CN110917400B - 一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。本发明所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶由再生丝素蛋白水溶液与纳米羟基磷灰石通过预共混，经超声处理制备得到。本发明所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法通过改变超声条件和两种材料的混合比例，控制凝胶化时间，实现快速凝胶化，不仅避免了潜在有毒化学交联剂的使用，而且可以很好的保持细胞或者生物因子的活力。本发明制备出的纳米杂化丝素蛋白水凝胶具有可调控的凝胶性能和机械性能、良好的细胞相容性和骨诱导能力，不仅可以负载干细胞进行骨缺损修复，还有望用于包埋活性因子进行协同治疗。

Description

一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
再生丝素蛋白是由桑蚕茧中提取的动物来源蛋白，具有资源丰富、低免疫性、可调的生物降解性能和良好的血液相容性等优点，是在骨缺损修复领域颇有应用前景的天然材料。由于桑蚕丝蛋白不同于柞蚕丝素蛋白，其本身没有用于细胞识别的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)短肽序列，因此增加桑蚕丝生物材料的细胞响应性是其应用于组织工程领域的要点之一。人工合成的纳米级羟基磷灰石(nHA)与自然骨的无机成分有相近的矿物相组成和晶体结构，研究表明纳米级羟基磷灰石具有增加成骨细胞黏附和蛋白附着的能力，将桑蚕丝素蛋白与其复合制备用于组织工程修复支架是实现骨再生的研究热点。
然而目前公布的制备羟基磷灰石/再生丝素蛋白杂化材料往往存在支架要预先成型的问题，难以适应不规则的骨缺损部位，如专利CN200610009993.4公开的“纳米羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架及其制备方法”和专利CN102085391A公开的“羟基磷灰石/壳聚糖-丝素蛋白纳米复合材料及制备方法”，都是先制备成一定形状的支架，在临床上使用不方便。
在骨缺损修复的领域，一个发展趋势是开发新型的负载多功能干细胞的可注射水凝胶。
丝素蛋白水凝胶具有含水量高、结构与细胞外基质类似、生物相容性好、可生物降解、力学性能良好等特点，在药物缓释、细胞培养、组织工程等生物医用领域得到了广泛应用。但传统的丝素蛋白水凝胶往往具有以下缺点：一、凝胶化时间过长，一般凝胶化时间在几天到几周不等，限制其在临床上的应用；二、形成凝胶需要加入交联剂或离子盐等，如专利CN103965491A公开的“一种丝素蛋白复合凝胶的制备方法”，需要外加交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，这不利于保持包埋在凝胶中的细胞或生物因子的活力。
因此，开发一种工艺简单、凝胶化时间可控且能保持干细胞活力的丝素蛋白水凝胶并将其用于骨缺损修复领域是未来研发的重点。
发明内容
本发明的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法。本发明通过将纳米级羟基磷灰石和再生丝素蛋白水溶液混合后，于一定条件下进行超声处理制备得到杂化丝素蛋白水溶液。具体地，通过改变纳米级羟基磷灰石与再生丝素蛋白的混合比例及其混合液的超声条件，使凝胶化时间控制在几十秒到几十分钟不等。另外，所得的杂化丝素蛋白水凝胶可用于牙周干细胞包埋，并能很好的保持牙周干细胞的活力，特别适用于骨缺损的再生修复。
本发明的另一目的是提供通过上述制备方法得到的纳米杂化丝素蛋白水凝胶。
本发明的再一目的是提供上述纳米杂化丝素蛋白水凝胶的应用。
本发明的上述目的通过以下方案予以实现：
一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蚕茧和NaCO3水溶液进行煮沸脱胶、洗涤烘干后即得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维和LiBr溶液混合，溶解，得到溶液A；将溶液A透析、过滤，得到再生丝素蛋白水溶液；
