CN109735496A

CN109735496A - 一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法

Info

Publication number: CN109735496A
Application number: CN201910133058.6A
Authority: CN
Inventors: 吴松; 刘晓岑
Original assignee: PEOPLE'S HOSPITAL LUOHU DISTRICT SHENZHEN
Current assignee: PEOPLE'S HOSPITAL LUOHU DISTRICT SHENZHEN
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明属于肿瘤细胞三维培养领域，具体涉及一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法。该三维耐药模型由海藻酸盐‑膀胱癌细胞悬液滴于二价/三价金属阳离子盐浴中进行螯合，制备成载细胞海藻酸盐凝胶微球进行三维培养获得。本发明采用三维培养得到的肿瘤细胞团具有获得性化疗药物耐药，表现为在相同药物浓度下，三维细胞的活性显著高于平面细胞，同时ABCG2转运蛋白表达水平与平面细胞相比显著提高，成功构建化疗药物耐药细胞模型。该发明可通过调整细胞的三维培养条件，形成抗肿瘤药物高通量筛选及评价模型，同时还可用于研究肿瘤细胞临床化疗药物获得性耐药的机制；寻找膀胱癌细胞临床化疗药物耐药逆转的靶点，具有较好的推广应用价值。

Description

一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法

技术领域

发明属于肿瘤细胞三维培养领域，具体涉及一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法及抗肿瘤药物筛选的应用。

背景技术

体外研究肿瘤微环境中其他细胞对肿瘤细胞侵袭转移能力的调控作用，需构建能够模拟体内肿瘤微环境的培养模型。传统的平面细胞培养方法虽然是目前肿瘤体外研究的常用技术手段，但由于其无法模拟体内微环境的复杂性，导致细胞丧失组织特异性结构、影响生物力学及生物化学等信号的表达及传导、影响细胞间连接等，因此导致平面培养得到的结果与体内结果不同，甚至有时会与之完全相反（F Pampaloni, E G Reynaud and E HStelzer, The third dimension bridges the gap between cell culture and livetissue. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): 839-845.）。当体外研究肿瘤的多药耐药性时，若使用平面培养的肝癌细胞，其生长方式会丧失三维空间结构，无法相对真实的反映体内肿瘤细胞的病理生理结构、状态。而动物模型与人体存在种属差异，无法很好的重复人体生理特征，例如人类肿瘤生长转移、药物治疗反应、免疫反应和肿瘤干细胞分化等等。

研究表明，经过三维培养后能够获得具有类组织结构的肿瘤细胞团，在细胞增殖、基因表达以及药敏性等方面与平面培养的细胞相比存在显著差异，更接近体内肿瘤组织的真实情况（M R Aberle, R A Burkhart, H Tiriac, S W M Olde Damink, C H C Dejong,D A Tuveson, and R M van Dam, Patient-derived organoid models help definepersonalized management of gastrointestinal cancer.Br J Surg, 2018. 105(2):e48-e60.C Liu, Y Liu, H G Xie, S Zhao, X X Xu, L X Fan, X Guo, T Lu, G W Sun,and X J Ma, Role of three-dimensional matrix stiffness in regulating thechemoresistance of hepatocellular carcinoma cells.Biotechnol Appl Biochem,2015. 62(4): 556-562.）应用三维细胞培养技术可以形成肿瘤模型并观察药物作用，研究肿瘤对化疗或放疗等的耐受性，观察肿瘤生物学行为如增殖、转移、浸润等，同时还可以观察细胞间相互作用和研究肿瘤血管生成和血管拟态。此外，三维培养能模拟体内的肿瘤组织因乏氧和缺少营养造成的组织中心坏死及与胞外基质的相互作用微环境，从而能够客观反映对肿瘤组织诱导血管生成和对化疗药物产生耐药的现象，而这是普通平面培养以及动物实验无法实现的。

发明内容

针对以上背景，本发明提出利用天然高分子材料海藻酸盐作为基质材料，通过与原代细胞或组织混合后利用海藻酸盐与二价金属离子螯合形成具有一定基质刚度、多孔的包埋活细胞的水凝胶体系，同时调整细胞的三维培养条件，实现对能够模拟体内组织的类器官的构建，形成抗肿瘤药物高通量筛选及评价模型，同时还可以实现在抗肿瘤药物高通量筛选方面的应用。

本发明的一个目的是提供一种肿瘤细胞三维模型的建立方法，可选地，包括以下步骤：（1）平面培养肿瘤细胞系；（2）利用海藻酸盐溶液将消化下来的肿瘤细胞系重悬；（3）海藻酸钠-肿瘤细胞系悬液滴于二价/三价金属阳离子盐浴中进行螯合，制备成载细胞海藻酸盐凝胶微球；（4）培养、液化分离。

可选地，所述步骤（2）中的海藻酸盐为海藻酸钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl 溶液中，浓度为0. 1-5g/L。细胞悬液密度为：5×10³~1×10⁶ cells/mL。

