CN105695413B - 用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料，包括以下含量(w/v)的组分：Matrigel基质胶5％‑25％、低粘度藻朊酸钠溶液31％‑55％和透明质酸钠溶液9％‑27％，中粘度藻朊酸钠溶液8％‑25％，还公开了该材料的制备方法，该方法选用生物相容性好、无免疫原性的天然生物材料藻朊酸钠和透明质酸钠替代部分Matrigel，改善了生物材料的机械性能，有效促进体外培养细胞组织结构的形成，使用本发明的三维细胞培养材料建立的三维培养系统即肿瘤个体化医疗药物筛选模型简便、快捷且易于操作，大大降低了肿瘤细胞三维培养的成本，便于体外肿瘤药敏性评价。

Description

用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料及其制备方法。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病，世界卫生组织估计2008年全球有760万癌症病人死亡，中国有196万人，占全球癌症死亡人数的25.89％。全国第3次死因回顾抽样调查数据显示，随着我国卫生事业的发展和医疗技术水平的不断提高，某些疾病如急性传染病、母婴疾病等已得到了明显有效的控制，恶性肿瘤死亡率则呈明显上升趋势，已经成为影响我国居民健康的主要的死亡原因之一。世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球人口80亿，癌症新发病例将达到2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀手,并成为全球最大的公共卫生问题之一。因此，采取有效的手段研究和开发抗肿瘤药物就显得极其重要了。
目前，对于多数患相同疾病的不同病人，治疗方法是用同样的药、标准的剂量，但实际上不同病人在治疗效果、不良反应方面有很大的差异，有时候这种差异甚至是致命的，个体化化疗是根据癌症患者药物遗传学和药物基因组学特点，采用特异和最佳的化疗药物方案进行化疗的方法，个体化化疗可以帮助患者选择合适的化疗药物，提高治疗的针对性，最大程度的延长患者的生存期。因此，在医院医生指导肿瘤病人用药时，必须根据不同的人不同的肿瘤选用不同的药物，即使是同一肿瘤，不同的患者也对药物的敏感性存在较大差异。因此，医生需要一个能够高效、快捷地筛选出适合特定病人的抗肿瘤药物。现有的二维细胞养基质与动物体内存在巨大差异，易造成药物假阳性，而动物实验周期长，成本高昂，应用性不广。因此需要建立适用于肿瘤个体化医疗的简便快捷高效成本低的三维细胞培养模型，替代动物实验的使用。
基质覆盖培养模型是目前细胞三维培养模型之一，所谓基质覆盖培养是指在细胞培养器的底部覆盖一层胶原形成基底胶，使细胞在基底胶中生长，分化，形成三维结构，基质覆盖培养模型的实质是模拟细胞生长的外环境(ECM)，使细胞生长在与体内相似微环境中，体内细胞生长在被ECM围绕的三维细胞中，其它的细胞浸润在血清和组织液中，血清和中含有可以促进成纤维细胞繁殖的因子，并且可将组织内稳态从正常的分化功能转移成典型的伤口治疗反应。该方法适合在普通实验室中进行，具有广泛的应用性，然而，现有的细胞三维培养基质采用Matrigel基质胶作为细胞培养材料，机械性能较差，且价格昂贵造成实验成本居高不下不利于三维培养细胞动物实验异种移植，限制了细胞三维培养技术的推广和应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种机械性能好，能促进体外培养细胞组织结构的形成且同时通过药效一致性评价实验，药敏性接近体内实验水平、成本适宜的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料。
本发明的另一目的是提供用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现发明目的：
用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料，所述用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料包括以下质量分数的组分：Matrigel基质胶5％-25％、低粘度藻朊酸钠溶液31％-55％和透明质酸钠溶液9％-27％。
