CN108635574A - 一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 - Google Patents

一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品，该方法包括以下步骤：用EB66传代细胞分别接种鸭坦布苏、禽流感病毒株；在病毒ELD50或EID50效价达到最高时分别收获鸭坦布苏、禽流感病毒并保存；分别灭活鸭坦布苏、禽流感病毒；将灭活后的鸭坦布苏和禽流感病毒在吐温‑80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗。本发明通过采用EB66传代细胞系分别进行鸭坦布苏和禽流感病毒的培养，然后制备成的鸭坦布苏、禽流感二联疫苗具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、产量和质量显著提高等优点。

Description

一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体地，涉及一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品。
背景技术
鸭坦布苏病毒病(DuckTembusuVirusStrain)，也称蛋鸭黄病毒病，是由黄病毒科鸭坦布苏病毒引起的一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病。该病自2010年在我国发现以来，广泛传播，各省种蛋鸭养殖区每年均有发生。该病从最初的夏季产蛋高峰期爆发发展至现在的不定期发生，呈现出了一种无规律的变化，对种蛋鸭养殖业危害极大造成严重的经济损失。
禽流感(H9亚型)(AvainInfluenzaH9subtype)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征，鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽鸡野鸟、水禽等均可被感染。H9亚型禽流感病毒(H9AIV)一般呈低至中等毒力，但它分布广泛、能造成鸭的免疫抑制进而引发与其它鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可引起产蛋率的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害也不可忽视。
鸭坦布苏病毒病禽和流感(H9亚型)是鸭业养殖中的高发病，对于这两种病的防控，目前尚无特效药物和疗法，主要是通过疫苗免疫措施进行预防和控制。目前，国内外已有上市的禽流感(H9亚型)、鸭坦布苏单一传统疫苗，却未有相关联苗。因此进行免疫防控时，需进行多次注射，给鸭群带来多次应激同时，工作量大大增加。目前，鸭坦布苏和禽流感疫苗的研制主要是采用传统的以鸡胚、鸭胚、转瓶培养细胞作为病毒扩繁和抗原制备材料，该方法虽然工艺成熟，技术要求低，但是劳动强度大，生产效率低下，并且存在因使用鸡胚和鸭胚制苗带来外援病毒污染的风险，疫苗批间差异大，质量不稳定，与当前利用动物细胞纯悬浮大规模培养制备疫苗的方法不相适应，因此寻求一种禽流感、坦布苏病毒受体丰度高，无致瘤，无外源病毒污染且可实现大规模无血清纯悬浮培养的传代细胞系用于制备安全高效的联苗成为一种趋势，利用相同的工艺和培养载体(细胞)培养2种或多种疫苗毒显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，包括以下步骤：(1)用EB66传代细胞分别接种鸭坦布苏、禽流感病毒株；(2)在病毒ELD50或EID50效价达到最高时分别收获鸭坦布苏、禽流感病毒并保存；(3)分别灭活鸭坦布苏、禽流感病毒；(4)将灭活后的鸭坦布苏和禽流感病毒在吐温-80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗。
优选地，步骤(1)的具体操作步骤如下：采用无血清培养基，通过悬浮培养法对EB66细胞进行传代培养，获取EB66传代细胞；利用EB66传代细胞分别接种鸭坦布苏、禽流感病毒株后，分别进行吸附培养，然后补加原工作体积1～2倍的无血清培养基，其中禽流感病毒株的培养需要补加TPCK胰酶，TPCK胰酶的补加策略为在接毒后第0天和第1天各补加2mg/LTPCK胰酶或者在接毒后第0天一次性补加4mg/LTPCK胰酶。
优选地，吸附培养的培养时间为0.5h～2h，培养温度为33℃～35℃，搅拌速度为80rmp～120rmp。
优选地，吸附培养完成后，补加原工作体积1倍的无血清培养基。
优选地，TPCK胰酶的补加策略为在接毒后第0天和第1天各补加2mg/LTPCK胰酶。
优选地，步骤(3)的具体操作步骤如下：在病毒中加入甲醛溶液，充分搅拌下，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，37℃条件下灭活20小时。
优选地，步骤(4)的具体操作如下：(a)油相佐剂制备：取注射用白油和司本-80混合，搅拌混匀，灭菌，冷却后备用；(b病毒混合液制备：将灭活后的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，取混后的病毒液96份，加入灭菌冷却后的吐温-804份，在混合病毒液中充分搅拌至完全溶解，其中0.1ml病毒混合液中的鸭坦布苏病毒含量不低于105.0ELD50、禽流感病毒含量不低于107.0EID50；(c)乳化：在油相佐剂中缓慢加入病毒混合液，充分搅拌后乳化。
