CN113444690A - 一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法，属于生物学技术领域。本发明利于胶原模拟体内细胞外基质结构，建立嵌入肿瘤细胞的肿瘤细胞耐照射模型。利用本发明的肿瘤细胞耐照射模型可以更好地研究肿瘤细胞的放射抵抗特性与修复能力，为探索肿瘤细胞的放射生物学特征、寻找放射增敏靶点和提高靶向杀伤肿瘤细胞效率提供了新方法。

Description

一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法。
背景技术
放射治疗是肿瘤治疗的主要手段之一，其在局部对肿瘤进行杀伤，对机体其他部位损伤较小，可弥补化学治疗的全身副作用的缺点。目前，放射治疗主要难点是某些肿瘤与部分个体在放射过程中存在耐受和抵抗，不能完全杀灭肿瘤细胞，进而产生肿瘤治疗后的复发与转移，因此放疗抵抗机制与增敏方法的研究与突破是提高放疗效果的关键。建立接近体内肿瘤细胞放射生物学反应的放射培养模型，模拟体内肿瘤在放射过程中经历的损伤修复与敏感抵抗调控，是探索肿瘤的放射抵抗机制，鉴定调控肿瘤细胞放射抵抗与增敏的关键因子的基础。
目前，肿瘤细胞耐照射模型普遍是利用一定剂量射线照射平面培养的肿瘤细胞，存活细胞进行传代扩增培养，一般传两代后进行再次照射，累积照射剂量达60Gy-80Gy，之后增加相同剂量照射，肿瘤细胞死亡或减少不明显，细胞稳定传代，生长曲线与未照射细胞大致相同，即为肿瘤细胞耐照射模型建成。这种肿瘤细胞耐照射模型基于传统二维细胞培养体系，肿瘤细胞呈单层贴壁生长，导致生物学特性与实际体内肿瘤细胞有很大差异，不能准确反应体内肿瘤放射生物学行为；且这种低剂量分割照射诱导细胞产生放射抵抗的方法，导致细胞基因组长期处于不稳定状态，基因组不稳定状态下接受再次照射，这种照射方法诱导细胞产生的放射抵抗能力并不能体现实体肿瘤中固有的放射抵抗机制。
由不同材料的三维载体与细胞在体外共同培养形成的三维细胞培养体系，通过提供模拟体内的肿瘤细胞生长微环境,使肿瘤细胞表现出接近体内的生物学作用，肿瘤的放射抵抗与增敏研究决定于肿瘤细胞表现出来的放射生物学行为，其依赖于体内的微环境与细胞间相互作用，以及由此产生的代谢物差异。因此，基于三维培养体系构建的体外肿瘤细胞模型可以通过高度模拟体内肿瘤细胞现实生长情况，达到反映肿瘤细胞固有的放射抵抗机制及对放射损伤的应答和随后的双链修复过程的要求。另外，不同癌种、不同个体之间放射抵抗能力和机制也会有细微差异，运用三维体系体外培养个体肿瘤细胞可以个体化排查放射抵抗的关键调控因子，达到个体化精准治疗的目的，可提高临床放射治疗效率。因此，利用三维培养体系构建的肿瘤细胞模型是研究肿瘤细胞的放射生物学特征、鉴定放射增敏靶点和提高靶向杀伤肿瘤细胞效率的重要手段。
发明内容
基于现有建立肿瘤耐放射模型的弊端，本发明提供一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法，利用三维细胞培养体系建立肿瘤细胞模型作为新型的体外肿瘤细胞耐照射模型，用于研究肿瘤细胞放射抵抗机制。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明是基于胶原是细胞外基质的主要组成部分，可以为细胞着床粘附提供活性位点，具有促进细胞分泌增长、加强细胞之间连接和物质交换的重要作用。本发明运用胶原或胶原和海藻酸钙的组合物模拟体内细胞外基质结构，建立嵌入肿瘤细胞三维培养体系。
一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法，所述的建立方法包括如下步骤：
(1)用0.1wt％醋酸水溶液溶解胶原粉末，配制胶原溶液；
(2)向步骤(1)所得的胶原溶液中加入培养基酸碱指示剂，混匀，待指示剂显示为酸性时，加入碱性溶液，混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，加入单细胞悬液混匀，滴入孔板内，置于孵育箱中，待胶原凝至胶状，加入培养基，置于37℃孵育箱中培养1-5天。
进一步地，步骤(1)中所述胶原的制备过程包括如下步骤：用75％乙醇浸泡洗净后的大鼠尾巴3-10分钟，取出所有鼠尾腱，置于生理盐水中浸泡，吸干生理盐水，将尾腱在平皿中剪碎；剪碎的尾腱移入烧瓶中，按1:20的体积比例加入0.1wt％醋酸溶液混合震荡，使尾腱分散溶于醋酸溶液中，4℃静置7天，5000转/分离心15分钟，吸取上清液，检测无菌后进行冻干即得。
进一步地，步骤(1)中所述胶原溶液的浓度为1-10mg/ml，优选2-6mg/ml。
进一步地，步骤(1)中所述胶原溶液中还可加入海藻酸盐，浓度为1-40mg/ml。
进一步地，步骤(2)中酸碱指示剂为酚红指示剂，加入量为胶原溶液体积的5-15％。
进一步地，步骤(2)中的碱性溶液为NaOH或KOH溶液，浓度为0.1-2M，加入量为胶原溶液体积的1-5％。
进一步地，步骤(2)中的单细胞悬液的加入量与胶原溶液体积比为1:9。
本发明另一方面提供一种上述方法制备获得的肿瘤细胞耐照射模型。
本发明另一方面提供上述肿瘤细胞耐照射模型在肿瘤放射生物学中的应用。