(2)将纳米级羟基磷灰石(nHA)溶液和步骤(1)中的再生丝素蛋白水溶液混匀后，超声，得到凝胶化时间可控的nHA杂化丝素蛋白水溶液；
(3)将步骤(2)制备得到的杂化丝素蛋白水溶液与干细胞混匀，原位凝胶化后进行细胞培养，即得纳米杂化丝素蛋白水凝胶。
步骤(1)中所述的NaCO3水溶液的浓度为0.02M。
步骤(1)中所述的NaCO3水溶液的用量优选按NaCO3水溶液：蚕茧＝质量比45～55:1配比计算；更优选按NaCO3水溶液：蚕茧＝质量比50:1配比计算。
步骤(1)中所述的煮沸时间为15～45min；优选为30min。
步骤(1)中所述的煮沸脱胶的处理次数优选为两次。
步骤(1)中所述的溶解的条件优选为45～70℃溶解1～4h。
步骤(1)中所述的LiBr溶液的浓度优选为9～9.5M；更优选为9.3M。
步骤(1)中所述的溶液A中的丝素蛋白的质量分数为15％～20％。
步骤(1)中所述的透析的条件优选为于4～10℃条件下进行透析。
步骤(1)中所述的透析优选为通过纯水进行透析。
步骤(1)还包括稀释或浓缩步骤，在过滤步骤后进行。
所述的浓缩为通过浓缩剂进行浓缩。
所述的浓缩剂优选为聚乙二醇溶液；更优选为质量分数为10％～30％的聚乙二醇水溶液；最优选为聚乙二醇分子量为20000、质量分数为10％～30％的聚乙二醇水溶液。
所述的浓缩的时间优选为6～24h。
步骤(1)中所述的再生丝素蛋白水溶液中再生丝素蛋白的浓度为质量百分比3％～15％；更优选为质量百分比5％～8％。
步骤(1)中所述的再生丝素蛋白水溶液需在低温下保存；优选在4～10℃条件下保存。
步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石(nHA)的粒径小于200nm；更优选为小于100nm。
步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石溶液中纳米级羟基磷灰石的浓度为15～30mg/mL。
步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石溶液优选为纳米级羟基磷灰石水溶液。
为增加干细胞在纳米杂化丝素蛋白水凝胶中的存活率并有效刺激干细胞往成骨方向分化，同时保证纳米级羟基磷灰石在再生丝素蛋白基质中的分散性。步骤(2)中所述的纳米级羟基磷灰石的用量优选为按相当于所述的再生丝素蛋白质量的2％～30％计算；更优选为按相当于所述的再生丝素蛋白质量的5％～15％计算。
步骤(2)中所述的超声的条件优选为50～200W超声5～120s；更优选为于100～200W超声30～60s；最优选为150～200W超声30～50s。纳米级羟基磷灰石溶液和再生丝素蛋白水溶液在上述超声条件下，可实现：(1)通过控制超声频率和时间控制往体系输入的能量，避免凝胶温度过高；(2)避免超声诱导引起的β折叠自组装速度过快或过慢，达到控制凝胶化时间在使用需求之内的目的。
步骤(2)中所述的超声处理通过探针式超声震荡仪进行。
为使干细胞能在凝胶基质中更好地存活，同时发挥最大的修复效率。步骤(3)中所述的干细胞的密度为3×103～6×105个/mL；优选为5×105个/mL。
步骤(3)中所述的干细胞优选为牙周干细胞。
步骤(3)中所述的凝胶化时间优选为10～600s；优选为300s。
一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶，由上述制备方法制备得到。
所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶在制备生物医学工程材料中的应用，特别适合于制备用于骨组织工程修复的生物医学工程材料；尤其是制备用于骨缺损的再生修复的生物医学工程材料。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶由再生丝素蛋白水溶液与纳米级羟基磷灰石通过预共混，经超声处理制备得到。不同于以往的羟基磷灰石杂化的丝素蛋白支架或传统丝素蛋白水凝胶，本发明公开的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，通过改变超声条件和两种材料的混合比例，控制凝胶化时间，实现快速凝胶化，不仅避免了潜在有毒化学交联剂的使用，而且可以很好的保持细胞或者生物因子的活力。