CN107715166A - 负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用，包括丝素蛋白的提取、纳米羟基磷灰石的制备、有机无机复合纳米纤维膜的制备和负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备。该敷料具有良好的组织修复效果，且制备方法简便易行，能够满足生物医学应用的需求。本发明所使用的间充质干细胞具有较强的增殖、分化能力，且取材方便，同时不存在社会伦理争议。本发明制备的复合纳米纤维具有良好的生物相容性、力学性能以及可控的降解性能，能够作为基底材料支持干细胞的生长，同时对干细胞分化起到诱导与调控作用，促进新组织的生成。本发明制备的生物敷料具有良好的组织修复效果，能够促进骨缺损部位的快速愈合。
Description
技术领域
本发明涉及一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法及其产品和应用，具体涉及一种利用静电纺丝技术制备有机无机复合纳米纤维膜材料，然后在材料表面负载间充质干细胞，形成具有潜在医用价值的生物敷料的方法。本发明属于纳米生物材料以及干细胞领域。
背景技术
生物材料经历了由完全生物惰性到具有生物活性、由不可降解到生物可降解的发展过程，如今已经发展到第三代。单一的生物材料大多具有两面性，即拥有各自优点的同时，在材料的应用中也存在着一定的弊端。天然生物大分子的生物相容性好，但往往力学强度较低，且降解速率较快；合成聚合物具有较高的力学强度与可控的降解速率，但细胞相容性与细胞响应性的欠缺会阻碍其进一步发展；无机生物材料力学性能好，但大多无法降解。因此，具有可控生物活性与生物降解性的复合材料将是新型生物材料发展的主流趋势。
在组织工程与再生医学领域，除了生物材料之外，种子细胞也是极为关键的一个要素。近年来，由于具有高度自我更新与诱导分化潜能，基于干细胞的基础研究与临床应用的发展日新月异。鉴于胚胎干细胞存在着严重的伦理道德问题，相比而言，另一种多能干细胞——间充质干细胞(MSC)已成为组织工程中的首选种子细胞。
一直以来，如何在体外实现缺损组织的快速且高效修复是困扰着材料学家和临床医生的一个难题。利用纳米技术与干细胞技术的结合，实现干细胞在纳米材料上的高效负载，制备纳米材料-干细胞复合体，为组织修复提供了一个新思路。因此，将间充质干细胞负载于复合纳米生物材料中，开发新型生物敷料，对于促进缺损组织的快速修复与增强组织修复效果都具有重要的意义。
发明内容
针对单一材料存在的性能缺陷以及胚胎干细胞存在的伦理问题，本发明的目的在于：提供一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法。可以将天然高分子、合成高分子、无机材料以及间充质干细胞等因素结合起来。
本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的产品。
本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，将丝素蛋白、聚消旋乳酸-聚己内酯共聚物以及羟基磷灰石进行混合后，溶解于溶剂中，利用静电纺丝技术制备复合纳米纤维，然后进行干细胞接种，得到负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，包括以下步骤：
(1) 丝素蛋白的提取
称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液，将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min，取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶，更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程，将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜；
配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇，将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min；
待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇，将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质，将溶液置于-80 °C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉；
(2) 纳米羟基磷灰石的制备
配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL，将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌，滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h；
弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性，水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥，干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体；
将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100min内继续升温至1000 °C并维持180 min，煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20 g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h，在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干，干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用；
(3) 有机无机复合纳米纤维膜的制备
分别称取一定量的SF、P(DLLA-co-CL)与HAp，按一定的比例混合后加入特定的溶剂中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp纺丝分散液，将分散液缓慢吸入10 mL玻璃注射器中，在一定的正负极电压与液体流速下进行静电纺丝，纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维膜；
(4) 负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备
将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽；
取对数期生长的状态良好的MSC，以一定的细胞密度接种于复合膜表面，在含有胎牛血清与青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维敷料。
本发明方法，将从家蚕蚕茧中提取的丝素蛋白、化学合成的聚消旋乳酸-聚己内酯共聚物以及共沉淀法制备的羟基磷灰石进行混合后，溶解于特定的溶剂中，利用静电纺丝技术制备复合纳米纤维，然后进行干细胞接种，开发出一种负载间充质干细胞的新型生物敷料。通过改变复合纳米纤维的组分及其配比、静电纺丝的工艺参数、间充质干细胞的种类以及培养介质等条件，制备出不同的生物敷料。该敷料具有良好的组织修复效果，且制备方法简便易行，能够满足生物医学应用的需求。
在上述方案基础上，所述的P(DLLA-co-CL)的DLLA/CL摩尔比为70/30、60/40、50/50；所述的SF与P(DLLA-co-CL)的摩尔比为70:30、60:40、50:50、40:60、30:70，且两者占纺丝液的质量分数之和保持8%不变；所述的HAp的占纺丝液的质量分数为0.4~4 %。
所述的纺丝液的溶剂为六氟异丙醇、甲酸、三氟乙酸中的一种。
所述的注射器针头与滚筒接收装置之间的电压为10~20 kV；所述的注射器针头与滚筒接收装置之间的距离为8~20 cm；所述的注射器推进速度为0.1~2 mL/h。
所述的滚筒接收装置的转速为100~800 rpm。
所述的间充质干细胞可以为骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织来源的MSC。
所述的MSC培养基中包含体积分数为10~20 %的胎牛血清与1%的青霉素/链霉素。
所述的MSC接种于复合膜表面的密度为5×103 ~ 5×104个细胞/cm2。
本发明提供一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，根据上述任一所述方法制备得到。
本发明提供一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料作为生物敷料促进骨缺损部位快速愈合的应用。
该敷料具有良好的组织修复效果，且制备方法简便易行，能够满足生物医学应用的需求。本发明的优点在于：
(1) 本发明以天然生物大分子、合成生物高分子以及生物活性陶瓷作为原料，通过静电纺丝技术制备复合纳米纤维，并实现间充质干细胞在其表面的高效负载。所用原料的生物安全性高，部分已是商业化产品。
(2) 本发明所使用的间充质干细胞具有较强的增殖、分化能力，且取材方便，同时不存在社会伦理争议。
(3) 本发明制备的复合纳米纤维具有良好的生物相容性、力学性能以及可控的降解性能，能够作为基底材料支持干细胞的生长，同时对干细胞分化起到诱导与调控作用，促进新组织的生成。
(4) 本发明制备的生物敷料具有良好的组织修复效果，能够促进骨缺损部位的快速愈合。
(5) 本发明方法简便易行、可操作性强，能进一步满足临床应用和规模化生产的需求。
附图说明
图1为实施例1所制备的复合纳米纤维膜材料的扫描电子显微镜图片；
图2为实施例1所制备的负载MSC的复合纳米纤维敷料的扫描电子显微镜图片。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液。将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min。取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶。更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程。将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜。
配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇。将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min。
待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇。将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质。将溶液置于-80°C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉。
配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL。将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌。滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h。
弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性。水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥。干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体。
将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100 min内继续升温至1000 °C并维持180 min。煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h。在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干。干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用。
选择DLLA/CL摩尔比为70/30的P(DLLA-co-CL)作为纺丝液中的聚合物组分，按照50:50的摩尔比分别称取SF与P(DLLA-co-CL)，再称取一定量的HAp，混合后加入一定量的六氟异丙醇中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp纺丝分散液，纺丝液中SF与P(DLLA-co-CL)质量分数之和为8%，HAp的质量分数为2.4%。将分散液缓慢吸入10 mL玻璃注射器中，进行静电纺丝。其中，注射器针头与滚筒接收装置之间的电压为20 kV，注射器针头与滚筒接收装置之间的距离为12 cm，注射器推进速度为1.6 mL/h，滚筒接收装置的转速为300 rpm。纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维膜。
将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽。
取对数期生长的状态良好的骨髓间充质干细胞，以104个细胞/cm2的密度接种于复合膜表面，在含有10%胎牛血清与1%青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维敷料。
图1为实施例1所制备的复合纳米纤维膜材料的扫描电子显微镜图片和图2为实施例1所制备的负载MSC的复合纳米纤维敷料的扫描电子显微镜图片。
实施例2
称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液。将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min。取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶。更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程。将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜。
配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇。将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min。
待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇。将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质。将溶液置于-80°C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉。
配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL。将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌。滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h。
弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性。水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥。干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体。
将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100 min内继续升温至1000 °C并维持180 min。煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h。在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干。干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用。
选择DLLA/CL摩尔比为50/50的P(DLLA-co-CL)作为纺丝液中的聚合物组分，按照40:60的摩尔比分别称取SF与P(DLLA-co-CL)，再称取一定量的HAp，混合后加入一定量的三氟乙酸中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp纺丝分散液，纺丝液中SF与P(DLLA-co-CL)质量分数之和为8%，HAp的质量分数为1.2%。将分散液缓慢吸入10 mL玻璃注射器中，进行静电纺丝。其中，注射器针头与滚筒接收装置之间的电压为10kV，注射器针头与滚筒接收装置之间的距离为15 cm，注射器推进速度为0.4 mL/h，滚筒接收装置的转速为100 rpm。纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维膜。
将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽。
取对数期生长的状态良好的脐带间充质干细胞，以3×104个细胞/cm2的密度接种于复合膜表面，在含有10%胎牛血清与1%青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维敷料。
实施例3
称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液。将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min。取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶。更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程。将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜。
配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇。将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min。
待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇。将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质。将溶液置于-80°C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉。
配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL。将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌。滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h。
弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性。水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥。干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体。
将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100 min内继续升温至1000 °C并维持180 min。煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h。在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干。干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用。
选择DLLA/CL摩尔比为60/40的P(DLLA-co-CL)作为纺丝液中的聚合物组分，按照60:40的摩尔比分别称取SF与P(DLLA-co-CL)，再称取一定量的HAp，混合后加入一定量的甲酸中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp纺丝分散液，纺丝液中SF与P(DLLA-co-CL)质量分数之和为8%，HAp的质量分数为3.6%。将分散液缓慢吸入10mL玻璃注射器中，进行静电纺丝。其中，注射器针头与滚筒接收装置之间的电压为15 kV，注射器针头与滚筒接收装置之间的距离为8 cm，注射器推进速度为0.8 mL/h，滚筒接收装置的转速为500 rpm。纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维膜。
将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽。
取对数期生长的状态良好的脂肪间充质干细胞，以5×103个细胞/cm2的密度接种于复合膜表面，在含有20%胎牛血清与1%青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维敷料。
Claims (10)
