权利要求1所述的全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中驯化ST单层细胞由含血清培养基培养至无血清培养基培养的方法为：
贴壁ST细胞用胎牛血清含量为7～10％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
用胎牛血清含量为4～6％的1640/D42培养基连续传代培养4次；
用胎牛血清含量为1～2％的1640/D42培养基连续传代培养2次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中1640/D42培养基的胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养6次；
使用1640/D42培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中1640/D42培养基的胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
3.根据权利要求2所述的全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中驯化培养ST单层细胞使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养的方法为，取无血清传代培养的ST细胞使用胰酶消化后低速离心，得到的ST细胞用无血清培养基以转速为40-60r/min进行摇床培养，培养过程中测定葡萄糖含量，当低于1～1.5g/L进行换液或补加葡萄糖，待细胞生长良好、生长速率稳定后进行传代培养，每次传代前调整细胞密度为0.45×106～0.65×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的ST细胞株。
4.根据权利要求3所述的全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(b)中摇瓶扩大培养的条件参数为：转速100～180转/分、温度36.5±1℃、溶氧40％～70％、pH7.1±0.2。
5.根据权利要求4所述的全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中驯化培养ST单层细胞使其由贴壁培养驯化至全悬浮培养的过程中，传代的次数≥4次，每代的生长时间不低于72小时，每次传代后要提高转速，每次提高的转速不超过30转/分，最高转速为180转/分。
6.根据权利要求1-5任一所述的全悬浮ST细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法，其特征在于，所述猪伪狂犬疫苗为活疫苗，所述猪伪狂犬病毒为Bartha-K61株，但包括且不限于此毒株。
CN201910677727.6A 2019-07-25 2019-07-25 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法 Pending CN110295138A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910677727.6A CN110295138A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910677727.6A CN110295138A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110295138A true CN110295138A (zh) 2019-10-01

Family

ID=68031875

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910677727.6A Pending CN110295138A (zh) 2019-07-25 2019-07-25 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110295138A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106867973A (zh) * 2017-02-15 2017-06-20 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
CN107142249A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 广东渔跃生物技术有限公司 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
CN108239625A (zh) * 2016-12-23 2018-07-03 甘肃健顺生物科技有限公司 悬浮bhk21细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术
CN108359632A (zh) * 2018-03-30 2018-08-03 吉林冠界生物技术有限公司 Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用
CN110093307A (zh) * 2019-04-11 2019-08-06 北京鼎持生物技术有限公司 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108239625A (zh) * 2016-12-23 2018-07-03 甘肃健顺生物科技有限公司 悬浮bhk21细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺技术
CN106867973A (zh) * 2017-02-15 2017-06-20 齐鲁动物保健品有限公司 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
CN107142249A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 广东渔跃生物技术有限公司 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
CN108359632A (zh) * 2018-03-30 2018-08-03 吉林冠界生物技术有限公司 Mdck细胞系、复制病毒的方法及其应用
CN110093307A (zh) * 2019-04-11 2019-08-06 北京鼎持生物技术有限公司 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张妍等: ""细胞悬浮培养技术生产疫苗的研究进展"", 《中国家禽》 *
彭丽英等: ""猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖的研究"", 《上海农业学报》 *
曾显成: ""猪伪狂犬病病毒FZ毒株的分离鉴定及gD基因的克隆"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
林群群: ""猪伪狂犬病毒分离鉴定及宿主天然免疫应答的初步研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
白丽丽等: ""伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析"", 《中国动物检疫》 *
陈文庆等: ""悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析"", 《中国兽药杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104258385B (zh) Bhk-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用
CN108904796B (zh) 兔出血症病毒杆状病毒载体、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗及其制备方法
CN108220221A (zh) 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法
CN108441446A (zh) 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用
CN105969737B (zh) 一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法
CN110237246A (zh) 一种全悬浮细胞培养禽流感(h9)灭活疫苗的方法
CN109913404A (zh) 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN104056265B (zh) 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法
CN105274064B (zh) 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用
CN105664150B (zh) 一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗
CN102000328B (zh) 一种利用细胞工厂生产鸡马立克氏病疫苗的方法
CN102038942A (zh) 应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法
CN102002481B (zh) 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法
CN105838683A (zh) 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法
CN108421037A (zh) 一种猪伪狂犬病/猪细小病毒病二联灭活疫苗及其悬浮培养制备方法
CN102727877A (zh) 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（jxa1-r株）的方法及其应用
CN102038944B (zh) 应用生物反应器工业化生产猪瘟活疫苗的方法
CN110241089A (zh) 一种全悬浮细胞培养生产猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的方法
CN110295138A (zh) 一种全悬浮st细胞直接培养猪伪狂犬病毒疫苗的方法
CN109402068A (zh) 一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法
CN101380470B (zh) 一种猪细小病毒活疫苗
CN107496913A (zh) 猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法
CN106237324A (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN104740627B (zh) 一种兽用伪狂犬弱毒活疫苗的规模化生产方法
CN106367399B (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪细小病毒病疫苗的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination