CN105311630B - 一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗方法，该方法包括以下步骤：(1)利用微囊化方法制备微囊化动物细胞；(2)在细胞培养系统中，接入该微囊化动物细胞进行培养；(3)在该细胞培养系统中接入病毒进行培养，收获病毒液，制备疫苗。采用微囊化技术进行动物细胞的培养，解决了细胞大规模连续放大的问题，还发现利用该培养的动物细胞来繁殖病毒，病毒含量较高，用此病毒液来制备病毒疫苗同样起到比较好的免疫效果。本发明还提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备细胞表达产物的方法。本发明降低了对微载体的依赖，生产成本有较大的降低。

Description

一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用

技术领域

本发明属于生物制品领域。

背景技术

细胞培养中目前最令人振奋的进展之一是采用了微载体(Microcarr ier,MC)。最早由VanWezel所报道的这种载体,经马萨诸塞理工学院 (MIT)的研究小组广泛工作以后已得到改进,并扩充了应用范围。目前国际市场已有十几种商品MC出售。目前常用的商品化微载体有 cytodex系列、biosilon系列、solo微载体、Cultipher微载体和Fibra disk 片状载体等，这些微载体对用于细胞培养来说，价格往往过于昂贵，用于大规模生产成本大，不适合进行工业化生产。

微囊化技术主要用于病毒疫苗和化学药物的微胶囊化，通过微胶囊的缓释作用，从而提高受试动物的预防或治疗效果。微囊化培养在疫苗研制中的应用主要有以下几方面。

在口服型疫苗中的应用，利用微胶囊技术，把可口服的疫苗包裹住，制成耐酸碱可吸收的微胶囊。使用时通过饲料或饮水让动物摄入，经消化道吸收以后，壁材逐渐打开，芯材(疫苗)流出刺激动物产生免疫应答。微胶囊疫苗由于壁材的缓慢释放，疫苗对动物产生一个长期有效刺激，机体的免疫应答效果也会十分确实、稳定。利用这种技术用开发鱼类的缓释疫苗非常有意义。

在联苗中的应用，利用微胶囊技术，把两种疫苗微包处理后再混合制成联苗，由于不同疫苗壁材打开的时间各不相同，它所包含芯材(疫苗)释放出的时间也有先后之分，利用微胶囊技术生产的联苗，可以大大降低因同时免疫而产生的不同疫苗之间的拮抗作用，使机体对疫苗刺激产生一个合理的时间差，达到良好的免疫效果。

在基因工程疫苗研究中的应用：基因工程蛋白，在动物体内降解快，一次免疫很难起到很好的保护效果，可通过微囊化技术把蛋白进行微囊化，在不影响蛋白的抗原性的同时，还能延缓蛋白的免疫效果，已有文献报道微囊化乙肝表面蛋白疫苗后的免疫效果比传统工艺疫苗有较为明显的提升，使用一次注射就能实现比较好的免疫效果。

另外微胶囊化基因工程细胞，可用于制备高浓度的表达产物。微囊化培养杂交瘤细胞是一种大规模生产单克隆抗体的新技术,国外已应用于生产,其主要优点是单抗浓度高,纯度高,活力高,易于纯化。

在现有技术中未见有微囊化哺乳动物细胞生产病毒性疫苗的报道，主要是未解决大规模培养的瓶颈问题。专利申请CN101288836公开了利用一种微生物微胶囊大量制备的方法，并具体公开了：配制海藻酸钠溶液作为囊材，以氯化钙溶液作为固化剂，加入对数生长期的微生物种子液进行固化，并将包有微生物细胞的微胶囊接入发酵液中，培养至对数生长末期，过滤分离微胶囊获得产品的技术方案。然而，该技术方案使用高压空气和喷头的喷挤压雾法，存在有产品粒径过大的问题，且球形度和单分散性都很差，使得产品得率低，同时制备过程比较复杂，因此极大限制了其推广应用。

专利申请CN103614344公开了一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，具体公开了培养PK-15细胞液，在生物反应器内接种上述细胞液，加入片状微载体，进行细胞悬浮培养，所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，接种 24小时后至240小时采用灌注工艺培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，冻融，得猪圆环病毒2型(PCV2) 病毒液。然而，该申请使用价格昂贵的片状载体，抗原生产成本较高；同时使用片状载体后，细胞从载体上消化解离解离困难，不能实现连续放大。

猪圆环病毒SH株公开于专利申请CN101240264A。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明经过多次尝试后，采用微囊化技术进行动物细胞的培养，解决了细胞大规模连续放大的问题，还发现利用该培养的动物细胞来繁殖病毒，病毒含量较高，用此病毒液来制备病毒疫苗同样起到比较好的免疫效果。

本发明的主要目的在于提供一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)利用微囊化方法制备微囊化动物细胞；(2)在细胞培养系统中，接入所述微囊化动物细胞进行培养；(3)在所述细胞培养系统中接入病毒进行培养，收获病毒液，制备疫苗。

优选地，所述步骤(1)中微囊化方法包括物理化学法(相分离法)，物理机械法，化学法；所述物理化学法包括单凝聚法，复凝聚法，溶剂 -非溶剂法，改变温度法，液中干燥法；所述物理机械法包括喷雾干燥法，喷雾凝结法，空气悬浮法；所述化学法包括界面缩聚法和辐射交联法。

其中，物理化学法又称为相分离法：物理化学法中的单凝聚法以明胶为囊材，复凝聚法以明胶－阿拉伯胶为囊材。

优选地，所述步骤(1)微囊的囊材包括明胶，阿拉伯胶，海藻酸盐，壳聚糖，蛋白类囊材，羧甲基纤维素钠，醋酸纤维素酞酸酯，乙基纤维素，甲基纤维素，聚酰胺，硅橡胶，聚丙烯酸树脂，聚乙烯醇，聚碳酯，聚氨基酸，聚乳酸，丙交酯乙交酯共聚物。

其中，明胶，阿拉伯胶，海藻酸盐，壳聚糖，蛋白类囊材为天然高分子囊材；羧甲基纤维素钠，醋酸纤维素酞酸酯，乙基纤维素，甲基纤维素为半合成高分子囊材；聚酰胺，硅橡胶为非生物降解，不受pH影响的合成高分子囊材；聚丙烯酸树脂，聚乙烯醇为非生物降解，一定pH 条件下溶解的囊材；聚碳酯，聚氨基酸，聚乳酸，丙交酯乙交酯共聚物为生物降解性囊材。

优选地，所述细胞包括：CHO细胞、BHK21细胞、Marc145细胞、 Vero细胞、F81细胞、猪肾传代细胞系PK-15或IBRS-2或其它敏感猪源细胞、ST细胞、牛睾丸细胞、牛羊犬的肾细胞、鸡胚成纤维细胞、昆虫卵巢细胞、白纹伊蚊细胞Aa2-678、小菜蛾细胞BCIRL-Px2-HNU3、草地贪叶蛾卵巢细胞Sf21及其克隆株Sf9和粉纹夜蛾胚胎细胞BTI-Tn5-BI-4，以及所述各种细胞的亚型细胞株及其驯化、基因工程改造型细胞株。

优选地，所述步骤(2)中细胞培养系统包括各种细胞培养瓶、袋系统、一次性塑料袋系统、生物反应器在内的各种形式和基于各种原理的细胞培养系统或装置；其中，所述生物反应器包括搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、细胞悬浮或贴壁式生长生物反应器、间歇式或流加式或连续灌注式生物反应器、wave生物反应器在内的细胞培养生物反应器。

优选地，所述步骤(3)中所述病毒包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪伪狂犬病毒、鸭坦布苏病毒、禽流感病毒、鸡法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡减蛋综合症病毒、乙脑病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒、犬瘟热病毒和重组杆状病毒。

优选地，所述步骤(1)结束后使用胰酶消化溶解微囊，并重复所述步骤(1)的细胞包被过程，所述重复包被过程可以重复多次。

优选地，所述步骤(3)中所述接入病毒进行培养的过程为流加培养。

优选地，所述步骤(3)中制备疫苗包括使用所述培养的病毒液利用本领域常规方法制备疫苗，具体地而言，包括灭活所述病毒液制备灭活疫苗，以及添加保护剂于所述病毒液制备活疫苗。

本发明的再一目的在于提供一种哺乳动物细胞悬浮培养制备细胞表达产物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)利用微囊化方法制备微囊化动物细胞；(2)在细胞培养系统中，接入所述微囊化动物细胞进行培养；(3)在所述细胞培养系统使细胞进行细胞产物表达，收获细胞表达产物。