进一步地，所述用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料还包括8％-25％中粘度藻朊酸钠溶液，所述中粘度藻朊酸钠溶液为中藻朊酸钠为2％(w/v)，所述低粘度藻朊酸钠溶液中藻朊酸钠为4％(w/v)，所述透明质酸钠溶液的质量浓度为10mg/ml。
进一步地，所述用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料中各组分的质量分数为：Matrigel基质胶15％，低粘度藻朊酸钠溶液40％，中粘度藻朊酸钠溶液10％，透明质酸钠溶液为12％。
用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备藻朊酸钠混合液，将2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液按一定体积比混合形成藻朊酸钠混合液，由此可以改善藻朊酸钠凝胶的性能，为体外细胞生长提供支架。
(2)除去藻朊酸钠混合液中气泡，将步骤(1)中制得的藻朊酸钠混合液置于冰上10-20min以消除汽泡以防止包裹细胞时气泡破裂造成细胞损伤。
(3)将10mg/ml透明质酸钠溶液和经过4℃过夜溶解的Matrigel基质胶溶液按一定体积比混合，用无菌吸管上下吹打3-5次使之均匀混合，置于冰上5-10min，防止Matrigel在室温下形成凝胶。
(4)将步骤(3)制得的混合溶液与步骤(2)中的藻朊酸钠混合液混合均匀，并置于冰上10-15min，消除气泡，否则在对肿瘤细胞组织块进行包裹时，钙离子与制备的混合溶液螯合形成的藻朊酸钠凝胶小珠会有大量气泡，一旦小珠的气泡破裂，容易造成小珠崩解。
进一步地，所述步骤(1)中2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液的混合体积比为1：1-1：5。
进一步地，所述步骤(3)中10mg/ml透明质酸钠溶液和Matrigel基质胶溶液的混合体积比为1：2-1：6。
进一步地，还包括对所述2％藻朊酸盐溶液的配制，配制步骤为称取1g藻朊酸钠粉末边搅拌边缓慢加入50℃水浴加热的蒸馏水中，高压蒸汽加热，自然冷却至室温再用0.22μm滤器过滤。
进一步地，所述10mg/ml透明质酸钠溶液通过以下步骤制备，称取200mg透明质酸钠粉末加入到20ml PH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过夜静置后，用0.22μm滤器过滤制得。
本发明提供的三维细胞培养材料具有以下优点：
(1)采用透明质酸钠和藻朊酸钠生物相容性好，对细胞无毒副作用，对人和环境友好，并且价格较低，大大降低了三维细胞培养的成本。同时，将不同粘度的藻朊酸钠溶液以适当的比例联合使用，改变了藻朊酸钠与CaCl2溶液发生螯合反应形成的乳白色小珠的微观分子结构，大大改善了乳白色小珠的机械性能。
(2)采用Matrigel、透明质酸钠和藻朊酸钠以适当的比例配比所形成的三维细胞培养材料，达到良好的细胞三维培养效果，适合多种肿瘤细胞的三维培养，应用范围广。
(3)本发明所述的三维细胞培养材料制备简单，成本较为低廉，重复性好，易于在实验室推广。
(4)在本发明中，三维细胞培养材料可用于肿瘤个体化医疗快速筛选抗肿瘤药物，肿瘤病人术后的肿瘤组织或手术肿瘤穿刺得到肿瘤细胞可直接用本发明提供的三维培养材料进行培养，检测抗肿瘤药物药敏性，所筛选的抗肿瘤药物有更强的个体特异性，临床应用简便快捷。
附图说明
图1肿瘤细胞分别在二维常规培养和实施例1制备的三维培养材料培养下肿瘤恶性表型相关生长因子(如炎症因子IL-8和血管内皮生长因子VEGF)表达对比图(图1a中肿瘤细胞为前列腺癌PC3细胞；图1b中肿瘤细胞为DU145细胞)；
图2肿瘤细胞分别在二维常规培养和实施例1制备的三维培养材料培养下EMT(Epithelial mesenchymal transition)过程相关生物标记物(MMP-2，MMP-3，MMP-9)表达对比图(图2a中肿瘤细胞为前列腺癌PC3细胞，图2b中肿瘤细胞为DU145细胞)；
图3荧光素酶法测定基于三种培养基(二维(2D)常规培养、Matrigel基质的3D培养、实施例1制备的三维细胞培养材料(3D mixture Matrix))培养的PC3细胞和动物体内肿瘤(in vivo)PC3细胞分别经过药物(盐酸阿霉素、紫杉醇和阿糖胞苷)作用后四者的caspase-3含量(荧光强度)图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式作进一步详细的说明。
