CN103861154B - 一种双层复合骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型双层复合骨组织工程支架及其制备方法，该双层骨组织工程支架是由外层细菌纤维素膜和内层PLGA/MWNTs静电纺丝多孔支架构成。本发明利用真空冷冻干燥法和高压静电纺丝法，将合成材料PLGA与天然成分细菌纤维素和无机成分多壁碳纳米管复合在一起形成复合材料，优势互补，构建了性能优良又相对便宜的较理想的PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架。本发明的PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架制备方法简单，条件温和，具有良好的细胞生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型骨组织工程支架具有良好的应用前景。<u />

Description

一种双层复合骨组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种双层复合骨组织工程支架及其制备方法。

背景技术

严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战，一直是人类几个世纪以来不断深入研究和探索的重要课题。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷：自体骨移植是公认的骨组织修复的金标准，但是患者要经受自体组织移植手术的创伤，而且供区有限，因此，自体骨移植不能视为理想的骨缺损的修复方法；异体骨移植存在免疫排斥反应、疾病传播等风险，有时甚至危及病人生命；人工骨植入容易导致异物排斥反应、感染等。因此，有必要寻找一种新的骨缺损的修复手段。

在此情况下，组织工程学的兴起和发展，为骨缺损的修复提供了新的可能，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望。

骨组织工程学是应用生命科学和工程学的原理及技术，构建、培育活组织，研制生物替代物，以修复或重建骨的天然结构、维持或改善其功能。

骨组织工程包括支架、细胞和生长因子这三要素。支架为细胞的生长代谢提供场所；种子细胞增殖分化后形成新生组织；生长因子是具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞表型、控制细胞分化等生物学效应的蛋白类物质，其对促进细胞增殖、组织或器官的再生修复都具有重要的作用。三者相互依存，缺一不可。

组织工程支架是骨组织工程的核心环节之一。它为细胞的生长，营养和气体交换、废物排泄和生长代谢提供场所。支架不仅影响细胞的附着、增殖和分化，而且决定着移植后，组织工程骨能否与自体骨组织相适应并融合在一起，修复缺损骨组织并发挥功能。

一个理想的骨组织工程支架应该模拟天然细胞外基质的纤维状结构以及组织特定的生物学功能。因此，理想的骨组织工程支架应具备以下条件：

1.良好的生物相容性，即无明显的细胞毒性、不致畸形，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应和免疫排斥，还要有利于种子细胞的粘附、增殖，更重要的是能激活细胞特异的基因表达，维持正常细胞的表型表达；

2.可降解性和降解速率的可控性，即与细胞、组织生长速率相适应的降解吸收速率；

3.适宜的孔尺寸、高的孔隙率和相连的孔形态，较大的比表面积。这种结构可以提供宽大空间，以利于大量细胞的粘附、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长；

4.特定的三维外形，以获得所需的组织或器官形状；

5.一定的机械强度和韧性，即与植入部位组织的力学性能相匹配的结构强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提供合适的微应力环境，为新生组织提供支持；

6.易加工、易塑形、易于消毒和保存。

目前骨组织工程支架材料包括无机材料和有机材料两大类。

有机材料在硬组织修复替代领域最早应用于骨骼，并被广泛用作骨修复材料，主要包括聚乳酸(PLA)、聚乙酸(PGA)、聚乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚酸酐、聚磷腈、聚原酸酯等。有机材料中研究较多的是聚羟基酸类(主要包括PLA、PGA、PLGA)。这一类高分子聚合物由于其良好的生物相容性已获得美国FDA批准，广泛应用于医学领域。其中，PLGA是由PLA和PGA形成的高分子共聚物，改变PLA与PGA的比例，可调节PLGA的力学强度及其在体内的降解时间。PLGA具有很好的组织相容性，已被美国FDA批准用于临床，是迄今应用最多的骨修复材料之一。但PLGA机械强度较差、降解产物略呈酸性，易引起体内炎症反应，而且由于PLGA表面亲水性差，分子链中缺乏活性功能基团，其生物活性稍差，使其与特定细胞相互作用变得比较困难。

用于骨组织工程支架的无机材料主要包括羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)以及其他种类的陶瓷材料等。这类生物陶瓷材料由于其具有良好的生物活性和生物相容性，成为广泛应用的植骨代用品。尽管其具有良好的生物相容性及一定的降解性、较高的化学稳定性和较强的骨传导及骨诱导性等优点。但是这种材料具有不易塑形、强度不足、脆性大、降解率低等缺点。