优选地，所属的细胞表达产物包括基因重组工程蛋白、多肽片段和小分子成分。

本发明的又一目的在于提供所述方法在制备疫苗以及细胞表达产物方面的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、利用微囊化技术包被贴壁细胞，降低了对微载体的依赖，并且生产成本有较大的降低；

2、利用微囊化技术不仅可以包被动物细胞还可包被悬浮细胞，且病毒含量均有大幅度提升，比常规微载体培养工艺病毒含量提升10倍以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、利用生物反应器微囊化PK15细胞生产PCV2疫苗

(1)细胞准备：取对数生长期的PK15细胞消化后，调整细胞密度为2×10⁶cell/ml作为包被用材料；

(2)囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；

(3)水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3份:2份质量体积比(g/ml)搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2份(ml)，加入步骤(2)配制的无菌海藻酸钙溶液20份(ml)，混合均匀后，加入步骤(1)准备好的PK15细胞种子液22份(ml)，使PK15细胞的终浓度为1×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；

(4)油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；

(5)沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2～8℃保存备用；

(6)微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm 的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min 的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹PK15细胞的微胶囊。

(7)微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤微胶囊2次，用含体积百分比浓度为1％血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养；

(8)微胶囊大规模培养：将含有微囊化PK15细胞的Celligen310 细胞培养系统中，添加含体积百分比浓度为1％血清的MEM进行培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

(9)微胶囊接毒：微囊化细胞培养24h后，取微囊消化后计数，按照MOI＝0.2接入PCV2病毒，设定培养温度37℃,pH7.4，溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况，待细胞病变达80％病变时(IFA病毒含量达到最高，病毒含量在10^7.2TCID₅₀/ml)停止反应器搅拌，待微囊全部沉到反应器底部后，收获上清液；

(10)病毒液的收获:培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02％灭活剂BEI 灭活37℃灭活72h，然后37℃加入10％V/V(0.IM)硫代硫酸钠终止 BEI活性，然后将灭活后的病毒液于-20℃冷冻保存备用。

(11)PCV-2抗原灭活检验：灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，接种96孔板，同步介入PK15细胞，培养120h后，做间接免疫荧光，细胞无免疫荧光。

在本发明的实施例中，猪PCV-2抗原，其毒株为PCV-2b基因型SH 株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保 藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2389。

上述技术方案中，步骤(9)所述的灭活剂为二乙烯亚胺，加入浓度为0.005％～0.05％二乙烯亚胺(BEI),最优为0.01％～0.02％。37℃灭活72h后加人终浓度为10％V/V(0.IM)的硫代硫酸钠终止BEI活性。

上述技术方案中，步骤(9)所述的终止液为硫代硫酸钠,浓度为 5％～20％V/V(0.05～0.2M)。

上述技术方案中，步骤(10)所述抗原PCV-2含量≥1×10^7.0TCID₅₀/ml (间接免疫荧光法测定)。

本发明利用相分离微囊化法成功地将PK15细胞微囊化，并在工艺上首次使用微囊化PK15细胞生产病毒。

实施例2、利用生物反应器微囊化PK15细胞生产PCV2疫苗的免疫效果评价

用本发明实施例一自制的PCV2灭活疫苗，免疫程序如下：首先7 日龄仔猪用首免，21日后二免。在免疫的同时用已上市的猪PCV2疫苗，按相同方式免疫，以评价微囊化技术制备的PCV2灭活疫苗和上市疫苗在免疫效果上的差异。

1.材料

PCV-2单组份疫苗，按实施例一制备，其中每头份病毒液含量≥1×10^6.5TCID₅₀。

猪圆环病毒2型灭活疫苗，普莱柯生物工程股份有限公司，批号 20130802。

2.试验方法

用1周龄PCV-2抗原、抗体检测双阴性仔猪20头，分成4组，每组5头。7日龄第1组、2组分别颈部肌肉注射2种不同PCV-2疫苗1 头份，2周后(21日龄)用分别用不同的PCV-2疫苗二免1头份；第3、 4组不免疫。二免2周后(35日龄)第1、2、3组注射PCV2SH株2ml (含10^6.0TCID₅₀/ml)，观察21日；第四组作为空白对照。分别于攻毒后的7d，14d，21d称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日扑杀，剖检，根据病理学变化和免疫组化判定结果。

