CN102337259A - 一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞及其制备方法和应用。将悬浮有人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到含Matrigel的海藻酸钠 溶液中，在高压静电环境下喷入到氯化钙溶液中形成微球后与柠檬酸钠溶液进行离子置换反应，最终得到微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。所得微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的大小均一，直径约为420mm。微囊内细胞增殖良好，细胞呈现立体式生长。应用于皮下肿瘤及原位肿瘤动物模型，相对于传统肿瘤细胞悬液注射法，建模成功率高，肿瘤生长迅速。
Description
技术领域
本发明属医学生物工程领域，涉及一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞及其制备方法和应用。所得的微囊体积可控，大小均一，微囊内肿瘤细胞增生活跃，动物模型成瘤率高。
背景技术
胰腺癌是一种恶性肿瘤，患者总的5年生存率低于5%。只有不到20%的患者胰腺癌病灶局限，可手术切除。尽管放化疗发展迅速，但其对于患者的生存时间延长效果微乎其微。因此，迫切得需要可以用于胰腺癌发生发展的动物模型。
目前人肿瘤细胞的大多数动物模型可分为皮下、原位以及异位移植。皮下肿瘤模型具有操作简单、易于观察肿瘤发展等观点。皮下种植形成的肿瘤生长良好，但是皮下移植瘤其生物学表现更类似于良性肿瘤及时来源于低分化细胞系。更重要的是皮下移植瘤极少转移至实质性脏器。因此，皮下移植瘤临床价值有限。原位注射细胞悬液或移植已形成肿瘤组织团块形成的肿瘤动物模型可以很好的模拟肿瘤发展、局部浸润及远处脏器转移的整个过程，并且成瘤率及转移发生率较高。原位移植已形成的肿瘤组织块可以避免注射细胞悬液时肿瘤细胞播散入腹腔的风险。
大量临床证据表明，胰腺癌远处转移发生在疾病的早期阶段。因此，需要能够研究肿瘤早期发展、转移的动物模型。肿瘤组织团块原位移植需要提前准备肿瘤，并且费时、费力，不能研究肿瘤早期发展机制因为原发肿瘤并非原位形成。而原位注射肿瘤细胞悬液至胰腺包膜下，细胞悬液可能经包膜破损处进入腹腔，形成腹腔播散灶。
因此，原位注射微囊化肿瘤细胞悬液相对于其他方法具有成瘤率及远处转移率高，腹腔播散率低以及能模拟肿瘤细胞早期进展的过程等优点。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决上述的技术问题而提供一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。
本发明的目的之二在于提供上述的一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种应用上述的一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在裸鼠中建立原位肿瘤或皮下肿瘤动物模型的方法。
本发明的技术方案
一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，即将悬浮有人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到含Matrigel的海藻酸钠溶液中，在高压静电环境下喷入到氯化钙溶液中形成微球后与柠檬酸钠溶液进行离子置换反应，最终得到微囊化人胰腺癌肿瘤细胞，该制备方法包括以下具体步骤：
（1）、人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备
在CO2培养箱中，人胰腺癌细胞在含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)培养液中，控制温度为37℃、CO2浓度为5%的条件下对人胰腺癌肿瘤细胞进行生长培养，培养3天后传代1-2次；
取上述培养过程中处于对数生长期的人胰腺癌肿瘤细胞，以0.25%胰酶对其进行消化20min后，置于离心机中以500′g的速度离心15min，以4℃、pH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤三次，调节细胞数目至4′107cells/mL，即得人胰腺癌肿瘤细胞悬液；
（2）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液的制备
按体积比即浓度为25%(v/v )的Matrigel：质量浓度为1.8%的海藻酸钠溶液为1:20，将浓度为25%(v/v )的Matrigel加入质量浓度1.8%的海藻酸钠溶液中，得到含Matrigel的海藻酸钠溶液；
然后加入步骤（1）所得的人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到上述所得的含Matrigel的海藻酸钠溶液中，使最终人胰腺癌肿瘤细胞浓度为2′107cells/mL，即得含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液；
（3）、高压静电下形成胶珠
通过高频脉冲微囊制备仪，控制喷射速率为90mm/h，将步骤（2）所得的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液自上而下垂直喷射到质量浓度为1.1%的CaCl2溶液中，形成胶珠；所述的胶珠的粒径大小可通过设定高压脉冲微囊制备仪的电压、频率等进行调整；
上述的高压脉冲微囊制备仪喷射过程控制电压60kv，频率90Hz，脉冲6ms；
（4）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的多聚赖氨酸/聚海藻酸钠的包被
将步骤（3）所得的胶珠悬浮于质量浓度为0.05％多聚赖氨酸溶液中5min，多聚赖氨酸与胶珠表面的海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊；
将形成的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊再悬浮于质量浓度为0.1%的海藻酸钠溶液中10min，中和其表面正电荷；