碳纳米管(CNTs)也是无机材料的一种。它分为单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。MWNTs因具有低密度、比表面积大、力学性能和电磁性能优越、热稳定性高、生物相容性好等特点而在生物材料领域拥有广阔的应用前景。一方面，MWNTs超强的力学性能可以极大地改善复合材料的强度和韧性；另一方面，MWNTs在与血液、骨、软骨和软组织接触时，表现出了良好的生物相容性。因此，MWNTs如能作为组织工程支架材料将会在骨、软骨重建和皮肤粘膜修复等方面显示出巨大的优势。

由于有机、无机的单一材料都存在一些不足，很难满足理想的骨组织工程支架所要求的特性，所以可以通过合适的方法将几种单一材料复合，形成复合型材料，取长补短，以解决理想的骨支架的问题。生物复合材料是指由两种或两种以上不同材料复合而成的生物材料。研究表明，几乎所有的生物体组织都是由两种或两种以上的材料所构成。利用不同性质的单一材料复合形成复合材料，不仅兼具单一材料的性质，而且还可能得到单一材料所不具备的新的特性。

目前，将复合材料运用于骨组织工程研究，制备新型的复合生物材料，是国内外生物医用材料领域的研究热点和难点之一。比如，合成材料可以容易地加工成不同的形态和结构，设计制造过程中能对材料的许多性能进行控制，包括机械强度、亲水性、降解速率等。与之相比，天然材料不易加工，物理性能受限，但天然材料具有特殊的生物活性，并且通常不易引发受体的免疫排斥反应。因此实现材料优化设计的途径之一，是将合成材料与天然成分复合在一起形成复合材料，这对于构建较理想的骨组织工程支架具有重要作用。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种将各具特色的单一材料复合在一起，制备出具有良好亲水性能，力学性能好，骨诱导作用显著，细胞粘附性强，组织接合性好的可降解的双层复合骨组织工程支架；

本发明的另一目的是提供上述双层复合骨组织工程支架的制备方法。

为实现本发明目的所采取的技术方案为：

一种新型双层复合骨组织工程支架，其特征在于该支架是由以细菌纤维素材料构成的外层和以PLGA/MWNTs静电纺丝多孔材料构成的内层组成。

所述内层中，MWNTs的浓度控制在0～4％g/mL。

一种双层复合骨组织工程支架的制备方法，其特征是：首先采用真空冷冻干燥法制备外层细菌纤维素支架，然后以细菌纤维素支架为接收装置，采用高压静电纺丝法将由PLGA和MWNTs构成的内层电纺膜沉积在细菌纤维素支架上。

所述采用真空冷冻干燥法制备外层细菌纤维素支架的具体工艺步骤为：

1)清洗：将细菌纤维素放入0.2-0.3mol/L的NaOH碱液中，煮沸20-40分钟，用蒸馏水淋洗4-5次，直至PH值为中性，得到高纯度的细菌纤维素薄支架；

2)冷冻：将细菌纤维素薄支架放进真空冷冻干燥箱后开始降温，使温度缓慢下降到-15至-20℃，整个预冷冻过程持续时间为7-8小时；

3)干燥：当物料温度低于共晶点时，开启真空泵、排气阀以及各种计量装置，控制升华干燥的时间为11-12小时，解析干燥过程持续7-8小时。

所述共晶点为-11至-13℃。

所述内层纺丝液的制备方法为：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制PLGA的浓度为15-20％，然后加入MWNTs粉末，控制其浓度分别为0-4％g/mL，充分搅拌并超声震荡30-60分钟即可。

所述三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8：2～7：3。

在静电纺丝法中，喷射纺丝液的金属针头和接收纺丝液的细菌纤维素薄支架之间的接收距离为13-18cm，纺丝液的流量控制在0.2-0.5ml/h。

本发明将合成材料---聚乙交酯-丙交酯共聚物(PLGA)与天然成分---细菌纤维素和无机成分——多壁碳纳米管(MWNTs)复合在一起形成复合材料，优势互补，构建PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架。一方面，细菌纤维素、MWNTs可能改善PLGA的细胞亲和性和生物活性，减轻PLGA引起的无菌性炎症反应的发生率，另一方面，MWNTs可以提高PLGA的机械性能，从而更加符合理想的骨组织工程支架材料的要求。这种骨组织工程支架材料不仅能综合细菌纤维素的生物相容性和骨引导性，PLGA的降解可控性和MWNTs的力学性能等优势，有效避免了PLGA降解过程中而引起的无菌性炎症反应，还能够充分发挥引导骨组织再生的功能，这种材料复合和结构梯度化的概念在其它生物材料里也同样得到了应用。