优选地，白油和司本-80的混合体积比为94:6。
优选地，油相佐剂与病毒混合液的混合体积比为3:2。
本发明还提供一种通过上述方法制备的鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗。
本发明采用EB66细胞进行鸭坦布苏病毒和禽流感病毒的培养，EB66细胞无致瘤性、无外援病毒污染，不仅避免了传统胚体制备疫苗含有外源病毒的风险，还消除了污染生态环境的隐患，安全性高。另外，采用无血清培养基进行鸭坦布苏病毒和禽流感病毒的全悬浮培养，培养过程中无需微载体和消化液，大大减少了产品杂质的引入，简化了产品的分离纯化过程，降低了生产难度，同时有效降低免疫后副反应的发生概率；并且培养工艺容易放大，可实现大规模培养，大大提高产量，降低了成本，解决了传统病毒培养劳动强度大，生产效率低下的缺陷。通过本发明提供的培养方法制备得到的病毒抗原纯净、质量稳定均一且安全。通过本发明的方法制备所得的鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗安全有效，质量稳定，针对国内鸭养殖业高发疫病中，鸭坦布苏和H9亚型禽流感混合感染的流行形势，提出了一个有效应对策略，并做到一次免疫同时防控两种疾病，大大减少了免疫防控人员的工作量和鸭群由于注射而产生应激反应的次数，具有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例采用的原料来源如下：
1.病毒：鸭坦布苏病毒GDST株，为肇庆大华农生物药品有限公司于广东某鸭场分离，由大华农公司鉴定、保存；禽流感病毒为A型禽流感病毒A/duck/Guangdong/QY株(H9亚型)(简称QY株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定和保存。
2.细胞系：EB66传代细胞系，由甘肃健顺生物科技有限公司提供；
3.无血清、化学界定培养基：CDEB66培养基(建顺DP210)，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
实施例1
EB66细胞的传代培养
从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的无血清培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上，在37℃下，将培养转速设置为150rpm，进行悬浮培养。每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产。将EB66细胞的细胞密度调整为0.5×106个/ml，接种至生物反应器(SartoriusBPlus)中，在37℃下，搅拌速度设置为120rpm，对EB66细胞进行培养。每天取样计数，并计算活率，当EB66传代细胞长至约8.0×106个/ml，活率在90％以上时，用于后续实施例中病毒的接种。
实施例2
鸭坦布苏病毒液的制备
在反应器中留600mL悬浮EB66传代细胞，按MOI为0.0001的接毒量接种鸭坦布苏病毒，接毒后搅拌速度调整为80rpm，吸附培养1h后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜无血清培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行ELD50的检测。当培养条件稳定时，收获的病毒的效价不107.0ELD50/0.1mL。
实施例3
禽流感病毒(H9亚型)液的制备
禽流感病毒按MOI为0.001接种EB66细胞，接毒后搅拌速度调整为80rpm，吸附培养1h后，补加1倍于原有生长培养基体积的新鲜无血清培养基，温度调整为33℃，pH设置为7.20±0.1继续培养，搅拌速度调整为120rpm；同时，接毒后的第0天和第1天各补加2mg/L的TPCK胰酶；并每隔12h取样，进行ELD50的检测，在病毒EID50最高时，收获病毒。当培养条件稳定时，收获的病毒的效价不低于108.0EID50/0.1mL。
实施例4
病毒液灭活与检验
将实施例2和实施例3收获的病毒液(将灭活前取出的病毒液进行病毒含量测定，每0.1ml中鸭坦布苏病毒含量不低于105.0ELD50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.0EID50)分别加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃条件下灭活20小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，期间不停搅拌。灭活后的病毒液置2～8℃保存。取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
实施例5
鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗制备
(1)油相制备：取注射用白油94份、司本-806份混合，随加随搅拌至混匀，121℃灭菌30分钟，冷却后备用。