（5）、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备
将步骤（4）所得表面正电荷被中和后的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊浸泡于质量浓度3%柠檬酸钠溶液中10min，含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊内的海藻酸钙凝胶中的钙离子被钠离子置换并液化，用4℃、pH为7.2的PBS溶液洗涤微囊，最终得到本发明的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。
上述所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的微囊，其平均直径约420mm，将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞浸泡于含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)培养液保存，即得微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液。
所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞用于肿瘤动物模型的建立，其建立过程如下：
皮下肿瘤动物模型的建立
将上述的一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法中步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO2的浓度为5%的CO2培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL注射于裸鼠腋下或肩背部皮下，即得到皮下肿瘤动物模型。
原位肿瘤动物模型的建立
首先用10%水合氯醛（0.3g/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮肤，取腹部正中切口，仔细分离胃脾，暴露胰腺，将上述的一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法中步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO2的浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL注射于胰腺体尾被膜下，即得到原位肿瘤动物模型。
本发明的有益效果
本发明的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞，由于在微囊薄膜内增加了Matrigel，经倒置相差显微镜连续观察证实人胰腺癌肿瘤细胞增生活跃。
另外，微囊化人胰腺癌肿瘤细胞应用于皮下肿瘤及原位肿瘤动物模型，相对于传统肿瘤细胞悬液注射法，建模成功率高，肿瘤生长迅速。将按照此方法制备的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞应用于肿瘤动物模型，可加深对于肿瘤生长及转移的认识，广泛应用于药物的研发、检测及筛选。特别是原位注射微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液相对于其他方法具有成瘤率及远处转移率高，腹腔播散率低以及能模拟肿瘤细胞早期进展的过程等优点。
附图说明
图1、倒置相差显微镜100X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞图；
图2 、透射电子显微镜2500X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞图，图中箭头指完整的微囊膜；
图3、透射电子显微镜2500X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞图，其中微囊包膜因肿瘤细胞生长而破裂，图中箭头所指为微囊包膜；
图4、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液与人胰腺癌肿瘤细胞悬液两种方法制备皮下移植瘤定期检测肿瘤体积所绘制的生长曲线；
图5、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液与人胰腺癌肿瘤细胞悬液两种方法在制备原位移植瘤模型中所成肿瘤质量的比较。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，并不限制本发明。
本发明所用的高频脉冲微囊制备仪，上海理工大学生产；
所用的离心机：型号A1330005，德国SIGMA；
所用的透射电子显微镜：Philips ，CM80；
CO2培养箱:WJ-2,上海龙跃仪器设备有限公司；
所用的人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2取自上海交通大学医学院附属瑞金医院 消化外科研究所；
0.25%胰酶，上海史瑞可生物科技有限公司；
DMEM: Gibco, Grand Island, NY;
Matrigel: BD Bioscience, Bedford, MA；
PBS:上海叶舟生物科技有限公司；
柠檬酸钠:上海信然原装生物试剂有限公司；
海藻酸钠：上海实验试剂有限公司；
多聚赖氨酸：北京瑞泽康科技有限公司；
PET-CT: Inveon micro，SIEMENS;
本发明所用的检查方法：
请给出本发明所用的一些检查方法，采用参考文献的方式给出。
PET-CT检查的方法，见Valentiner U；Haane C；Peldschus K,et al.(18F)FDG and (18F)FLT PET-CT and MR imaging of human neuroblastomas in a SCID mouse xenograft model. Anticancer Research，2008,28（5A）:2561-8.