静电纺丝(electrospinning)，是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺。由静电纺丝制备出的纳米纤维由于具有小尺寸、大比表面积和特殊的表面与界面效应，从而表现出传统纤维材料所不具备的独特性能，成为当今材料科学技术的前沿和研究热点。

目前，静电纺丝纤维的另一重要应用集中在组织工程方面。由于静电纺丝制备的纳米、微米级的纤维支架具有特殊的三维多孔结构，孔隙相互贯通，孔隙率高，比表面积大，与细胞外基质在形态和结构上非常相似，作为组织工程支架材料不仅能起到支撑细胞的作用，还能发挥模板的功能，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。因此，胶原、明胶、丝素蛋白、壳聚糖等天然高分子材料和聚乳酸、聚己内酯等人工合成生物高分子材料均可以通过静电纺丝制备成纳米纤维材料，广泛应用于软骨、骨、皮肤、血管、神经等组织工程和修复再生方面。

因此，本发明依据材料优化设计和结构梯度化的研究思路进行生物材料的合成设计，利用真空冷冻干燥法和高压静电纺丝法，将合成材料---PLGA与天然成分---细菌纤维素和无机成分多壁碳纳米管(MWNTs)复合在一起形成复合材料，优势互补，构建了性能优良又相对便宜的较理想的PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架。该复合骨组织工程支架，其外层为细菌纤维素材料,内层为PLGA/MWNTs静电纺丝多孔材料。外层的细菌纤维素层由于其优异的性能可以起到使伤口粘连良好和紧密、改善渗出物、减少感染几率、保护伤口、加快愈合的作用，而内层的多孔层可以作为支架，使骨生成细胞在其表面贴附、增殖分化为成骨细胞，成骨细胞沿支架内壁爬行，使骨缺损由两端向中央生长，支架起架桥连接作用，产生新骨，起到促进骨性愈合之目的。

本发明分别用扫描电镜、拉曼光谱、热重分析、孔隙率和比表面积测量仪以及万能力学测试机等对复合骨组织工程支架进行了理化性能表征。本发明还观察了大鼠骨髓间充质干细胞在复合支架上的粘附、增殖能力。结果表明PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架具有优良的力学性能、热稳定性、降解性能等，同时还具有良好的细胞生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型骨组织工程支架具有良好的应用前景。通过真空冷冻干燥法和高压静电纺丝技术制备的PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架在组织工程领域有较大的应用潜力，尤其是作为组织工程的支架用于组织再生。本发明对以后可降解性骨组织工程支架材料的合成与应用将会提供更广阔的前景，以适应各种临床硬组织缺损再生的需要。

一、PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的表征

(1)仪器与设备

扫描电子显微镜(JSM-5900LV，JEOL，日本)；拉曼光谱仪(LABRAM-HR,JY,法国)；差示扫描量热仪(TAInstrumentsDSC,Q100,美国)；万能力学测试机(Instron4302Microtester,美国)；表面与孔隙度测定仪(TriSTar3000，Micromeritics，美国)。