在三维细胞培养材料中，添加一定的Matrigel，可为体外肿瘤细胞培养提供相关的生长因子和蛋白，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和和分化，有利于体外培养细胞形成三维结构；透明质酸钠是一种酸性粘多糖，具有调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等功能，在三维培养系统中，加入合适含量的透明质酸钠，可以促进细胞的增殖和粘附，加快肿瘤细胞球体形成；藻朊酸钠是一种天然多糖，具有良好的凝胶性和成膜性，藻朊酸钠溶液和氯化钙溶液中的钙离子发生螯合反应形成机械性能好水凝胶，为细胞的体外三维培养提供支架作用，低粘度的藻朊酸钠粘度为16-48cp，中粘度的藻朊酸钠粘度大于2000cp，然而由中粘度的藻朊酸钠溶液所形成的的水凝胶刚性过大韧性不足，容易开裂，同时，水凝胶的透明度不够，难以清晰观察凝胶中的细胞生长状态，低粘度的藻朊酸钠溶液所形成的的水凝胶机械强度不够容易降解，无法长时间体外培养细胞，同时，水凝胶的透明度良好，可以清晰观察凝胶中的细胞生长状态，因此，将2％(w/v)中粘度藻朊酸钠溶液和4％(w/v)低粘度藻朊酸钠溶液以适当比例混合，可制得性能良好、易于观察细胞形态的水凝胶。
实施例1
(1)将2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液按1：1的体积比混合形成藻朊酸钠混合液；(2)将步骤(1)中制得的藻朊酸钠混合液置于冰上10min以消除汽泡以防止包裹细胞时气泡破裂造成细胞损伤；(3)将10mg/ml透明质酸钠溶液和经过4℃过夜溶解的Matrigel基质胶溶液按1：2的体积比混合，用无菌吸管上下吹打3次使之均匀混合，置于冰上8min，防止Matrigel在室温下形成凝胶；(4)将步骤(3)制得的混合溶液与步骤(2)中的藻朊酸钠混合液混合均匀，并置于冰上15min消除气泡后制得三维细胞培养材料，最终Matrigel的含量为15％，2％中等粘度藻朊酸钠溶液含量为10％，4％低粘度藻朊酸钠溶液含量为40％，透明质酸钠溶液含量为12％。
实施例2
(1)将2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液按1：3的体积比混合形成藻朊酸钠混合液；(2)将步骤(1)中制得的藻朊酸钠混合液置于冰上20min以消除汽泡以防止包裹细胞时气泡破裂造成细胞损伤；(3)将10mg/ml透明质酸钠溶液和经过4℃过夜溶解的Matrigel基质胶溶液按1：4的体积比混合，用无菌吸管上下吹打5次使之均匀混合，置于冰上10min，防止Matrigel在室温下形成凝胶；(4)将步骤(3)制得的混合溶液与步骤(2)中的藻朊酸钠混合液混合均匀，并置于冰上10min消除气泡后制得三维细胞培养材料，最终Matrigel的含量为5％，2％中等粘度藻朊酸钠溶液含量为25％，4％低粘度藻朊酸钠溶液含量为31％，透明质酸钠溶液含量为27％。
实施例3
(1)将2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液按1：5的体积比混合形成藻朊酸钠混合液；(2)将步骤(1)中制得的藻朊酸钠混合液置于冰上15min以消除汽泡以防止包裹细胞时气泡破裂造成细胞损伤；(3)将10mg/ml透明质酸钠溶液和经过4℃过夜溶解的Matrigel基质胶溶液按1：2的体积比混合，用无菌吸管上下吹打3次使之均匀混合，置于冰上5min，防止Matrigel在室温下形成凝胶；(4)将步骤(3)制得的混合溶液与步骤(2)中的藻朊酸钠混合液混合均匀，并置于冰上12min消除气泡后制得三维细胞培养材料，最终Matrigel的含量为25％，2％中等粘度藻朊酸钠溶液含量为16％，4％低粘度藻朊酸钠溶液含量为40％，透明质酸钠溶液含量为17％。
为了进一步说明本发明的三维细胞培养材料的能促进体外培养细胞组织结构的形成、同时通过药效一致性评价实验且药敏性接近体内实验水平的性能，将实施例1制得的三维细胞培养材料进行以下测试与评价：
1、酶联免疫法测定IL-8和VEGF含量
将实施例1制得的三维细胞培养材料包裹前列腺癌PC3细胞，生长10天后，再用含2％血清的RPMI1640培养基对PC3细胞进行饥饿培养24h，吸取上清液，放于4℃保存待用。具体步骤如下：