(2)病毒混合液制备：将实施例4得到的灭活后的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，取混后的病毒液96份，加入灭菌冷却后的吐温-804份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。使0.1ml病毒混合液中鸭坦布苏病毒含量不低于105.0ELD50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.0EID50。
(3)乳化：取油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入病毒混合液2份，进行充分搅拌后乳化。
(4)分装：定量分装，加盖密封。
实施例6
疫苗免疫效力测定
(1)对鸭坦布苏的免疫保护
用7～14日龄健康易感鸭20只，10只颈部皮下注射实施例5所得鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗0.3ml，另外10只作为非免疫对照。21日后，每只鸭各肌肉注射GDST株病毒液1ml(含105.0ELD50)。攻毒后5日，剖检，进行免疫保护效力评价。
结果表明免疫组攻毒保护率为90％，对照组全部未保护。
(2)对禽流感(H9亚型)的免疫保护
用7～14日龄健康易感鸭20只，10只颈部皮下注射实施例5所得鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗0.3ml，另10只作禽流感攻毒对照。免疫后21日，每只鸭各静脉注射H9亚型禽流感病毒QY株病毒0.2ml(含2×107.0EID50)，攻毒后第5日，采集每只鸡喉头和泄殖腔棉拭子，进行病毒分离。
结果显示：表明免疫组鸭10只全部为病毒分离阴性，对照组鸭10只为病毒分离阳性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用EB66传代细胞分别接种鸭坦布苏、禽流感病毒株；
(2)在病毒ELD50或EID50效价达到最高时分别收获鸭坦布苏、禽流感病毒并保存；
(3)分别灭活鸭坦布苏、禽流感病毒；
(4)将灭活后的鸭坦布苏和禽流感病毒在吐温-80中完全混合，得到病毒混合液，在病毒混合液中加入已灭菌的油相佐剂，混合乳化，配制成鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗。
2.如权利要求1所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作步骤如下：采用无血清培养基，通过悬浮培养法对EB66细胞进行传代培养，获取EB66传代细胞；利用所述EB66传代细胞分别接种鸭坦布苏、禽流感病毒株后，分别进行吸附培养，然后补加原工作体积1～2倍的无血清培养基，其中所述禽流感病毒株的培养需要补加TPCK胰酶，所述TPCK胰酶的补加策略为在接毒后第0天和第1天各补加2mg/L所述TPCK胰酶或者在接毒后第0天一次性补加4mg/L所述TPCK胰酶。
3.如权利要求2所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于：所述吸附培养的培养时间为0.5h～2h，培养温度为33℃～35℃，搅拌速度为80rmp～120rmp。
4.如权利要求2所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于：所述吸附培养完成后，补加原工作体积1倍的所述无血清培养基。
5.如权利要求2所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于：所述TPCK胰酶的补加策略为在接毒后第0天和第1天各补加2mg/L所述TPCK胰酶。
6.如权利要求1所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作步骤如下：在病毒中加入甲醛溶液，充分搅拌下，甲醛溶液的最终浓度为0.1％，37℃条件下灭活20小时。
7.如权利要求1所述所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤(4)的具体操作如下：
(a)油相佐剂制备：取注射用白油和司本-80混合，搅拌混匀，灭菌，冷却后备用；
(b)病毒混合液制备：将灭活后的鸭坦布苏病毒和禽流感病毒按1:1的比例混合，取混后的病毒液96份，加入灭菌冷却后的吐温-804份，充分搅拌至完全溶解，其中0.1ml病毒混合液中的鸭坦布苏病毒含量不低于105.0ELD50、禽流感病毒含量不低于107.0ELD50；
(c)乳化：在油相佐剂中缓慢加入所述病毒混合液，充分搅拌后乳化。
8.如权利要求7所述所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于：所述白油和司本-80的混合体积比为94:6。
9.如权利要求7所述所述产鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗的方法，其特征在于：所述油相佐剂与所述病毒混合液的混合体积比为3:2。
10.一种通过权利要求1～9任一项所述的方法制备的鸭坦布苏、禽流感二联灭活疫苗。
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