(2)实验方法

用扫描电子显微镜、拉曼光谱仪、万能力学测试机、差示扫描量热仪、比表面积与孔隙度测定仪等检测双层复合支架的表面形貌、机械性能、热学性能、比表面积和孔隙度以及降解性能等：双层复合支架在通风橱中放置2-3天，使复合物中残留的溶剂挥发完全后，取复合支架样本，将其表面经离子溅射仪喷金后，用扫描电镜观察复合支架的表面形态，然后采用SmileView图像分析软件进行扫描电镜照片中纤维直径的统计；用拉曼光谱仪测试复合支架的拉曼光谱；用差示量热扫描仪观察双层复合支架的玻璃化温度和分解温度。样品从30℃加热到400℃，升温速度为10℃/min，氮气通入速度为30ml/min；用万能力学测试机测试双层复合支架的抗张强度，弹性模量以及断裂伸长率。用螺旋测微仪测量双层复合支架的厚度，并将复合支架制成10mm×70mm的长条形试样进行拉伸测试，每一种试样的数量为5个，拉力机的拉伸速度为5mm/min；用比表面积与孔隙度测定仪检测双层复合支架的比表面积和孔隙度；用PBS浸泡法检测双层复合支架的降解性能。将20片内层为PLGA/2％MWNTs的双层复合支架分成四组，每组五个样，每个剪成约15×15mm大小。每组样品都被放在37℃水浴的50ml的磷酸盐缓冲液中(PBS，pH7.4)，共4周。PBS液每3-4天更换一次。在1,2,3,4周时，将样本取出，蒸馏水清洗样品，测量支架的降解情况。

结果显示，外层经真空冷冻干燥的细菌纤维素支架为纳米级纤维构成的立体网状结构，其纤维直径为几个到几十个纳米不等，交错形成互通的孔隙网状结构，内层的PLGA/MWNTs支架为长而连续的电纺纤维构成。PLGA/MWNTs支架是由超细纤维构成的三维多孔结构。MWNTs的加入增大了复合纤维的直径，例如，纯PLGA纤维的直径分布为400-1000nm，平均直径为727nm。当在PLGA基质中仅仅加入0.5％MWNTs后，PLGA/0.5％MWNTs复合纤维的直径分布为1100-1900nm，平均直径为1430nm。PLGA/1.0％MWNTs复合纤维的平均直径为2193nm，PLGA/2.0％MWNTs复合纤维的平均直径为2304nm。当增加MWNTs的含量到4％时，PLGA/4.0％MWNTs复合纤维的平均直径为1826nm，小于PLGA/1.0％MWNTs和PLGA/2.0％MWNTs复合纤维的平均直径。拉曼光谱证明了复合支架中存在MWNTs，MWNTs的特征性的G带和D带分别出现在1600cm^-1和1355cm^-1附近。热分析显示，双层复合支架的玻璃化温度在40-50℃，与PLGA的玻璃化温度相接近。当纤维中MWNTs含量增加时，复合支架的分解温度增高。PLGA/细菌纤维素纤维支架的分解温度为342.0℃，PLGA/0.5％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/1.0％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/4.0％MWNTs/细菌纤维素支架纤维的分解温度分别为342.1、345.8、349.6和346.6℃。这是因为与PLGA一样，MWNTs颗粒在加热过程中要吸收热量，因此纤维中的PLGA就需要更多的时间去吸收足够的热量以达到分解点。结果显示，将MWNTs加入到PLGA中增加了复合支架的热稳定性。机械性能分析表明，加入MWNTs后，双层支架的机械性能(弹性模量，抗张强度和断裂伸长率)明显优于内层为纯PLGA的双层支架。如内层为纯PLGA的双层支架抗张强度和断裂伸长率分别为5.49MPa和26.9％，而内层为PLGA/2.0％MWNTs双层支架的抗张强度比内层为纯PLGA的双层支架提高了36.2％，而断裂伸长率则提高了2.5倍。内层为PLGA/2.0％MWNTs的PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的比表面积为28.9m²/g,孔径约为151.5nm。降解实验显示，随着时间的延长,支架表面逐渐变得疏松,部分表面呈絮状,1,2,3,4周后，支架的降解率分别为3.4％，6.1％，8.9％和11.2％。

二、PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的体外细胞生物相容性

(1)主要试剂

α-MEM，胰蛋白酶，MTT，胎牛血清(Sigma公司，美国)，其余试剂均为分析纯。(2)仪器与设备

CO₂培养箱(Heraeus公司，德国)，酶联免疫检测仪(Benchmark,Bio-Rad,美国)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，中国苏州)。