3结果与讨论

免疫效果研究结果如表1，微囊化技术制备的圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5(100％)，市场猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为 4/5(80％)，前者呈现更好的免疫效果。在仔猪增重方面，微囊化PK15 细胞制备的圆环病毒疫苗免疫后在平均体重增长率比PCV-2(SH株) 但组分疫苗的体重增长率要高，这是一个令人意外的结果。

表1 微囊化技术制备和常规技术制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗 (SH株)的免疫效果比较

表2 猪圆环病毒2型SH株攻毒后各组猪的体重增长情况

实施例3、利用生物反应器微囊化ST细胞生产猪瘟病毒疫苗

(1)细胞准备：取对数生长期的ST细胞消化后，调整细胞密度为 2×10⁶cell/ml作为包被用材料；

(2)囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；

(3)水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3份:2份重量体积比(g/ml)搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2份(ml)，加入步骤(2)配制的无菌海藻酸钙溶液20份(ml)，混合均匀后，加入步骤(1)准备好的ST细胞种子液22份(ml)，使ST细胞的终浓度为 1×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；

(4)油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；

(5)沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2～8℃保存备用；

(6)微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm 的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min 的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹ST细胞的微胶囊。

(7)微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤2次，用含体积百分比浓度为1％血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养。

(8)微胶囊大规模培养：将含有微囊化ST细胞的Celligen310细胞培养系统中，添加含体积百分比浓度为1％血清的MEM进行培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器。

(9)微胶囊接毒：微囊化细胞培养24h后，取微囊消化后计数，按照MOI＝0.2接入猪瘟病毒(猪瘟兔化弱毒为P480代脾毒，中国兽医药品监察所)，设定培养温度37℃,pH7.4,溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后24h开始流加培养(补加培养液的同时连续收获病毒液)，流加的体积为10L/d，通过微囊截留装置，连续收获病毒液时，只收获病毒液上清，连续收获15d，每日收获的病毒液分开，并对当日收获开始时取少量病毒液，用于病毒含量测定。

(10)对收获的病毒液分别间接免疫荧光法测定病毒含量:取待测病毒液做十倍系列稀释，接入96细胞培养板，然后用吸管滴入消化后的 ST细胞，每孔2.0万cell，然后让细胞培养板置于37℃培养3日，进行荧光染色判定。出现荧光的及判定该孔细胞感染，按R-M法计算TCID₅₀。在连续收获的病毒液除24h和48h病毒含量低于10^8.0TCID₅₀/ml外，其它日收获的13瓶(10L/瓶)猪瘟病毒液均在10^8.0TCID₅₀/ml以上。

表3 间接免疫荧光法检测不同收毒时猪瘟病毒毒含量(10^xTCID₅₀)

(11)配苗、分装及冻干：将病毒液均在10^8.0TCID₅₀/ml以上的病毒液，混合于同一容器内，按1:1(体积比)加入稳定剂(5％W/v蔗糖 5％明胶W/v)，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。按照按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验。本发明方法制备病毒液完全符合要求，对猪安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

(12)安全性检验：用微囊化技术制备的猪瘟疫苗按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含10头份疫苗，肌肉注射猪4头，每头5ml(含50个使用剂量)。注苗后，每日上、下午观察并测体温1次，观察21日。体温、精神、食欲与注苗前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过l℃，稽留不超过2日(4个温次)；或减食不超过l日，疫苗可判为合格。如有l头猪体温超过常温l℃以上，但不超过1.5℃，稽留不超过2个温次，疫苗也可判为合格。如有1头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其它体温反应和其它异常现象时，可用 4头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。也可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5m1，测温观察 16日。如均无反应，疫苗可判合格。结果表明，用微囊化技术制备的疫苗大剂量注射后均无明显反应，说明用该项技术制备的疫苗也是具有良好的安全性。

(13)效力检验：效力检验将每头份猪瘟疫苗分别稀释3000倍和 30000倍稀释，分别肌肉注射无猪瘟抗原和抗体的健康易感猪，每头1.0ml。10～14日后，连同条件相同的对照组10头，注射猪瘟石门系血毒1.0ml/头(10⁵MLD),观察16日。结果表明该技术制备的猪瘟疫苗稀释1/30000(高于规程标准10倍)攻毒后仍能达到100％保护。