(1)将实施例1制得的混合液放置于冰上10min以消除气泡，然后包裹PC3细胞，使1.0×106cells//毫升混合液。
(2)将(1)所述得到的含有细胞的混合液悬滴入0.1M CaCl2溶液中，静置10-20min，形成乳白色的藻朊酸钠小珠。
(3)用磷酸盐缓冲液和无血清的培养基洗涤藻朊酸钠小珠各一次，每次3min。
(4)将藻朊酸钠小珠移置6孔细胞培养板中培养，每孔5粒小珠，加入新鲜培养基培养。隔天更换培养基。10天后，吸弃旧培养基，加入含2％血清的新鲜培养基培养。培养24h后吸取上清液置于4℃冰箱待用。
(5)常规二维培养的肿瘤细胞传代，消化，计数，离心，加入新鲜培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.0×104cells/ml，1ml每孔接种到6孔细胞培养板中，加入新鲜培养基培养，5天后，吸弃旧培养基，加入含2％血清的新鲜培养基培养。培养24h后吸取上清液置于4℃冰箱待用。
(6)采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品总蛋白浓度，调整样品浓度，使各样品间蛋白总浓度相同。
(7)配制IL-8和VEGF标准品溶液：取标准品用磷酸盐缓冲液将两种溶液均稀释成以下浓度：500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.62pg/ml，7.8pg/ml和0pg/ml。其余操作步骤详见相应的ELISA试剂盒使用说明，测试结果如图1a所示，DU145细胞的测试准备与PC3细胞一样，测试结果如图1b所示。
由图1a可知，PC3细胞在本发明所述的三维培养系统下炎症因子IL-8和血管内皮因子VEGF的表达量分别是二维常规培养的3.5倍和4.3倍，图1b可知DU145细胞在本发明所述的三维培养系统下炎症因子IL-8和血管内皮因子VEGF的表达量分别是二维常规培养的3.1倍和5.1倍，这两种肿瘤细胞在实施例1的三维培养材料的恶性表型相关生长因子(IL-8和VEGF)均呈现高表达，由此说明肿瘤细胞在三维细胞材料的培养下发生了炎症过程并生成了肿瘤微血管，这与肿瘤细胞在动物体内的生长状况接近。
2、酶联免疫法测定样品液中MMP-1，MMP-2和MMP-9含量
将实施例1制得的三维细胞培养材料包裹前列腺癌PC3cells，生长12天后，吸弃旧培养基，加入0.05M EDTA溶液，放置37℃1h，使藻朊酸盐小珠溶解，再离心，弃上清，加入RIPA裂解液裂解细胞，高速冷冻离心机离心，取上清液，放于4℃保存待用，具体步骤如下：
(1)将由实施例1制得的混合液放置于冰上10min以消除气泡，然后包裹PC3细胞，得到细胞浓度1.0×106cells/毫升的混合液。
(2)将(1)得到的含有细胞的混合液悬滴入0.1M CaCl2溶液中，静置10-20min，形成乳白色的藻朊酸钠小珠。
(3)用磷酸盐缓冲液和无血清的培养基洗涤藻朊酸钠小珠各一次，每次3min。
(4)将藻朊酸钠小珠移置6孔细胞培养板中培养，每孔5粒小珠，加入新鲜培养基培养，隔天更换培养基，生长12天后，吸弃旧培养基，加入PBS洗涤1次，吸弃旧培养基，加入0.05M EDTA溶液，37℃放置1h，使藻朊酸盐小珠溶解，离心，弃上清，加入RIPA裂解液裂解细胞，高速冷冻离心机离心，取上清液，放于4℃保存待用。
(5)常规二维培养的肿瘤细胞传代，消化，计数，离心，加入新鲜培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.0×104cells/ml，1ml每孔接种到6孔细胞培养板中，加入新鲜培养基培养，5天后，吸弃旧培养基，加入PBS洗涤1次，吸弃PBS，加入RIPA裂解液裂解细胞，高速冷冻离心机离心，取上清液，放于4℃保存待用。
(6)采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品总蛋白浓度，调整样品浓度，使各样品间蛋白总浓度相同。
(7)配制MMP-1，MMP-2和MMP-9标准品溶液：取标准品用磷酸盐缓冲液将三种溶液均稀释成以下浓度：500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.62pg/ml，7.8pg/ml和0pg/ml。其余操作步骤详见相应的ELISA试剂盒使用说明，测试结果如图2a所示，DU145细胞的测试准备与PC3细胞一样，测试结果如图2b所示.