进一步地，所述的放射生物学包括放疗抵抗机制与增敏方法的研究。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明利用自提鼠尾胶原包裹细胞形成培养体系，使细胞全方位受力，悬浮生长成类似体内细胞的立体球形细胞团，且本发明使用的2mg/ml胶原，质地较软，在支撑固定细胞的同时不影响细胞各方位的生长及迁移聚集；本发明的嵌入三维培养体系使细胞嵌入固定于胶原凝胶嵌入并生长成细胞球，这样既能最大程度地模拟体内细胞的生长微环境，又具有展现细胞生长的直观性和条件可控性等优势，是一种可靠、便捷和避免伦理争议的细胞水平研究体系；可以更好地模拟体内肿瘤细胞的放射抵抗机制，利用这种体外肿瘤细胞模型可以为肿瘤放射生物学研究提供更好的平台。
2.本发明的三维细胞培养体系具有可以高度模拟体内肿瘤真实情况这一客观优势，三维培养体系下肿瘤细胞的放射抵抗能力较二维培养细胞更强，更接近于体内实际的情况，因此，通过三维培养体系建立的体外肿瘤细胞模型可以作为一种新型的肿瘤耐放射模型替代原有二维构建肿瘤耐照射细胞株，为肿瘤放射抵抗与增敏研究提供更可靠的体外细胞模型，可以更好地研究肿瘤细胞的放射抵抗特性与修复能力，为探索肿瘤细胞的放射生物学特征、寻找放射增敏靶点和提高靶向杀伤肿瘤细胞效率提供了新方法。
3.本发明证明了可以通过调节水凝胶表面硬度来调控肿瘤细胞模型的放射抵抗能力，可以为肿瘤放射抵抗及增敏研究提供更便捷准确的可调控放射抵抗能力的体外肿瘤细胞耐放射模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1：二维培养、胶原表面三维培养和胶原嵌入三维培养体系模式图。
图2：二维培养、胶原表面三维培养和胶原嵌入三维培养体系培养3天后人鼻咽癌CNE1细胞生长结构差异图。
图3：CNE1细胞在三种体系中培养3天后接受0、2、4、6、8Gy剂量照射后的存活状态图。
图4：二维、2mg/ml胶原+40mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+20mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+10mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+5mg/ml海藻酸钙及单纯2mg/ml胶原，6个调节水凝胶表面硬度的实验组之间的细胞生长3天后的形态差异图。
图5：二维、2mg/ml胶原+40mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+20mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+10mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+5mg/ml海藻酸钙及单纯2mg/ml胶原，6个实验组细胞抗辐射能力对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
1.实验材料
1.1实验试剂：
鼠尾胶原(自提)、醋酸、NaOH、RPMI-1640粉末(Gibco，美国)、I型胶原酶(Gibco，美国)、含钙镁离子Hanks液(BBI,上海，中国)、RPMI-1640培养基(Gibco，美国)、0.25％胰蛋白酶(Hyclone，美国)、优级胎牛血清(Gibco，美国)、D-PBS(生工，上海，中国)、Penicillin-Streptomycin双抗(Hyclone，美国)、4％多聚甲醛(索莱宝，北京，中国)、1％结晶紫染色液(索莱宝，北京，中国)。
1.2实验耗材：
培养皿(100mm、60mm)：Corning Costar，美国；细胞培养板(96孔、12孔、6孔)、离心管(50ml、15ml、1.5ml、500μl、200μl)、吸头等一次性耗材：(生工，上海，中国)。
1.3实验仪器：
二氧化碳培养箱(MEMMERT INCO108,德国)、超净工作台(HDL DL-CJ-2ND I,北京，中国)、倒置显微镜(Leica Dmirb，德国)、台式冷冻离心机(Eppendorf，德国)、纯水/超纯水系统(Merck Millipore，德国)。
1.4实验细胞：
人鼻咽癌CNE-1细胞株
2.实验方法
2.1细胞培养：
人鼻咽癌CNE-1细胞，常规培养于含10％FBS、1％Penicillin-Streptomycin双抗的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5％CO2培养箱培养。实验中所有细胞均用对数生长期细胞。
2.2胶原制备：
用酸提取法提取鼠尾胶原。取大鼠尾巴洗净后用75％乙醇浸泡5分钟，用止血钳折断尾骨拉出尾腱置于生理盐水中浸泡；所有鼠尾腱均取出后，吸干生理盐水，将尾腱在平皿中剪碎；剪碎的尾腱移入烧瓶中，按1:20的比例加入0.1％醋酸溶液混合震荡，使尾腱分散溶于醋酸溶液中，4℃静置7天，5000转/分离心15分钟，吸取上清液；鼠尾胶原溶液检测无菌后进行冻干，用0.1％醋酸溶解冻干后的鼠尾胶原，配制为2mg/ml胶原溶液，用0.1％醋酸溶解，配制为2mg/ml胶原溶液。
2.3 10x1640培养基制备：
RPMI-1640粉末用双蒸水配置为10x1640培养基，用0.2um过滤器过滤除菌。
2.4胶原酶制备：
用含钙镁离子的Hanks液溶解I型胶原酶粉末，配制为0.3mg/ml胶原酶溶液，用0.2um过滤器过滤除菌.