表4 效力检验结果

实施例4、利用生物反应器微囊化Marc145细胞生产PRRSV病毒疫苗

(1)细胞准备：取对数生长期的Marc145细胞消化后，调整细胞密度为2×10⁶cell/ml作为包被用材料；

(2)囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；

(3)水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3份:2份重量体积比(g/ml)搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2份(ml)，加入步骤(2)配制的无菌海藻酸钙溶液20份(ml)，混合均匀后，加入步骤(1)准备好的ST细胞种子液22份(ml)，使marc145细胞的终浓度为1×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；

(4)油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；

(5)沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2～8℃保存备用；

(6)微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm 的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min 的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹Marc145细胞的微胶囊。

(7)微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤微胶囊2次，用含体积百分比浓度为1％血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养；

(8)微胶囊大规模培养：将含有微囊化Marc145细胞的Celligen310 细胞培养系统中，添加含体积百分比浓度为1％血清的MEM进行培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

(9)微胶囊接毒：微囊化细胞培养24h后，取微囊消化后计数，按照MOI＝0.2接入猪繁殖与呼吸综合征病毒(NVDC JXA1)，设定培养温度37℃,pH7.4,溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况，待细胞病变达80％病变时,停止反应器搅拌，待微囊全部沉到反应器底部后，收获上清液并取少量病毒液，用于病毒含量测定。

(10)病毒含量测定：对收获的病毒液进行病毒含量测定，其病毒含量为10^8.3TCID₅₀/ml，培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02％灭活剂BEI灭活 37℃灭活72h，然后37℃加入10％V/V(0.IM)硫代硫酸钠终止BEI活性，然后将灭活后加入佐剂进行配苗。

(11)安全性检验：用微囊化技术制备的PRRSV病毒疫苗按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含10头份疫苗，肌肉注射猪4 头，每头5ml。结果表明，用微囊化技术制备的疫苗大剂量注射后均无明显反应，说明用该项技术制备的疫苗也是具有良好的安全性。

(12)效力检验：将每头份PRRSV疫苗按照常规免疫程序分别免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康易感猪，每头1.0ml。10～14日后，连同条件相同的对照注10头，注射PRRSVJXA1E5代强毒1.0ml/头 (10⁵MLD),观察16日。结果表明该技术制备的高致病性蓝耳病疫苗攻毒后仍能达到100％保护。

表5 效力检验结果

<u>组别</u>	<u>试验动物数</u>	<u>保护率</u>	<u>备注</u>
				<u>免疫组</u>	<u>10</u>	<u>100％(10/10)</u>	<u>无体温反应</u>
<u>对照组</u>	<u>10</u>	<u>0％(0/10)</u>	<u>10头发病</u>

实施例5、利用生物反应器微囊化纯悬浮BHK21细胞生产鸭坦布苏病毒病毒疫苗

(1)细胞准备：取对数生长期的纯悬浮BHK21细胞消化后，调整细胞密度为1×10⁶cell/ml作为包被用材料；

(2)囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；

(3)水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3份:2份重量体积比(g/ml)搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2份(ml)，加入步骤(2)配制的无菌海藻酸钙溶液20份(ml)，混合均匀后，加入步骤(1)准备好的BHK21细胞种子液22份(ml)，使BHK21细胞的终浓度为0.5×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；

(4)油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；

(5)沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2～8℃保存备用；

(6)微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm 的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min 的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹BHK21细胞的微胶囊。

(7)微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤微胶囊2次，用含体积百分比浓度为1％血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养；

(8)微胶囊大规模培养：将含有微囊化BHK21细胞的Celligen310 细胞培养系统中，添加无血清培养基进行培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

(9)微胶囊接毒：微囊化细胞培养48h后，取微囊消化后计数，按照MOI＝0.1接入鸭坦布苏病毒，设定培养温度37℃,pH7.4,溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况，待细胞病变达80％病变时(病毒含量达到最高，病毒含量在10^9.0TCID₅₀/ml)停止反应器搅拌，待微囊全部沉到反应器底部后，收获上清液；

(10)病毒液的收获:培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02％灭活剂BEI 灭活37℃灭活72h，然后37℃加入10％V/V(0.IM)硫代硫酸钠终止 BEI活性，然后将灭活后的病毒液于-20℃冷冻保存备用。

(11)鸭坦布苏病毒抗原灭活检验：灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，接种96孔板，同步介入贴壁的BHK21细胞，培养120h后，无细胞病变。

实施例6、利用生物反应器微囊化纯悬浮PK15细胞在生物反应器连续放大

(1)在NBS Cellgen1153L生物反应器中，按照实施方案一制备生物微胶囊包被PK15细胞，每天取样，消化后计算细胞浓度，当细胞密度达到10×10⁶cell/ml时停止搅拌。