可选地，所述步骤（3）中的海藻酸钠凝胶微球制备方法包括锐孔挤出法、静电液滴法、或乳化法；金属阳离子盐浴包括为二价钙离子、钡离子、锌离子，或者三价钆离子；盐浴：海藻酸盐-细胞悬液的体积比为1:5-1:40；螯合条件为：20-37℃，螯合时间10-60min。

可选地，所述步骤（4）中的培养方法为：待螯合结束得到载细胞海藻酸盐凝胶微球后，吸除盐浴，加入细胞培养基进行培养；培养条件为：30-40℃，2-5%二氧化碳浓度，每隔1-3天进行换液，培养时间3-10天，细胞在凝胶微球中逐渐长为具有三维结构的细胞团。

可选地，所述步骤（4）中的分离方法为：（1）将载细胞海藻酸盐凝胶微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化海藻酸凝胶；（2）吸取液化后含细胞团的海藻酸盐溶液，离心，弃上清，PBS清洗后离心收集具有三维结构的肿瘤细胞团；（3）凝胶微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为10-60min，反应温度在20-37 ℃；参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为浓度范围在40-70mmol/L的柠檬酸钠溶液或浓度范围在50-200mmol/L的EDTA溶液。

可选地，可用于下列任一一种：（a）研究肿瘤细胞临床化疗药物获得性耐药的机制；（b）寻找肿瘤细胞临床化疗药物耐药逆转的靶点；（c）筛选治疗肿瘤的药物。

本发明具有以下有益效果：

1、在本发明中，三维细胞培养技术使细胞呈现三维立体生长方式，可以使细胞分化产生一定的三维组织特异性结构，为体外细胞培养提供了与其组织来源相似甚至相同的细胞生长环境。这种培养方法获得细胞在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与二维平面细胞有明显差异，更接近体内细胞，而且与动物模型相比，更为经济且可更快得到结果。

2、在本发明中，在满足细胞培养的直观及条件可控性的基础上，能够模拟体内细胞三维形态结构和功能，再现细胞与细胞间、细胞与基质微环境相互作用，可以非常方便的用于考察大量的单因素或者多因素联合调控结果，而相比之下，动物模型难以实现。

3、本发明所述的海藻酸钙凝胶制备简单温和，无毒，不会对包埋细胞产生筛选；生物惰性，改变支架材料也不会影响信号；细胞回收简单，便于下一步实验；材料可以改性，使用范围更广泛；已用于大规模生产。因此，广泛用于肿瘤研究、干细胞研究、组织工程研究、细胞治疗和高通量药物筛选等，特别是在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面，利用三维培养细胞获得的结果完全不同于二维平面培养细胞。

附图说明

图1不同培养得到膀胱癌细胞经顺铂/阿霉素/吉西他滨处理后细胞活性变化。

图2不同培养得到膀胱癌细胞ABC转运蛋白家族基因表达水平。

具体实施方式

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法及抗肿瘤药物的筛选的应用作进一步的说明。

1、构建肿瘤细胞三维耐药模型

（1）制备：选取膀胱癌细胞，待细胞长到对数生长期，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，离心收集细胞，并计数。将细胞悬液离心去上清，加入适量无菌海藻酸钠溶液（1.5%, w/v），混匀后溶液的细胞密度调整为1×10⁶ cells/ mL。利用手持注射方式将细胞悬液滴入10倍体积的100mM CaCl2溶液，钙化30min，形成粒径为2000±80 μm的海藻酸钙凝胶微球。（2）培养：待微球自然沉降，吸除钙液，直接加入与平面培养相一致的培养基于37℃含5％CO2的细胞培养箱中进行常规培养。培养第三天开始换液，之后每两天进行一次半数培养基换液，培养十天。（3）收集：取一定量的含细胞微球，自然沉降，去除上清后，直接加入55mM的柠檬酸钠溶液，静置或手摇15min，用显微镜观察是否将海藻酸钙液化并释放其中的细胞团，直到所有细胞团外周没有明显的凝胶边界为止。离心收集细胞团，再进行后续实验。若需要三维培养的单细胞，则将细胞团收集后，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA进行消化，37℃中静置8min，用显微镜观察细胞团的散开状况，细胞团分散成单细胞后，加入终止液终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，得到三维培养的单细胞悬液。

2、培养平面细胞

（1）培养：用高糖DMEM培养基（含10%新生牛血清+1×双抗）培养膀胱癌细胞。将一定数量的细胞接种于合适大小的细胞培养瓶中，于37℃含5% CO₂的细胞培养箱中进行常规单层培养。（2）收集：待细胞长到对数生长期，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，离心收集细胞，利用血球计数板计数后计算细胞数量，取适量细胞进行后续处理。