2.5细胞培养体系构建(如图1所示)：
二维培养组：加入1x1640单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
胶原表面三维培养组：540ul 2mg/ml胶原溶液，加入60ul10x1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因溶液酸性变为黄色，加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液PH至7-7.4，酚红指示剂转为粉紫色，滴入六孔板内，置于37℃孵箱2h，胶原凝至胶状，加入1x1640单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
胶原嵌入三维培养组：540ul 2mg/ml胶原溶液，加入60ul10x1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因溶液酸性变为黄色，加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液PH至7-7.4，酚红指示剂转为粉紫色，加入68.6ul单细胞悬液混匀，滴入六孔板内，置于37℃孵箱2h，胶原凝至胶状，加入1x1640培养基2ml，置于37℃孵箱生长3天。
2.6细胞克隆形成实验：
将生长3天的二维培养组，胶原表面三维培养组和胶原嵌入三维培养组分别进行0、2、4、6、8Gy剂量的放射，照射后吸尽培养基，用PBS清洗2次，无菌镊子夹出胶原至离心管，加入0.3mg/ml胶原酶2ml，37℃孵育10min，加入含血清培养基稀释终止消化，800r离心5min，弃上清，加入300ul 0.25％1×胰蛋白酶，37℃孵育3min,加入含血清培养基稀释终止消化，800r离心5min，弃上清得消化下来细胞。以300个/孔浓度接种于6孔板，每组别每剂量设3个复孔，放入培养箱中培养，每3天换一次液，1周后终止培养，弃培养液，PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定15min，弃固定液，PBS洗2遍，加0.1％结晶紫溶液室温下染色30min，弃染色液，PBS清洗5遍，自然干燥。细胞使用NIB410-FL荧光显微镜(Nexcope，中国)拍照，存活分数＝照射后细胞形成的克隆数/(接种细胞数x未照射细胞克隆形成率)x100％。
3.实验结果
三维培养肿瘤细胞模型放射抵抗能力更强：如图2所示，胶原嵌入三维培养CNE1细胞呈三维立体成球生长，更接近于体内真实情况。图3证实，胶原表面三维培养及胶原嵌入三维培养CNE1细胞较二维培养时均有更强的放射耐受能力。
实施例2
1.实验材料
1.1实验试剂：
鼠尾胶原(自提)、海藻酸钠、0.9％NaCl、0.1mol/L CaCl2、醋酸、NaOH、RPMI-1640粉末(Gibco，美国)、I型胶原酶(Gibco，美国)、含钙镁离子Hanks液(BBI,上海，中国)RPMI-1640培养基(Gibco，美国)、0.25％1×胰蛋白酶(Hyclone，美国)、优级胎牛血清(Gibco，美国)、D-PBS(生工，上海，中国)、Penicillin-Streptomycin双抗(Hyclone，美国)、4％多聚甲醛(索莱宝，北京，中国)、1％结晶紫染色液(索莱宝，北京，中国)。
1.2实验耗材：
培养皿(100mm、60mm)细胞培养板(96孔、12孔、6孔)(Corning Costar，美国)、离心管(50ml、15ml、1.5ml、500μl、200μl)、吸头等一次性耗材：生工，上海，中国。
1.3实验仪器：
二氧化碳培养箱(MEMMERT INCO108,德国)、超净工作台(HDL DL-CJ-2ND I,北京，中国)、倒置显微镜(Leica Dmirb，德国)、NIB410-FL荧光显微镜(Nexcope，中国)、台式冷冻离心机(Eppendorf，德国)、纯水/超纯水系统(Merck Millipore，德国)。
1.4实验细胞：
人鼻咽癌CNE-1细胞株
2.实验方法
2.1细胞培养：
人鼻咽癌CNE-1细胞，常规培养于含10％FBS、1％Penicillin-Streptomycin双抗的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5％CO2培养箱培养。实验中所有细胞均用对数生长期细胞。
2.2胶原制备：
用酸提取法提取鼠尾胶原。取大鼠尾巴洗净后用75％乙醇浸泡5分钟，用止血钳折断尾骨拉出尾腱置于生理盐水中浸泡；所有鼠尾腱均取出后，吸干生理盐水，将尾腱在平皿中剪碎；剪碎的尾腱移入烧瓶中，按1:20的比例加入0.1％醋酸溶液混合震荡，使尾腱分散溶于醋酸溶液中，4℃静置7天，5000转/分离心15分钟，吸取上清液；鼠尾胶原溶液检测无菌后进行冻干，用0.1％醋酸溶解冻干后的鼠尾胶原，配制为6mg/ml胶原溶液。
2.3 10x1640培养基制备：
RPMI-1640粉末加入20％NaHCO3粉末用双蒸水配置为10x1640培养基，用0.2um过滤器过滤除菌。
2.4海藻酸钠制备：
称量适量海藻酸钠粉末，高压灭菌并烘干，加入过滤除菌的0.9％NaCl溶液，涡旋溶解4小时，配置成60mg/ml海藻酸钠溶液，过夜脱泡。
2.5胶原酶制备：