另外，体系本身具有优良的诱导干细胞成骨分化的特性，不需外加骨诱导的生长因子，避免了使用价格高昂的生长因子，对这种水凝胶的推广应用具有很好的现实意义，应用上更具有优势。此外，在制备再生丝素蛋白水溶液过程中，溶液A的低温透析条件以及将制得的再生丝素蛋白水溶液进行低温保存条件有利于进行后续的包埋细胞操作，对最终的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的性能具有积极作用。而且，再生丝素蛋白水溶液经超声处理后，能在一定时间内保持可流动的状态，可与治疗用的干细胞混合，当注射进体内骨缺损的位置，又可快速凝胶化，原位形成稳定且具有一定机械强度的包埋干细胞的水凝胶支架。本发明中，作为纳米杂化丝素蛋白水凝胶组分之一的丝素蛋白来源于自然界，安全无毒，具有非常好的生物相容性和降解性，且来源广泛、价格低廉。丝素蛋白经纯化得到的再生丝素蛋白水溶液，本属于惰性生物材料，与具有良好骨诱导能力的纳米级羟基磷灰石复合后，赋予纳米杂化丝素蛋白水凝胶良好的生物活性和细胞响应性。选用超声这种温和绿色简单的处理方法，避免了使用化学试剂和严苛的处理条件，有效地扩展了丝素蛋白水凝胶的临床使用范围。利用这种可注射凝胶负载具有多方面分化潜力的牙周干细胞，可以很好的保持干细胞活力，为实现可注射凝胶负载干细胞进行骨缺损修复提供依据。
(2)本发明制备出的纳米杂化丝素蛋白水凝胶具有可调控的凝胶性能和机械性能、良好的细胞相容性和骨诱导能力，不仅可以负载干细胞进行骨缺损修复，还有望用于包埋活性因子进行协同治疗。将本发明所述方法制备的纳米杂化丝素蛋白水凝胶作为新型活性因子或细胞载体用于组织工程领域具有一定的应用前景。
(3)本发明的工艺简单，操作方便，对环境无危害，所需设备及原材料廉价。
附图说明
图1为人牙周膜干细胞的鉴定图；A为在倒置显微镜下克隆状细胞的形貌图；B为消化传代后克隆状细胞的形貌图；C为抗波形蛋白的荧光染色结果图；D为间充质组织标记物的荧光染色结果图；E为倒置相差显微镜下矿化结节形成情况结果图；F为hPDLSCs经成脂诱导3周后的脂滴形成情况结果图；G为hPDLSCs的流式细胞学检测结果图。
图2为超声法制备纳米杂化丝素蛋白水凝胶的示意图。
图3为纳米级羟基磷灰石水分散液和再生丝素蛋白分散液透过率的变化图。
图4为不同纳米杂化丝素蛋白水凝胶的应变曲线图。
图5为标尺分别为50μm和10μm时，不同纳米杂化丝素蛋白水凝胶的扫描电镜图；其中，上面一行四幅图片的标尺为50μm，下面一行四幅图片的标尺为10μm。
图6为人牙周膜干细胞种植在纯的再生丝素蛋白水凝胶及5％纳米羟基磷灰石杂化丝素蛋白水凝胶中培养三天后的染色荧光图；其中，绿色代表活细胞，红色代表凋亡细胞或再生丝素蛋白基质。
图7为人牙周膜干细胞分布种植在纯丝素蛋白水凝胶及不同纳米杂化丝素蛋白水凝胶中培养三天后的染色荧光图；其中，绿色代表活细胞，红色代表凋亡细胞或再生丝素蛋白基质。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所涉及的试剂、方法，如无特殊说明，均为本领域常用的试剂和方法，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
纳米级羟基磷灰石(商品号：677418，CAS号：12167-74-7)购自西格玛奥德里奇公司，粒径小于200nm；
蚕茧购自广西平果桑移天下丝绸有限公司；
α-MEM培养基购自北京利维平生物科技有限公司。
人牙周膜干细胞(hPDLSCs)，实验室提取培养，步骤如下：获患者及家属知情同意，并经中山大学光华口腔医学院伦理委员会批准后，收集2015年4月至8月期间，在中山大学附属口腔医院颌面外科门诊因正畸需要拔除的健康前磨牙(14～16岁，男女各半)。临床确认无龋病及牙周疾病后，将离体置于含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，2h内完成原代分离。