3、药物敏感性检测方法

（1）平面细胞药物敏感性检测：培养平面细胞至对数生长期。消化计数后接种于96孔板，5000 cells/well，培养48 h。吸掉上清，加入不同浓度含药的培养基（200μl/well），37˚C孵育72 h。用新鲜培养基洗1次，吸干上清，加入每孔10μlCCK8和100 μl培养基的混合液。37˚C孵育1h，利用酶标仪读取OD450，以OD630为参比波长，得到细胞活性变化曲线。（2）三维细胞药物敏感性检测：培养三维细胞至10天，用新鲜培养基洗2次，分装至Ep管中（250 μlbeads/ml media），混合均匀后加200 μl于24孔板，补加550 μl新鲜培养基。再按照不同药物浓度加入250 μl含药培养基（4×），设不加药组为对照，每组三个重复孔。孵育72 h后，用新鲜培养基洗三次，吸干上清，加入每孔50 μl CCK8和500 μl培养基的混合液。37˚C孵育2h，利用酶标仪读取OD450，以OD630为参比波长，得到细胞活性变化曲线。细胞活率=（加药孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。

4、ABC蛋白家族表达水平检测

采用Trizol试剂结合氯仿/异丙醇提取样本总RNA，然后对提取的RNA进行定性和定量分析，接着去除RNA样本中的基因组DNA，再对总RNA进行逆转录（采用SYBR Green qPCR法），最后设计ABCG2、ABCC1和ABCB1特异性扩增引物，并利用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达。基因相对表达量按2^-ΔΔCt法计算。

5、药物敏感性检测结果如图1所示。在实施例及对照例条件下膀胱癌细胞经不同浓度的化疗药物顺铂/阿霉素/吉西他滨处理后，其细胞活性变化情况。可以看出随着药物浓度的升高，三维和平面细胞的活性均有所降低，但平面细胞下降的速度显著高于三维细胞；在相同药物浓度下，三维细胞的活性显著高于平面细胞，说明三维细胞的药物敏感性低于平面细胞，即与平面细胞相比，三维培养的细胞球对化疗药物的耐药性显著提高。

此外，通过计算可知海藻酸钙凝胶微球培养的膀胱癌细胞对顺铂、阿霉素和吉西他滨的半数抑制量（IC50）分别为平面细胞的6.92、13.09和98.16倍（如表1）。结果表示经三维培养后得到的膀胱癌细胞具有较好的耐药性。

表1 不同培养得到膀胱癌细胞药物IC50统计。

6、ABC转运蛋白家族表达水平检测如图2所示。三维培养膀胱癌细胞的ABC转运蛋白（ABCG2、ABCB1和ABCC1）的表达水平在培养过程中稳定表达，其中ABCG2表达水平与平面细胞相比显著提高，提示ABCG2转运蛋白与海藻酸钙凝胶微球体系中三维生长的膀胱癌细胞出现的耐药性提高存在密切相关。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种肿瘤细胞三维模型，其特征在于：该模型建立方法包括如下步骤：（1）平面培养肿瘤细胞系；（2）利用海藻酸盐溶液将消化下来的肿瘤细胞系重悬；（3）海藻酸钠-肿瘤细胞系悬液滴于二价/三价金属阳离子盐浴中进行螯合，制备成载细胞海藻酸盐凝胶微球；（4）培养、液化分离。

2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：基质材料为天然高分子材料海藻酸盐溶液与二价金属离子进行螯合反应得到的水凝胶，凝胶体系为粒径100-2000微米的球形胶珠。

3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：水凝胶珠或者微胶囊内核中的海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆离子螯合的海藻酸盐水凝胶。

4.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：其中步骤（2）中的海藻酸盐为海藻酸钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl 溶液中，浓度为0. 1-5g/L，细胞悬液密度为：5×10³~1×10⁶cells/mL。

5.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：其中步骤（3）中的海藻酸钠凝胶微球制备方法包括锐孔挤出法、静电液滴法、或乳化法；金属阳离子盐浴包括为二价钙离子、钡离子、锌离子，或者三价钆离子；盐浴：海藻酸盐-细胞悬液的体积比为1:5-1:40；螯合条件为：20-37℃，螯合时间10-60min。

6.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：其中步骤（4）中的培养方法为：待螯合结束得到载细胞海藻酸盐凝胶微球后，吸除盐浴，加入细胞培养基进行培养；培养条件为：30-40℃，2~5%二氧化碳浓度，每隔1-3天进行换液，培养时间3-10天，细胞在凝胶微球中逐渐长为具有三维结构的细胞团。

7.根据权利要求1中所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：其中步骤（4）中的分离方法为：（1）将载细胞海藻酸盐凝胶微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化海藻酸盐凝胶；（2）吸取液化后含细胞团的海藻酸盐溶液，离心，弃上清，PBS清洗后离心收集具有三维结构的肿瘤细胞团；（3）凝胶微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为10-60min，反应温度在20-37℃；参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为浓度范围在40-70mmol/L的柠檬酸钠溶液或浓度范围在50-200mmol/L的EDTA溶液。

8.根据权利要求1所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：可用于研究肿瘤细胞临床化疗药物获得性耐药的机制。

9.根据权利要求1所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：可用于寻找肿瘤细胞临床化疗药物耐药逆转的靶点。

10.根据权利要求1所述的肿瘤细胞三维模型的建立方法，其特征在于：筛选治疗肿瘤的药物。