(2)静止后待微囊沉淀后，用蠕动泵抽出上清培养液，并用pH为 7.4无Ca²⁺，Mg²⁺PBS洗涤2遍，加入含质量体积比为0.25％胰酶和质量体积比为0.02％的EDTA.2Na消化液,搅拌10min后微囊自动溶解，细胞自动解离，解离后计数并调整细胞密度使PK15细胞密度为2×10⁶cell/ml，细胞活率在95％以上。

(3)在NBS Cellgen31010L或NBS Cellgen51040L的生物反应器中，按照实施方案一相同生物微胶囊制备方法，包被步骤2制备的细胞，并在10L或40L进行大规模培养，从而实现3L到10L或3L到40L生物反应器的线性放大,培养至细胞密度达到10×10⁶cell/ml时可继续放大，按照步骤(2)的方法进行微囊的溶解和细胞的消化，消化后可用于进一步放大。

(4)在更大规模的100L或500L生物反应器中，按照实施方案一相同生物微胶囊制备方法，包被步骤3制备的细胞，并在100L或500L 进行大规模培养，从而实现10L到100L或4L到500L生物反应器的线性放大。

放大后的微囊化细胞可用于病毒的培养、或细胞产物的制备生产。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种使用微囊化哺乳动物细胞制备疫苗的 方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）细胞准备：取对数生长期的PK15细胞、ST细胞、Marc145细胞、或BHK21细胞消化后，调整细胞密度分别为2×10⁶cell/ml、2×10⁶cell/ml、2×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml作为包被用材料；

（2）囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；

（3）水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3g:2ml质量体积比搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2ml，加入步骤（2）配制的无菌海藻酸钠溶液20 ml，混合均匀后，加入步骤（1）准备好的所述细胞种子液22ml，使所述PK15细胞、ST细胞、Marc145细胞、或BHK21细胞的终浓度分别为1×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml、0.5×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；

（4）油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；

（5）沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2~8℃保存备用；

（6）微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹所述细胞的微胶囊；

（7）微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤微胶囊2次，用含体积百分比浓度为1%血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养；

（8）微胶囊大规模培养：将含有所述微囊化细胞的Celligen310细胞培养系统中，分别添加含体积百分比浓度为1%血清的MEM培养PK15细胞、ST细胞、或Marc145细胞、或无血清的MEM培养BHK21细胞，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；

（9）微胶囊接毒：微囊化细胞培养24h后，取微囊消化后计数，分别按照MOI=0.2在所述步骤（8）中所述1%血清的MEM中接入PCV2病毒、猪瘟病毒、或猪繁殖与呼吸综合征病毒、或按照MOI=0.1在所述步骤（8）中所述无血清的MEM中接入鸭坦布苏病毒，设定培养温度37℃，pH7.4，溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，收获病毒液，制备疫苗。

2.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）还包括步骤：

（8a）待微胶囊大规模培养至PK细胞密度达到10×10⁶cell/ml时，停止搅拌；

（8b）步骤静止后待微囊沉淀后，用蠕动泵抽出上清培养液，并用pH为7.4无Ca²⁺，Mg²⁺ PBS洗涤2遍，加入含质量体积比为0.25%胰酶和质量体积比为0.02%的EDTA.2Na消化液，搅拌10min后所述微囊自动溶解，细胞自动解离，解离后计数并调整细胞密度使PK15细胞密度为2×10⁶cell/ml，细胞活率在95%以上；

（8c）在NBS Celligen310 10L或NBS Celligen510 40L的生物反应器中，按照所述步骤（2）~（7）制备包被所述步骤（8b）制备的细胞的微胶囊，并在10L或40L进行大规模培养，从而实现3L到10L或3L到40L生物反应器的线性放大，培养至细胞密度达到10×10⁶cell/ml时可继续放大，按照所述步骤（8b）所述方法进行微囊的溶解和细胞的消化，消化后可用于进一步放大；

（8d）在更大规模的100L或500L生物反应器中，按照所述步骤（2）~（7）制备包被所述步骤（8c）制备的细胞的微胶囊，并在100L或500L进行大规模培养，从而实现10L到100L或4L到500L生物反应器的线性放大。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（9）中所述接入病毒进行培养的过程为流加培养。