无菌环境中，用α-MEM培养基润洗离体牙3次去除表面血渍，用11号尖刀片刮取根中1/3表面牙周膜组织；将所收集的牙周膜组织剪成约1mm3的组织块，在含有3mg/mLⅠ型胶原酶和4mg/mL中性蛋白酶的α-MEM培养基中，37℃消化1h，期间每5min震荡一次使其均匀消化；然后加入含10％FBS的α-MEM完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，去除上清，加入少量培养基重悬后接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中，4h后再加入4mLα-MEM完全培养基继续培养至细胞克隆形成，7～10天后倒置显微镜下可见散在克隆集落形成，收集克隆样生长的细胞进行传代培养，并进行细胞鉴定。
干细胞鉴定：
(1)取第3代上述收集的细胞，经胰酶消化，后加入α-MEM完全培养基终止消化，1000rpm离心5min去除上清后，加入培养基重悬细胞，反复轻柔吹打使细胞充分分散，制备成单细胞悬液。梯度稀释后取900个细胞接种至直径10cm细胞培养皿中。12天后，吸除原培养基，PBS轻柔洗涤3次，室温下4％多聚甲醛固定20min，再用PBS(pH7.4、0.01mol/L)洗涤3次。然后用0.1％结晶紫染色30min，PBS轻揉清洗3次，每次5min，吸干PBS后用Sony相机拍照记录结果。在倒置显微镜下观察克隆形成情况，以细胞个数大于50的细胞集落作为克隆进行计数和拍照。
原代培养的牙周膜干细胞在培养7～10天后见散在细胞克隆形成，细胞呈贴壁生长。收集上述细胞后以低密度接种于培养板观察细胞克隆形成能力，12天后结晶紫染色，肉眼可见散在多个克隆集落形成。在倒置显微镜下观察克隆状细胞呈集落状或巢式生长，类似于成纤维细胞集落，细胞呈长梭形纤维样细胞，细胞之间排列紧密，每个克隆约有数百个细胞(图1A)。收集克隆状细胞继续培养，当细胞融合率为约80％时进行消化传代，细胞可逐渐由圆球形重新贴壁伸展成长梭形，胞体丰满，胞质均匀，细胞核呈卵圆形居于细胞中央(图1B)。
(2)取上述收集的克隆状生长的细胞2000个接种于24孔板内的细胞爬片上，2天后弃去原培养基，PBS轻揉清洗细胞2次。4％多聚甲醛室温固定细胞15min。0.1％TritonX-100通透细胞膜，加入含1％BSA的PBST封闭30min。在孔板内滴加鼠抗人Vimentin抗体、鼠抗人Cytokeratin抗体(1:100，用含1％BSA的PBST进行稀释)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜。次日，去除一抗，PBS洗涤后，避光下滴加Donkey Anti-Mouse IgG荧光二抗(用1％BSA的PBST稀释)，37℃染色45min。避光条件下PBS洗涤3次，加Hochest33342(1:10000；原浓度1mg/mL)染色2-3min，PBS洗涤后封片。荧光显微镜下观察染色结果并拍照，图片应用Leica Version 3.8.0软件处理。
对所收集的hPDLSCs进行免疫荧光染色，其结果显示，hPDLSCs阳性表达细胞抗波形蛋白(Vimentin)(图1C)，但不表达细胞抗角蛋白(Cytokeratin)。即hPDLSCs表达间充质组织标记物，不表达上皮组织标记物(图1D)，说明实验所获得的hPDLSCs来源于间充质组织，且无上皮来源的细胞污染。
(3)收集第3代上述细胞，制备单细胞悬液。分别以200μL分装到EP管中，各管细胞数约1×106个。除空白管外，每个离心管分别加入2μL用含1％BSA的PBS稀释PE标记的CD34、CD44、CD90、CD105、CD146和FITC标记的CD166抗体(用于干细胞检测的抗体购自Thermofisher)，4℃避光孵育1h，800r/min离心5min，然后将细胞重悬于300μLPBS。Fortessa流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性表达率，FlowJo软件分析结果。
对所获得的第3代hPDLSCs进行流式细胞学检测，结果显示hPDLSCs高表达间充质干细胞表面标记物CD44(99.7％)，CD90(98.6％)，CD105(99.8％)，CD146(57.6％)，CD166(98.6％)，低表达造血干细胞表面标记物CD34(0.919％)，符合间充质干细胞的表面免疫表型特点(图1G)。