(3)实验方法

①骨髓间充质干细胞的分离与培养：取6-8周龄SD雄性大鼠，体重150～200g，戊巴比妥钠(0.3～0.6mg/100g)腹腔注射麻醉。双下肢备皮，将大鼠胸部以下浸泡在75％酒精中10～15min，无菌切取其双下肢。超净工作台内剥除其股骨、胫骨上附着的肌肉组织，咬骨钳咬除其干骺端后，用注射器装入无血清的α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔。将所得的冲洗液置于25ml的培养瓶内，向瓶内加入约5ml的α-MEM培养基(含15％胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)。然后，将培养瓶置于37℃含5％CO₂饱和湿度的培养箱中恒温培养。1天后于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，3天后更换培养基，弃去未贴壁的细胞，以后每三天更换一次培养基。待贴壁细胞接近铺满瓶底时，0.5％胰蛋白酶消化，按1:2或1：3比例传代培养，获得原代骨髓间充质干细胞。取P3细胞待用。

②骨髓间充质干细胞的接种：实验组为内层支架MWNTs含量为2％g/ML的双层支架(PLGA/2％MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架)，空白对照组为内层为纯PLGA支架的双层支架(PLGA/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架)。将消毒后的材料放入六孔板中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶溶液约1ml消化，倒置相差显微镜下观察，当细胞逐渐变圆，并开始脱离瓶壁时，加入α–MEM培养基中止消化，用吸管轻轻吹打成细胞悬液并在光镜下计数，用培养基调整细胞浓度。将浓度为5×10⁴个/ml的细胞悬液常规接种于材料表面，每孔加入2ml，进行SEM，MTT测定；将浓度为1×10⁵个/ml的细胞悬液常规接种于材料表面，每孔加入2ml，进行碱性磷酸酶ALP测定。

③细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下观察样本侧壁及周边细胞的生长，并在培养24小时后，从各组分别取出一块材料，PBS漂洗3遍，2.5％戊二醛固定过夜，40-100％乙醇梯度脱水约20min，醋酸异戊脂置换，临界点干燥，样品喷金后扫描电镜观察细胞形态。

④细胞增殖情况测定-MTT法

将实验组和对照组的样品置于6孔板内，加入α–MEM培养基，然后将培养的细胞以5×10⁴个/ml的密度接种于放有试样的6孔板内，分别在第1，3，5天取每组试样加入MTT溶液(5mg/m1)40μl，37℃下继续培养4小时，终止培养，小心吸弃孔内的上清液，每孔加入420μl的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。吸取每孔中液体100ml到96孔板内，492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。

⑤细胞碱性磷酸酶ALP检测样本的收集

将实验组和对照组材料放入6孔板中，加入α–MEM培养基，然后将培养的细胞以1×10⁵个/ml的密度接种于样品上，培养第1，4，7天后分别取出样品，收集细胞。先用PBS漂洗3遍，洗净未附着的细胞，0.25％胰蛋白酶消化。然后将每个样本的细胞悬液加入离心管，1000转/分离心8分钟。用PBS液反复冲洗，吹打，再次离心，重复两次，去除胰酶影响。最后一次去上清液后将离心管倒置，待管壁液体去尽后在管中加入120μl的PBS液，反复吹打形成细胞悬液，移入EP管中，密封，-20℃低温保存备用。收集完所有样本后，将其置于-70℃的冰箱中反复冻融三次，使骨髓间充质干细胞破裂形成冻溶液。

结果显示，培养24小时后，在对照组表面，粘附细胞胞体呈圆形或细长梭形，面积较小，部分细胞开始发生铺展。而在实验组表面，细胞数量明显较对照组多，细胞分布均匀，细胞己经开始铺展，部分呈多突起状借伪足附着于材料表面，有些将伪足深入到支架的孔隙内部并与周围其它细胞相接触形成细胞网。这些结果说明加入MWNTs的支架更有利于细胞与材料间初始的相互粘附作用，也表明双层支架具有良好的细胞相容性。从培养的第1天到第5天，两组细胞的数量都随培养时间的增加而增加。培养第1天和第3天时，实验组细胞的数量都比对照组高，但彼此之间差异不大，各组之间无统计学差异(P>0.05)。培养第5天时，实验组细胞的数量与对照组相比有了显著的增加，具有统计学差异(P<0.05)。这也意味着培养在实验组上的细胞增殖的速度和活性明显高于对照组。ALP结果显示，随着时间的延长，实验组细胞ALP活性有明显增高，其ALP值在第7天时(2.63±0.54)比培养1d时(0.67±0.37)提高约4倍。与对照组相比较，实验组在第4天和第7天时ALP活性有统计学差异，说明细胞在实验组支架表面功能分化活力比对照组旺盛。结果表明，PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架对细胞没有毒性，且能明显促进细胞的体外增殖，具有良好的细胞生物相容性。