本发明所用的所有统计学检验，如微囊化人胰腺癌细胞与人胰腺癌细胞细胞在成瘤体积及肿瘤质量方面的差异使用t检验，微囊化人胰腺癌细胞与人胰腺癌细胞悬液在成瘤率方面的差异使用Fisher’s确切概率法。成瘤质量的差异亦使用Wilcoxon秩和检验。 P < 0.05在本发明中具有统计学差异。本发明的实验所有统计学运算均使用SAS 8.0。
实施例1
一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的制备，包括如下步骤:
（1）、人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液的制备
在CO2培养箱中，人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养液中，控制温度为37℃、CO2浓度为5%的条件下对人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2进行生长培养；
取20ml上述培养过程中处于对数生长期的人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2，弃去上层培养液，加入4℃，pH7.2的PBS洗涤三次，弃去上清液，再加入0.25%胰酶4mL消化，置于37℃、CO2的浓度为5%的CO2培养箱中，5min后取出，加入DMEM培养液3mL，将所得溶液倒入离心管中，以500′g的速度离心15min，弃去上清液，以4℃PBS溶液洗涤三次，调节细胞数目至4′107cells/mL，即得人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液；
（2）、含有人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的海藻酸钠溶液的制备
将浓度为25%(v/v)的Matrigel 50ul加入质量浓度1.8%的海藻酸钠溶液1mL中，加入步骤（1）所得人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液1.1mL，调节人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2浓度为2′107cells/mL，即得含有人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的海藻酸钠溶液；
（3）、高压静电下形成胶珠
通过高频脉冲微囊制备仪，控制喷射速度为90mm/h，自上而下将步骤（2）所得的含有人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的海藻酸钠溶液垂直喷入含有质量浓度为1.1%的CaCl2溶液的烧杯中，形成胶珠；
高频脉冲微囊制备仪的电压为60kv，频率为90Hz，脉冲6ms；
(4)、含有人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的多聚赖氨酸/聚海藻酸钠的包被
将步骤（3）所得的胶珠悬浮于质量浓度0.05％多聚赖氨酸溶液20mL中5min，多聚赖氨酸与胶珠表面的海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊，微胶囊悬浮于质量浓度为0.1%的海藻酸钠溶液20mL中10min，中和其表面正电荷；
(5)、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液的制备
将步骤（4）经表面正电荷中和后的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊浸泡于质量浓度3%柠檬酸钠溶液中，含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊内的海藻酸钙凝胶中的钙离子被钠离子置换并液化，用4℃、pH为7.2的PBS溶液洗涤含有人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊，最终得到本发明的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2；
将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2浸泡于含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)培养液保存，即得微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液。
利用上述所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的动物模型的制备，具体如下：
（1）、皮下人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型的制备
将上述的步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在37℃，CO2的浓度为5%的CO2培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL注射于裸鼠腋下，即得到皮下人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型。
（2）、原位人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型的制备
首先用10%水合氯醛（0.3g/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮肤，取腹部正中切口，仔细分离胃脾，暴露胰腺，将上述的步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在37℃，CO2的浓度为5%的，CO2培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL注射于胰腺体尾被膜下，即得到原位人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型。
上述所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2通过倒置相差显微镜及透射电子显微镜扫描，见图1、图2、图3。
其中，图1为倒置相差显微镜100X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2图，从图1中可以看出，微囊大小均一，平均直径约420um，微囊内的人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2增生活跃。
图2为上述所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的微囊包膜完整时在透射电子显微镜2500X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2图，从图2中可以看出人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在微囊内增生良好，从而表明了微囊技术有利于肿瘤细胞的增值。
图3为上述所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2的微囊包膜破损时，在透射电子显微镜2500X下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2图，从图2中可以看出当人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2增生至一定程度可胀破微囊包膜，从而表明了微囊化人胰腺癌细胞MiaPaCa-2增生良好。
应用实施例1
皮下移植瘤动物模型的比较：