(4)取第3代上述细胞(1×105个)接种于24孔培养板中，80％细胞融合时换成成骨诱导液(标准培养基、2Mβ-甘油磷酸钠、100μM维生素C、20μM地塞米松)，每2～3天更换新鲜成骨诱导液。培养28天后显微镜下见细胞呈复层生长并出现结节，4％多聚甲醛室温固定10min，加入2％茜素红染液(pH 4.2)室温染色30min，PBS洗涤后，倒置相差显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照。取第3代hPDLSCs，接种于培养孔板中。细胞经成骨诱导28天后，呈复层生长，细胞层明显增厚，可见许多颗粒样结晶，并连接成片。茜素红染色见红褐色大小不等的矿化结节形成，界限不清(图1E)。
(5)取第3代(1×105个)接种于24孔板中，待细胞生长达到100％融合时更换为成脂诱导液(A液：标准培养基、100μM吲哚美辛、0.5mM IBMX、10μg/mL胰岛素、1μM地塞米松；B液：标准培养基、10μg/mL胰岛素)进行成脂诱导。先在A液中培养2天，然后用B液培养1天，如此A液与B液交替循环进行培养。成脂诱导至3周时，PBS清洗3次，4％多聚甲醛室温固定15min，加入0.5％油红O室温染色30min。显微镜下观察脂滴形成情况并拍照。
细胞经成脂诱导3周后，显微镜下可见胞浆内大量脂滴形成，大小不等。油红O染色后，呈现为红色串珠状脂滴(图1F)。
实施例1
一种纳米级羟基磷灰石杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)按1:50(质量比)的浴比将蚕茧加入到浓度为0.02M的碳酸钠溶液中煮沸30min，重复两次，纯水洗涤数次，扯松，40℃干燥。按照质量分数为15％的浓度称取干燥好的蚕丝蛋白，用浓度为9.3M的LiBr溶液于60℃溶解2h，然后装入截留分子量为3500的透析袋，于4℃纯水透析三天，期间每6h换一次水，纱布过滤除去不溶性沉淀，即得再生丝素蛋白水溶液；4℃冰箱保存。
(2)按照15mg/mL的浓度将纳米级羟基磷灰石分散于纯水溶液中，搅拌2h，分散均匀。将羟基磷灰石水溶液加入到上述再生丝素蛋白水溶液中，其中，纳米级羟基磷灰石水溶液的用量按纳米级羟基磷灰石相当于再生丝素蛋白质量的5％、10％、15％计算，设置对照组：再生丝素蛋白组(用水代替纳米羟基磷水溶液的量)和5％纳米级羟基磷灰石组(用水代替再生丝素蛋白的量)。用一次性塑料管反复吸取，混合均匀，利用紫外分光光度计测量纳米级羟基磷灰石水分散液和再生丝素蛋白分散液在550nm波长处透过率的变化，结果如图3所示。
从图3可以看出：直接分散在水中的纳米级羟基磷灰石很快就分层，表现出来的是透过率迅速增加，而在再生丝素蛋白溶液中分散的纳米级羟基磷灰石可以稳定分散2天，然后逐渐出现分层。
(3)取10mL混合了纳米级羟基磷灰石的再生丝素蛋白水溶液，置于25mL的小烧杯中，用探针式超声震荡仪进行处理，处理的条件为：150w的超声功率超声处理30s，用移液枪吸取1mL超声处理的杂化丝素蛋白水溶液，转移至2mL的血清瓶，通过倒置瓶颈法测定凝胶化时间，凝胶化时间为5min。
(4)用移液枪吸取2mL步骤(3)超声处理的杂化丝素蛋白水溶液，转移至直径为35mm的塑料培养皿，静置0.5h，裁出直径为25mm的圆片，利用美国TA公司ARES/RFS型高级旋转流变仪进行测定，夹具为25mm的平板夹具，25℃下将凝胶圆片夹在平板中间，在动态应变扫描模式下进行测量，测量条件为频率(Frequency)：1rad/s，形变(Strain)：0.1～150％。结果如图4所示。
图4的结果显示，纳米级羟基磷灰石的加入，可以提高再生丝素蛋白水凝胶的力学强度。
(5)将步骤(4)静置得到的纳米杂化丝素蛋白水凝胶用液氮猝冻，冷冻干燥机干燥48h，利用扫描电镜凝胶的微观形貌，如图5扫描电镜结果显示，纳米级羟基磷灰石在再生丝素蛋白基质中分散均匀，再生丝素蛋白基质表面覆盖着羟基磷灰石颗粒，而且随着羟基磷灰石量的增加，凝胶网络的内部联系更丰富。
实施例2