用含钙镁离子的Hanks液溶解I型胶原酶粉末，配制为0.3mg/ml胶原酶溶液，用0.2um过滤器过滤除菌.
2.6三维细胞培养体系构建：
二维培养组：六孔板中加入4x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
2mg/ml胶原+40mg/ml海藻酸钙水凝胶组：1.5ml EP管中加入180ul 6mg/ml胶原溶液，加入360ul 60mg/ml海藻酸钠溶液，加入60ul 10x 1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因酸性胶原溶液变为黄色，再加入18ul 1mol/LNaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，酚红指示剂因溶液变为碱性转为粉紫色。将混合液滴入六孔板内，置于37℃孵箱，碱性胶原在室温下2h凝至胶状，在孔中快速打入3ml 0.1mol/L CaCl2溶液，静置10分钟，海藻酸钠置换成海藻酸钙，凝固成支架结构。加入20x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
2mg/ml胶原+20mg/ml海藻酸钙水凝胶组：1.5mlEP管中加入180ul 6mg/ml胶原溶液，加入180ul 60mg/ml海藻酸钠溶液，加入180ul 0.9％NaCl溶液，加入60ul10x1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因酸性胶原溶液变为黄色，再加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，酚红指示剂因溶液变为碱性转为粉紫色。将混合液滴入六孔板内，置于37℃孵箱，碱性胶原在室温下2h凝至胶状，在孔中快速打入3ml0.1mol/L CaCl2溶液，静置10分钟，海藻酸钠置换成海藻酸钙，凝固成支架结构。加入16x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
2mg/ml胶原+10mg/ml海藻酸钙水凝胶组：1.5mlEP管中加入180ul 6mg/ml胶原溶液，加入90ul 60mg/ml海藻酸钠溶液，加入270ul 0.9％NaCl溶液，加入60ul10x1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因酸性胶原溶液变为黄色，再加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，酚红指示剂因溶液变为碱性转为粉紫色。将混合液滴入六孔板内，置于37℃孵箱，碱性胶原在室温下2h凝至胶状，在孔中快速打入3ml0.1mol/L CaCl2溶液，静置10分钟，海藻酸钠置换成海藻酸钙，凝固成支架结构。加入12x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
2mg/ml胶原+5mg/ml海藻酸钙水凝胶组：1.5mlEP管中加入180ul 6mg/ml胶原溶液，加入45ul 60mg/ml海藻酸钠溶液，加入315ul 0.9％NaCl溶液，加入60ul 10x1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因酸性胶原溶液变为黄色，再加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，酚红指示剂因溶液变为碱性转为粉紫色。将混合液滴入六孔板内，置于37℃孵箱，碱性胶原在室温下2h凝至胶状，在孔中快速打入3ml0.1mol/L CaCl2溶液，静置10分钟，海藻酸钠置换成海藻酸钙，凝固成支架结构。加入8x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
单纯2mg/ml胶原组：1.5mlEP管中加入180ul 6mg/ml胶原溶液，加入360ul 0.1％醋酸，加入60ul 10x 1640培养基酸碱指示剂，充分混匀，酚红指示剂因酸性胶原溶液变为黄色，再加入18ul 1mol/L NaOH溶液,充分混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，酚红指示剂因溶液变为碱性转为粉紫色。将混合液滴入六孔板内，置于37℃孵箱，碱性胶原在室温下2h凝至胶状，加入6x104个细胞的单细胞悬液2ml，置于37℃孵箱生长3天。
生长三天后6个实验组间，细胞形态差异明显。海藻酸钠浓度越高水凝胶表面越硬，细胞粘附的活性位点被切割得越少，细胞贴壁、伸展及连接能力减弱，细胞无法连接成片，生长缓慢。
2.7细胞克隆形成实验：