由图2a可知，PC3细胞在本发明所述的三维培养系统下EMT(Epithelialmesenchymal transition)过程相关生物标记物MMP-2，MMP-3和MMP-9的表达量分别是二维常规培养的3.2倍，2.1倍和3.3倍。由图2b可知，DU145细胞在本发明所述的三维培养系统下EMT(Epithelial mesenchymal transition)过程相关生物标记物MMP-2，MMP-3和MMP-9的表达量分别是二维常规培养的3.7倍，2.1倍和3.9倍，这两种肿瘤细胞在本发明所述的三维培养系统的EMT(Epithelial mesenchymal transition)过程相关生物标记物MMP-2，MMP-3和MMP-9均呈现高表达状态，由此可知，肿瘤细胞在三维培养下发生了肿瘤细胞的浸润和转移。
3、荧光素酶法测定caspase-3含量评价抗肿瘤药效
(1)制备动物实验样品：首先建立裸鼠裸鼠移植瘤模型，药物腹腔注射治疗荷瘤裸鼠，一段时间后，颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离肿瘤，将肿瘤与适当体积RIPA裂解液混合，剪碎肿瘤组织，用玻璃匀浆器匀浆30min，冰上操作。将组织匀浆高速冷冻离心，去上清液，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定该组织匀浆上清液蛋白总浓度，放置于4℃待用。
(2)制备基于Matrigel三维基质的细胞样品：Matrigel置于4℃过夜融化，常规二维培养细胞计数后，离心，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，将Matrigel以适当比例与细胞悬液混合均匀(冰上操作)，加入transwell嵌套培养小室中培养(渗透支持膜孔径0.4μm)，37℃孵育2小时，往细胞培养板下室加入新鲜培养基培养，隔天更换培养基，培养5天后，加入含有药物的新鲜培养基培养(药物浓度为裸鼠移植瘤模型中裸鼠给药剂量所对应的血药浓度峰值)。每两天更换含有药物的培养基，连续用药2次，药物处理后，用BD细胞回收液降解Matrigel，离心，弃上清，回收得到肿瘤细胞，往细胞中加入细胞裂解液，高速冷冻离心，取上清液，测定蛋白含量，放置于4℃待用。
(3)制备基于实施例1制得的三维细胞培养材料的细胞样品：用实施例1制得的三维细胞培养材料包裹细胞，具体操作步骤详见本发明说明书1.2，培养8天后，加入含有药物的新鲜培养基培养(药物浓度为裸鼠移植瘤模型中裸鼠给药剂量所对应的血药浓度峰值)，每两天更换含有药物的培养基，连续用药2次，药物处理后，用0.05M EDTA溶液降解乳白色小珠，离心，弃上清，回收得到肿瘤细胞。往细胞中加入细胞裂解液，高速冷冻离心，取上清液，测定蛋白含量，放置于4℃待用。
(4)二维细胞样品制备：将肿瘤细胞置于100mm培养皿进行常规培养，当细胞生长至80％汇合时，加入含有药物的新鲜培养基培养(药物浓度为裸鼠移植瘤模型中裸鼠给药剂量所对应的血药浓度峰值)。每两天更换含有药物的培养基，连续用药2次。药物处理后，往细胞中加入细胞裂解液，高速冷冻离心，取上清液，测定蛋白含量，放置于4℃待用。
(5)荧光素酶法测定凋亡蛋白caspase-3含量：上述4种样品液各取少量，将4种样品液总蛋白浓度调整到相同值，作为样品工作液；将荧光半胱天冬酶底物粉末用DMSO配制成10nM储存液；配制2×caspase-3底物分析液(50μM)：50μL底物储存液，100μL DTT(1M)，400μL EDTA(100nM)，10ml Tris Buffer(PH＝7.4)；将样品工作液与2×caspase-3底物分析液等体积混合，室温孵育2小时，用荧光酶标仪测定荧光强度(λEx＝351nm，λEm＝430nm)，测试结果如图3所示。