一种用于骨缺损修复的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)按1:50(质量比)的浴比将蚕茧加入到0.02M的碳酸钠溶液中煮沸30min，重复两次，纯水洗涤数次，40℃干燥；将干燥后的蚕丝蛋白用浓度为9.3M的LiBr溶液于60℃溶解1h，使溶解后的混合液中蚕丝蛋白的质量分数为15％，然后装入截留分子量为3500的透析袋，于10℃纯水透析三天，利用20％wt的聚乙二醇溶液(分子量为2万Da)将透析后的再生丝素蛋白水溶液浓缩成6％wt(通过干燥称重法确定)的再生丝素蛋白水溶液，纱布过滤除去不溶性沉淀，4℃冰箱保存。
(2)按照20mg/mL的浓度将纳米级羟基磷灰石分散于纯水溶液中，搅拌至分散均匀。将羟基磷灰石水溶液加入到上述再生丝素蛋白水溶液中，其中，纳米级羟基磷灰石水溶液的用量按纳米级羟基磷灰石相当于再生丝素蛋白质量的5％计算，设置对照组：再生丝素蛋白组(用水代替纳米羟基磷水溶液的量)。
(3)取10mL混合了纳米级羟基磷灰石的再生丝素蛋白水溶液，置于25mL的小烧杯中，选用150w的超声功率，超声处理50s，得到杂化丝素蛋白水溶液。用移液枪吸取1mL杂化丝素蛋白水溶液，按5×105个/mL的密度往杂化丝素蛋白水溶液中加入第3代人牙周膜干细胞，混合均匀，转移至48孔培养板，静置待完全凝胶化，按每孔加入0.5mL a-MEM培养基，培养3天，每半天更换一次培养基。
(4)第三天，用Live/Dead assay kit(Molecular Probes TM,Invitrogen,USA)检测干细胞的活死情况：避光条件下将荧光钙黄绿素-AM和红色乙锭二聚体-1解冻后与细胞实验用的pH 7.4磷酸盐缓冲液配成染色液，弃去原细胞培养液，每孔加入100～200微升染色液，25℃孵育30min，荧光显微镜下拍照(见图6)，其中，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表凋亡细胞或再生丝素蛋白基质。
从图6可知，相比纯的再生丝素蛋白水凝胶，加入纳米级羟基磷灰石后，细胞的粘附生长情况显著改善，细胞数量以及细胞的形态都优于纯的丝素蛋白水凝胶。
实施例3
一种用于骨缺损修复的纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，如图2所示，包括以下步骤：
(1)按1:50(质量比)的浴比将蚕茧加入到0.02M的碳酸钠溶液中煮沸30min，重复两次，纯水洗涤数次，40℃干燥；将干燥后的蚕丝蛋白用浓度为9.3M的LiBr溶液于60℃溶解1h，使溶解后的混合液中蚕丝蛋白的质量分数为15％，然后装入截留分子量为3500的透析袋，于10℃纯水透析三天，利用20％wt的聚乙二醇溶液(分子量为2万Da)将透析后的再生丝素蛋白水溶液浓缩成6％wt的再生丝素蛋白水溶液，纱布过滤除去不溶性沉淀，4℃冰箱保存。
(2)按照20mg/mL的浓度将纳米级羟基磷灰石分散于纯水溶液中，搅拌至分散均匀。将羟基磷灰石水溶液加入到上述再生丝素蛋白水溶液中，其中，纳米级羟基磷灰石水溶液的用量按纳米级羟基磷灰石相当于再生丝素蛋白质量的10％、15％计算，设置对照组：再生丝素蛋白组(用水代替纳米羟基磷水溶液的量)。
(3)取10mL混合了纳米级羟基磷灰石的再生丝素蛋白水溶液，置于25mL的小烧杯中，选用150w的超声功率，超声处理30s，得到杂化丝素蛋白水溶液。用移液枪吸取1mL杂化丝素蛋白水溶液，按5×105个/mL的密度往杂化丝素蛋白水溶液中加入第3代人牙周膜干细胞，混合均匀，转移至48孔培养板，静置待完全凝胶化，按每孔加入0.5mL a-MEM培养基，培养3天，每半天更换一次培养基。
(4)第三天，用Live/Dead assay kit(Molecular Probes TM,Invitrogen,USA)检测干细胞的活死情况：避光条件下将荧光钙黄绿素-AM和红色乙锭二聚体-1解冻后与细胞实验用的pH 7.4磷酸盐缓冲液配成染色液，弃去原细胞培养液，每孔加入100～200微升染色液，25℃孵育30min，荧光显微镜下拍照(见图7)，其中，绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表凋亡细胞或再生丝素蛋白基质。
从图7可知，纯的丝素蛋白水凝胶，细胞粘附生长情况较差，当加入纳米级羟基磷灰石后，细胞的粘附生长情况显著改善，当纳米级羟基磷灰石的质量占丝素蛋白质量15％时，细胞生长情况最好，细胞数量以及细胞的形态都明显优于其他组。