将生长3天的二维、2mg/ml胶原+40mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+20mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+10mg/ml海藻酸钙、2mg/ml胶原+5mg/ml海藻酸钙及单纯2mg/ml胶原实验组分别进行0、6Gy剂量的放射，照射后吸尽培养基，用PBS清洗2次，无菌镊子夹出水凝胶至离心管，加入0.3mg/ml胶原酶2ml，37℃孵育10min，加入含血清培养基稀释终止消化，800r离心5min，弃上清，加入300ul 0.25％胰蛋白酶，37℃孵育3min,加入含血清培养基稀释终止消化，800r离心5min，弃上清得消化下来细胞。以300个/孔浓度接种于6孔板，每组别每剂量设3个复孔，放入培养箱中培养，每3天换一次液，1周后终止培养，弃培养液，PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定15min，弃固定液，PBS洗2遍，加0.1％结晶紫溶液室温下染色30min，弃染色液，PBS清洗5遍，自然干燥。细胞使用NIB410-FL荧光显微镜(Nexcope，中国)拍照，存活分数＝照射后细胞形成的克隆数/(接种细胞数x未照射细胞克隆形成率)x100％。
3.实验结果
随着水凝胶表面硬度增强，肿瘤细胞的放射抵抗能力减弱，如图4所示，在第一天和第三天，6个实验组之间细胞形态差异均非常明显，海藻酸钠浓度越高的组别，水凝胶表面硬度越强，细胞粘附增殖、连接迁移能力越弱。图5证实，水凝胶表面硬度与肿瘤细胞的放射抵抗能力明显相关，较硬的水凝胶表面培养的细胞放射抵抗能力较差，肿瘤细胞贴壁的基底硬度可调控细胞的放射抵抗能力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法，其特征在于，所述的建立方法包括如下步骤：
(1)用0.1wt％醋酸水溶液溶解胶原粉末，配制胶原溶液；
(2)向步骤(1)所得的胶原溶液中加入培养基酸碱指示剂，混匀，待指示剂显示为酸性时，加入碱性溶液，混匀，调整胶原溶液pH至7-7.4，加入单细胞悬液混匀，滴入孔板内，置于孵育箱中，待胶原凝至胶状，加入培养基，置于37℃孵育箱中培养1-5天。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原的制备过程包括如下步骤：用75％乙醇浸泡洗净后的大鼠尾巴3-10分钟，取出所有鼠尾腱，置于生理盐水中浸泡，吸干生理盐水，将尾腱在平皿中剪碎，剪碎的尾腱移入烧瓶中，按1:20的体积比例加入0.1wt％醋酸溶液混合震荡，使尾腱分散于醋酸溶液中，4℃静置7天，5000转/分离心15分钟，吸取上清液，检测无菌后进行冻干即得。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原溶液的浓度为1-10mg/ml。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原溶液的浓度为2-6mg/ml。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(2)中酸碱指示剂为酚红指示剂，加入量为胶原溶液体积的5-15％。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(2)中的碱性溶液为NaOH或KOH溶液，浓度为0.1-2M，加入量为胶原溶液体积的1-5％。
7.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(2)中的单细胞悬液的加入量与胶原溶液的体积比为1:9。
8.一种肿瘤细胞耐照射模型，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的建立方法制得。
9.权利要求8所述的肿瘤细胞耐照射模型在肿瘤放射生物学中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的放射生物学包括放疗抵抗机制与增敏方法的研究。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080175870A1 (en) * 2007-01-22 2008-07-24 Mather Jennie P Human Cancer Stem Cells
CN103160468A (zh) * 2011-12-19 2013-06-19 中国科学院大连化学物理研究所 人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型及其构建和评价
CN108743619A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 南开大学 一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段
CN108795867A (zh) * 2018-06-05 2018-11-13 华东理工大学 用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
CN109735496A (zh) * 2019-02-22 2019-05-10 深圳市罗湖区人民医院 一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法
CN110505881A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 达纳-法伯癌症研究所有限公司 使用3d微流体细胞培养装置评价肿瘤细胞球体的方法
US20200115667A1 (en) * 2017-06-21 2020-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Vascularized microfluidic platforms