将实施例1中步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在37℃，CO2的浓度为5%的 CO2细胞培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，分别取100uL注射于12只裸鼠左肩背部皮下，建立皮下移植瘤即微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型，即微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组；
同时，用0.25%胰酶消化上述实施例1中步骤（1）中处于对数生长期的人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2，冷PBS冲洗3次，用PBS重新悬成浓度2′107个/ml的单细胞悬液，将100uL单细胞悬液接种于12只裸鼠右肩背部皮下，建立皮下移植瘤即人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型，即人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组；
监测微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组及人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2组：每周用游标卡尺测量皮下的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组及人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组中的肿瘤大小，按公式V=?′长径′短径2，计算微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组及人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组中肿瘤的大小，结果见表1，
表1、皮下移植瘤动物模型成瘤体积
将表1中的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组（表中的微囊化肿瘤细胞）与人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组（表中的肿瘤细胞）中所成肿瘤体积通过t检验，得出第六周P=0.5348,P>0.05；第七周P=0.5467,P>0.05；第八周P=0.5988,P>0.05。其中P均>0.05说明了微囊化人胰腺癌细胞悬液组与胰腺肿瘤细胞悬液组所成肿瘤体积差异无统计学意义。
同时，根据表1中的数据绘制皮下移植瘤的生长曲线，见图4，从图中可以看出微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2（图中为微囊化肿瘤细胞）与人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2（图中为肿瘤细胞）在制备皮下移植瘤动物模型方面无明显差异。
另外，皮下移植瘤动物模型建立后的3~5日潜伏期后，接种人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2及微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2部位均可见皮下灰色结节，逐渐呈圆形或椭圆形生长。连续观察八周，两组裸鼠均全部存活，人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2组有两只裸鼠一直没有肿瘤长出，接种阳性率83.3%。微囊化人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2组有一只裸鼠一直没有肿 瘤长出，接种阳性率91.67%,两种方法成瘤率统计学上无显著性差异（c2 =0.3810,P=0.5371,P>0.05）。
原位移植瘤动物模型的比较:
取14只裸鼠，10%水合氯醛（0.3g/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，75%酒精消毒皮肤，取腹部正中切口，仔细分离胃脾，暴露胰腺，于胰腺体尾被膜下分别注射上述实施例1中步骤（1）中所得的人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液100uL后常规关腹，即得原位移植人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型，即人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组；
另取14只裸鼠，依照上述方法将实施例1中步骤（5）所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2在37℃，CO2的浓度为5%的CO2培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，分别取100uL于注射于胰腺体尾被膜下，即得原位移植微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2动物模型，即微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组；
对上述的2组动物模型，分别于原位移植瘤模型建立4周和8周时进行动物PET-CT检查及剖腹探查：即在第4周每组分别取7只裸鼠进行PET-CT检查后再进行剖腹探查；在第8周每组分别取7只裸鼠进行PET-CT检查后再进行行剖腹探查，仔细记录肿瘤质量，观察肿瘤侵袭周围脏器及远处转移情况。收集肿瘤原发灶及所有可能发生侵袭和转移的脏器，如肝、肾、脾、肠系膜、肺、腹膜、淋巴结等标本。
即分别于第4周及第8周每组取7只裸鼠通过尾静脉麻醉后注射18FDG（
18氟-脱氧葡萄糖）0.2ml进行PET-CT检查，并于影像学检查后剖腹探查。检查的结果如下：
人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组中术后4周的7只裸鼠有2只裸鼠存在腹腔注射附近处腹膜聚集成片的多个白色小癌灶，术后8周的7只裸鼠有2只存在类似情况，考虑为人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2悬液注射时腹腔污染所致的种植灶。结果表明，人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组建立裸鼠原位胰腺癌模型的成功率为71.43%。
微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组建立裸鼠原位胰腺癌模型的成功率为100%，人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组的成功率为71.43%，经确切概率Fisher检验，P=0.0489,P<0.05,表明该两组有显著性差异。
肿瘤细胞与荷瘤裸鼠数量及术后时间的关系见表2：
表2 肿瘤质量与荷瘤裸鼠数量及术后时间的关系
*Wilcoxon signed rank sum test
将表2中微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组（表中为微囊化肿瘤细胞）相对人胰腺肿瘤细胞MiaPaCa-2组（表中为肿瘤细胞）在肿瘤质量方面经t检验，结果如下：
手术后4周无显著性差异(0.0461 ± 0.0399 相对于 0.0313 ± 0.021，t=-0.81，P=0.4379, P>0.05)；
但手术后第8周，两组在肿瘤质量方面经t检验有显著性差异(0.1284 ± 0.0284 相对于 0.0943 ± 0.0571, t=-2.28,P=0.0457,P<0.05)，具体见图5，从图5中可以看出微囊化人胰腺癌细胞MiaPaCa-2组（图中为微囊化肿瘤细胞）相对于人胰腺癌细胞MiaPaCa-2组（图中为肿瘤细胞）在原位移植瘤模型成瘤质量方面具有明显的优势，从而说明了微囊化人胰腺癌细胞MiaPaCa-2具有较快的肿瘤细胞生长速率。
经过Wilcoxon 秩和检验比较微囊化人胰腺癌细胞MiaPaCa-2组与人胰腺癌细胞MiaPaCa-2组所成肿瘤质量的差异，与 t检验的结果一致。