对比例1
一种纳米羟基磷灰石杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)按1:50(质量比)的浴比将蚕茧加入到浓度为0.02M的碳酸钠溶液中煮沸30min，重复两次，纯水洗涤数次，扯松，40℃干燥。按照质量分数为15％的浓度称取干燥好的蚕丝蛋白，用浓度为9.3M的LiBr溶液于60℃溶解2h，然后装入截留分子量为3500的透析袋，于25℃纯水透析三天，期间每6h换一次水，得到的丝素蛋白水溶液不透明，呈微黄色。
(2)按照20mg/mL的浓度将纳米级羟基磷灰石分散于纯水溶液中，搅拌至分散均匀。将羟基磷灰石水溶液加入到上述再生丝素蛋白水溶液中，其中，纳米级羟基磷灰石水溶液的用量按纳米级羟基磷灰石相当于再生丝素蛋白质量的15％计算，设置对照组：再生丝素蛋白组(用水代替纳米羟基磷水溶液的量)。
(3)取10mL混合了纳米级羟基磷灰石的再生丝素蛋白水溶液，置于25mL的小烧杯中，选用150w的超声功率，超声处理10s，发现混合液直接凝胶化。说明：在25℃透析处理的时候，再生丝素蛋白分子已经发生了构象变化，再做超声处理，加速其凝胶化过程，过短的凝胶化时间使得后续包埋细胞变得困难。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蚕茧和Na2CO3水溶液进行煮沸脱胶、洗涤烘干后即得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维和LiBr溶液混合，溶解，得到溶液A；将溶液A透析、过滤，得到再生丝素蛋白水溶液；
（2）将纳米级羟基磷灰石溶液和步骤（1）中的再生丝素蛋白水溶液混匀后，超声，得到凝胶化时间可控的nHA杂化丝素蛋白水溶液；
（3）将步骤（2）制备得到的杂化丝素蛋白水溶液与干细胞混匀，原位凝胶化后进行细胞培养，即得纳米杂化丝素蛋白水凝胶；
步骤（1）中所述的透析的条件为于4～10℃条件下进行透析；
步骤（2）中所述的超声的条件为50～200 W超声5～120 s。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）还包括稀释或浓缩步骤，在过滤步骤后进行。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中所述的再生丝素蛋白水溶液中再生丝素蛋白的浓度为质量百分比3%～15%；
步骤（2）中所述的纳米级羟基磷灰石的用量按相当于所述的再生丝素蛋白质量的2%～30%计算；
步骤（3）中所述的干细胞的密度为3×103～6×105 个/mL。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中所述的溶液A中的丝素蛋白的质量分数为15%～20%；
步骤（2）中所述的纳米级羟基磷灰石溶液中纳米级羟基磷灰石的浓度为15～30 mg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中所述的Na2CO3水溶液的浓度为0.02 M；
步骤（1）中所述的Na2CO3水溶液的用量按Na2CO3水溶液：蚕茧=质量比45～55: 1配比计算；
步骤（2）中所述的纳米级羟基磷灰石的粒径小于200 nm。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中所述的煮沸时间为15～45 min；
步骤（1）中所述的溶解的条件为45～70℃溶解1～4 h；
步骤（1）中所述的LiBr溶液的浓度为9～9.5 M；
步骤（1）中所述的再生丝素蛋白水溶液在4～10℃条件下保存。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的凝胶化时间为10～600 s。
8.一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述的纳米杂化丝素蛋白水凝胶在制备生物医学工程材料中的应用。
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