根据图3可知，二维常规培养(2D)、基于Matrigel基质的三维细胞培养(Matrixgel)、基于实施例1的三维细胞培养材料的PC3细胞三维培养(3D mixture Matrix)和动物体内肿瘤(in vivo)分别经过盐酸阿霉素、紫杉醇和阿糖胞苷药物作用，采用荧光素酶法测定四者caspase-3含量，纵坐标以荧光强度表示caspase-3表达。图3显示，盐酸阿霉素(doxorubicin)对PC3细胞有明显的促凋亡作用，紫杉醇(Paclitaxel)促凋亡效果次之，阿糖胞苷(Cytarabine)促凋亡效果最差，同时，PC3细胞在两种三维培养系统和裸鼠体内的凋亡程度接近，而二维常规培养的凋亡程度大大增加，这说明PC3细胞在三维培养系统下药敏性下降，对药物的耐受性大大增加，三维培养系统抗肿瘤药效评价结果更接近动物体内情况。
将实施例2和实施例3制得的三维细胞培养材料同样进行以上测试与评价，得出了与实施例1类似的测试结果。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料，其特征在于：所述用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料包括以下含量(w/v)的组分：Matrigel基质胶5％-25％、低粘度藻朊酸钠溶液31％-55％、中粘度藻朊酸钠溶液8％-25％和透明质酸钠溶液9％-27％，所述中粘度藻朊酸钠溶液为中藻朊酸钠为2％(w/v)，所述低粘度藻朊酸钠溶液中藻朊酸钠为4％(w/v)，所述透明质酸钠溶液的质量浓度为10mg/ml。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料，其特征在于：所述用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料中各组分的质量分数为：Matrigel基质胶15％，低粘度藻朊酸钠溶液40％，中粘度藻朊酸钠溶液10％，透明质酸钠溶液为12％。
3.根据权利要求2所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)制备藻朊酸钠混合液，将2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液按一定体积比混合形成藻朊酸钠混合液；
(2)除去藻朊酸钠混合液中气泡，将步骤(1)中制得的藻朊酸钠混合液置于冰上10-20min以消除汽泡以防止包裹细胞时气泡破裂造成细胞损伤；
(3)将10mg/ml透明质酸钠溶液和经过4℃过夜溶解的Matrigel基质胶溶液按一定体积比混合，用无菌吸管上下吹打3-5次使之均匀混合，置于冰上5-10min，防止Matrigel在室温下形成凝胶；
(4)将步骤(3)制得的混合溶液与步骤(2)中的藻朊酸钠混合液混合均匀，并置于冰上10-15min，消除气泡。
4.根据权利要求3所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中2％中粘度藻朊酸钠溶液和4％低粘度的藻朊酸钠溶液的混合体积比为1:1-1:5。
5.根据权利要求3所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中10mg/ml透明质酸钠溶液和Matrigel基质胶溶液的混合体积比为1：2-1：6。
6.根据权利要求3所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，其特征在于：还包括对所述2％藻朊酸盐溶液的配制，配制步骤为称取1g藻朊酸钠粉末边搅拌边缓慢加入50℃水浴加热的蒸馏水中，高压蒸汽加热，自然冷却至室温再用0.22μm滤器过滤。
7.根据权利要求3所述的用于肿瘤个体化医疗的三维细胞培养材料的制备方法，其特征在于：所述10mg/ml透明质酸钠溶液通过以下步骤制备，称取200mg透明质酸钠粉末加入到20ml pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，过夜静置后，用0.22μm滤器过滤制得。
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