1.一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于，将丝素蛋白、聚消旋乳酸-聚己内酯共聚物以及羟基磷灰石进行混合后，溶解于溶剂中，利用静电纺丝技术制备复合纳米纤维，然后进行干细胞接种，得到负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，包括以下步骤：
(1) 丝素蛋白的提取
称取10 g的无水碳酸钠，溶解于2 L超纯水中，配制成5 g/L的Na2CO3水溶液，将20 g家蚕生丝置于其中，加热煮沸30 min，取出蚕丝，用大量超纯水进行冲洗，同时充分撕扯蚕丝以冲去其间的丝胶，更换新的碳酸钠溶液，重复一次煮沸与清洗过程，将脱胶后的蚕丝置于鼓风干燥箱中在60 °C条件下过夜；
配制摩尔比为1:8:2的氯化钙/超纯水/乙醇三元溶剂，先将CaCl2加入超纯水中，加热至80 °C，待其全部溶解后加入乙醇，将烘干后的蚕丝按一定的比例分块投入三元溶剂中，蚕丝与溶剂的比例为10% (w/v)，80 °C条件下溶解后搅拌40 min；
待丝素溶液冷却至室温后，将其倒入透析袋中，在流动的超纯水中透析三天，以除去溶液中的无机盐和乙醇，将透析后的溶液进行抽滤，过滤掉不溶性杂质，将溶液置于-80 °C超低温冰箱中过夜，然后在冻干机中冻干，得到固态的SF粉；
(2) 纳米羟基磷灰石的制备
配制500 mL 0.5 M的Ca(NO3)2溶液和300 mL 0.5 M的(NH4)2HPO4溶液，将50 mL浓氨水用Milli-Q超纯水稀释至500 mL，将Ca(NO3)2溶液加入三口烧瓶中，在室温下用蠕动泵滴加(NH4)2HPO4溶液并控制滴加速率为3 mL/min，同时以5 mL/min的速率滴加氨水，保持混合溶液的pH值在9.5与10之间，一边滴加一边以500 rpm的转速进行磁力搅拌，滴加完毕后，继续磁力搅拌5 h，然后静置陈化24 h；
弃去上层清液，用1 L无水乙醇进行淋洗和抽滤，然后用大量超纯水进行反复清洗和抽滤，直至滤液为中性，水洗结束后，再次用乙醇进行分散和抽滤，将滤渣置于60 ° C烘箱中干燥，干燥后的固体在红外灯下用研钵研碎，以150目筛网过筛，得到HAp的前驱体；
将前驱体置于马弗炉中煅烧，首先在100 min内升温至500 °C并维持5 min，然后在100min内继续升温至1000 °C并维持180 min，煅烧后的产物置于球磨机中，放置大球20 g和小球40 g，在400 rpm的转速下球磨15 h，在15 °C下以5000 rpm的转速离心10 min，然后用旋转蒸发仪在45 °C下将溶剂蒸干，在60 °C下烘干，干燥后的HAp产物用研钵研碎，并干燥保存备用；
(3) 有机无机复合纳米纤维膜的制备
分别称取一定量的SF、P(DLLA-co-CL)与HAp，按一定的比例混合后加入特定的溶剂中，超声分散并搅拌24 h以上，得到均一稳定的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp纺丝分散液，将分散液缓慢吸入10 mL玻璃注射器中，在一定的正负极电压与液体流速下进行静电纺丝，纺丝结束后，从滚筒接收装置表面小心揭下纤维膜，并置于真空干燥箱中干燥48 h，得到SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维膜；
(4) 负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备
将复合纳米纤维膜剪成所需的大小和形状，放入细胞培养板或细胞培养皿表面，用75%乙醇浸泡材料45 min以灭菌，然后用PBS漂洗材料6次，每次30 min，确保材料中的乙醇被除尽；
（5）取对数期生长的状态良好的MSC，以一定的细胞密度接种于复合膜表面，在含有胎牛血清与青霉素/链霉素的培养基中培养24 h，即得到负载MSC的SF/P(DLLA-co-CL)/HAp复合纳米纤维敷料。
2.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的P(DLLA-co-CL)的DLLA/CL摩尔比为70/30、60/40、50/50；所述的SF与P(DLLA-co-CL)的摩尔比为70:30、60:40、50:50、40:60、30:70，且两者占纺丝液的质量分数之和保持8%不变；所述的HAp的占纺丝液的质量分数为0.4~4 %。
3.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的纺丝液的溶剂为六氟异丙醇、甲酸、三氟乙酸中的一种。
4.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的注射器针头与滚筒接收装置之间的电压为10~20 kV；所述的注射器针头与滚筒接收装置之间的距离为8~20 cm；所述的注射器推进速度为0.1~2 mL/h。
5.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的滚筒接收装置的转速为100~800 rpm。
6.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的间充质干细胞可以为骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织来源的MSC。
7.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的MSC培养基中包含体积分数为10~20 %的胎牛血清与1%的青霉素/链霉素。
8.根据权利要求1所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料的制备方法，其特征在于所述的MSC接种于复合膜表面的密度为5×103 ~ 5×104个细胞/cm2。
9.一种负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料，其特征在于根据权利要求1-8所述方法制备得到。
10.根据权利要求9所述负载间充质干细胞的复合纳米纤维敷料作为生物敷料促进骨缺损部位快速愈合的应用。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110453378A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-11-15 | 上海大学 | 一种磺酸基量子点/丝素蛋白复合纳米纤维膜及其制备方法和应用 |
| CN110917400A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 中山大学 | 一种纳米杂化丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
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| CN101502671A (zh) * | 2009-02-05 | 2009-08-12 | 东华大学 | 丝素蛋白/p(lla-cl)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法 |
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2017
- 2017-11-07 CN CN201711086337.9A patent/CN107715166A/zh active Pending
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