手术后8周，剖腹探查显示微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组中有裸鼠胰腺癌肿瘤转移至小肠系膜、肝脏等，这与上述的PET-CT发现相一致，而人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组未见明显肿瘤转移迹象。其中，微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组7只裸鼠中2只出现肠系膜转移灶，而人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组未出现转移灶。
肉眼可见人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组与微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组所成肿瘤无明显差异，均呈圆形或椭圆形，质地较硬，无完整的包膜形成，周围血供丰富。肿瘤与胰腺组织分界不明显，外观呈粉红色，表面有结节状突起，肿瘤切面呈灰白色。表面有结节状突起，表面有结节状突起，肿瘤切面呈灰白色。少数裸鼠内肿瘤中央部分组织液化坏死。
镜下H&E染色，人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组与微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组所成肿瘤肿瘤大致相同，均可见原发肿瘤细胞大小形态不一，细胞异型明显，呈多边形或圆形，细胞体积大，胞质淡染，核大小、形态、染色不一，细胞核增大，核浆比例增高，核仁清除，核分裂相多见，可见巨核、双核、多核。组织病理学检查（H&E染色）证实了PET-CT成像所检测的确为胰腺癌转移灶。
免疫组化（参见AE1AE3,CA199，CAM5.2，EGFR,MIB-1，VIM）表明微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组所成肿瘤与人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组所成肿瘤在肿瘤细胞病理学方面表现相同。
上述结果表明微囊化人胰腺癌肿瘤细胞MiaPaCa-2组原位注射相对于其他方法具有成瘤率及远处转移率高，腹腔播散率低以及能模拟肿瘤细胞早期进展的过程等优点。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于将悬浮有人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到含Matrigel的海藻酸钠溶液中，在高压静电环境下喷入到氯化钙溶液中形成微球后与柠檬酸钠溶液进行离子置换反应，最终得到微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）、人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备
在CO2培养箱中，人胰腺癌细胞在含有热灭活胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle Medium培养液中，控制温度为37℃、CO2浓度为5%的条件下对人胰腺癌肿瘤细胞进行生长培养，培养3天后传代1-2次；
取上述培养过程中处于对数生长期的人胰腺癌肿瘤细胞，以0.25%胰酶对其进行消化20min后，置于离心机中以500′g的速度离心15min，以4℃、pH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤三次，调节细胞数目至4′107cells/mL，即得人胰腺癌肿瘤细胞悬液；
（2）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液的制备
按体积比即浓度为25%(v/v )的Matrigel：质量浓度为1.8%的海藻酸钠溶液为1:20，将浓度为25%(v/v )的Matrigel加入质量浓度1.8%的海藻酸钠溶液中，得到含Matrigel的海藻酸钠溶液；
然后加入步骤（1）所得的人胰腺癌肿瘤细胞悬液加入到上述所得的含Matrigel的海藻酸钠溶液中，使最终人胰腺癌肿瘤细胞浓度为2′107cells/mL，即得含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液；
（3）、高压静电下形成胶珠
通过高频脉冲微囊制备仪，控制喷射速率为90mm/h，将步骤（2）所得的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠溶液自上而下垂直喷射到质量浓度为1.1%的CaCl2溶液中，形成胶珠；
上述的高压脉冲微囊制备仪喷射过程控制电压60kv，频率90Hz，脉冲6ms；
（4）、含有人胰腺癌肿瘤细胞的多聚赖氨酸/聚海藻酸钠的包被
将步骤（3）所得的胶珠悬浮于质量浓度0.05％多聚赖氨酸溶液中5min，多聚赖氨酸与胶珠表面的海藻酸钙发生聚电解质络合反应成膜，形成含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊；
将形成的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊再悬浮于质量浓度0.1%的海藻酸钠溶液中10min，中和其表面正电荷；
（5）、微囊化人胰腺癌肿瘤细胞悬液的制备
将步骤（4）所得表面正电荷被中和后的含有人胰腺癌肿瘤细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊浸泡于质量浓度为3%的柠檬酸钠溶液中10min，用4℃、pH为7.2的PBS溶液洗涤微囊，最终得到本发明的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞。
3.如权利要求2所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的人胰腺癌细胞为MiaPaCa-2。
4.如权利要求1、2或3所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞用于肿瘤动物模型的建立。
5.如权利要求4所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞用于肿瘤动物模型的建立，其特征在于所述的动物模型为皮下肿瘤动物模型或原位肿瘤动物模型。
6.如权利要求5所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在皮下肿瘤动物模型中的应用，其特征在于将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO2的浓度为5%的CO2培养箱培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL注射于裸鼠腋下或肩背部皮下，即得含有微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的皮下肿瘤动物模型。
7.如权利要求5所述的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的制备方法所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在原位肿瘤动物模型中的应用，其特征在于将所得的微囊化人胰腺癌肿瘤细胞在37℃，CO2的浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养6天后，调节微囊浓度至2′102个/mL，取100mL原位注射于裸鼠胰腺包膜下，即得含有微囊化人胰腺癌肿瘤细胞的原位肿瘤动物模型。
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| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Application publication date: 20120201 |