WO2020187853A1 (en) * 2019-03-15 2020-09-24 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture method for head and neck organoids
WO2020264385A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Self-contained responsive biological systems and methods

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080175870A1 (en) * 2007-01-22 2008-07-24 Mather Jennie P Human Cancer Stem Cells
CN103160468A (zh) * 2011-12-19 2013-06-19 中国科学院大连化学物理研究所 人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型及其构建和评价
CN110505881A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 达纳-法伯癌症研究所有限公司 使用3d微流体细胞培养装置评价肿瘤细胞球体的方法
US20200115667A1 (en) * 2017-06-21 2020-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Vascularized microfluidic platforms
CN108795867A (zh) * 2018-06-05 2018-11-13 华东理工大学 用于构建结肠癌细胞腹膜转移体外三维模型的方法
CN108743619A (zh) * 2018-06-21 2018-11-06 南开大学 一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段
CN109735496A (zh) * 2019-02-22 2019-05-10 深圳市罗湖区人民医院 一种肿瘤细胞化疗药物三维耐药模型及其建立方法
WO2020187853A1 (en) * 2019-03-15 2020-09-24 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture method for head and neck organoids
WO2020264385A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Self-contained responsive biological systems and methods

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALINA DOCTOR等: "Three-Dimensional Cell Culture Systems in Radiopharmaceutical Cancer Research", 《CANCERS (BASEL)》, vol. 12, no. 10, pages 1 - 28 *
DONGLAI LV等: "Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery", 《ONCOL LETT 》, vol. 14, no. 6, pages 6999 - 7010 *
PRABU SIVA SANKAR 等: "Modeling nasopharyngeal carcinoma in three dimensions", 《ONCOL LETT》, vol. 13, no. 4, pages 2034 - 2044 *
YANHUA FANG等: "Extracellular matrix stiffness mediates radiosensitivity in a 3D nasopharyngeal carcinoma model", 《CANCER CELL INT》, vol. 22, no. 1, pages 1 - 13 *
佚名: "鼠尾胶原", 《爱问学库》, pages 1 - 7 *
冯飞: "三维培养肿瘤细胞耐药性及放射敏感性的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库_医药卫生科技辑》, no. 2, pages 072 - 11 *
刘惠芬等: "I型鼠尾胶原三维培养模型对乳腺癌细胞耐药性的影响研究", 《西部医学》, vol. 31, no. 11, pages 1663 - 1667 *
王瑜等: "基质硬度对2D 和3D 培养乳腺癌细胞摄取纳米制剂行为的影响", 《药学学报》, vol. 52, no. 8, pages 1324 - 1330 *

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