附图说明

图1为细菌纤维素膜、PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的实物图(从上至下分别为外层的细菌纤维素膜、PLGA/0％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/0.5％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/1.0％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素、PLGA/4.0％MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架)；

图2为外层细菌纤维素膜的扫描电镜图；

图3为PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的扫描电镜图；

图4为PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架的拉曼光谱图；

图5为PLGA/细菌纤维素(a)，PLGA/0.5％MWNTs/细菌纤维素(b)、PLGA/1.0％MWNTs/细菌纤维素(c)、PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素(d)、PLGA/4.0％MWNTs/细菌纤维素(e)双层复合骨组织工程支架的TGA曲线；

图6为PLGA/细菌纤维素(a)，PLGA/0.5％MWNTs/细菌纤维素(b)、PLGA/1.0％MWNTs/细菌纤维素(c)、PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素(d)、PLGA/4.0％MWNTs/细菌纤维素(e)双层复合骨组织工程支架的DTG曲线；

图7为SD大鼠骨髓间充质干细胞在PLGA/2.0％MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架上培养24小时的扫描电镜图。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是：实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权力要求书加以确定。

1、真空冷冻干燥法制备外层细菌纤维素支架

(1)主要试剂：

细菌纤维素购于海南椰果食品有限公司；NaOH为分析纯，购于成都科龙化学试剂厂。

(2)仪器与设备

真空冷冻干燥机(FD-1型，北京博医康实验仪器有限公司，中国北京)。

(3)实验方法

①清洗：将细菌纤维素放入0.2-0.3mol/L的NaOH碱液中，煮沸20-40分钟，用蒸馏水淋洗4-5次，直至PH值为中性，得到高纯度的细菌纤维素薄支架。

②冷冻：将细菌纤维素样品放进干燥箱后开始降温，使温度缓慢下降到-15至-20℃。整个预冷冻过程持续时间为7-8小时。

③干燥：当物料温度降到共晶点(-11至-13℃)以下时，开启真空泵、排气阀以及各种计量装置。整个升华干燥的时间为11-12小时。整个解析干燥过程持续7-8小时。

2、用高压静电纺丝法制备PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架

(1)主要试剂

PLGA(分子量1×105g/mol，PLA:PGA＝75:25，山东岱罡生物技术有限公司，济南)；

MWNTs(长度0.5-2μm，直径8-15nm，纯度＞95％)购于中科院成都化学研究所；

其余试剂均为分析纯。

(2)仪器与设备

高压静电纺丝机(永清华源生物材料科技有限公司)；超声波清洗机(KQ-100DE，昆山舒美超声仪器有限公司，中国上海)。

(3)实验方法

①内层纺丝液的配置：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中(三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8:2-7:3)，使PLGA的浓度为15-20％，加入MWNTs粉末浓度分别为0-4％g/mL，充分搅拌并超声震荡30-60分钟，作为纺丝液备用。

②静电纺丝法制得PLGA/MWNTs/细菌纤维素双层复合骨组织工程支架：使用高压静电纺丝设备，将纺丝液装入注射器，将一个7号金属针头尖端磨平并与注射器相连，将注射器安放在螺杆驱动器上，同时使注射器的金属针头与高压电源相连，将用真空冷冻干燥法制备得到的外层细菌纤维素膜放在接地的转鼓上作为接收装置，金属针头与接收装置之间的距离为接收距离，接收距离13-18cm。开启螺杆驱动器电源，装有纺丝液的注射器便由螺杆驱动器推动并控制流量，将流量均设定为0.2-0.5ml/h，纺丝液供给到喷丝头然后流入毛细管后形成滴液；开启高压静电发生器电源，喷丝头上即加载了高压静电，电压到达一定值时(15-20KV)，纺丝液射流即从喷丝头中喷出，开始静电纺丝。在高压静电纺丝过程中，疏松多孔，具有三维纤维结构的PLGA/MWNTs超细纤维不断沉积在接收装置(细菌纤维素单层支架)上形成纤维复合支架，纺丝结束后，即可制备得到双层结构的复合骨组织工程支架。将制得双层复合骨组织工程支架置于干燥器中过夜。

Claims (4)

1.一种双层复合骨组织工程支架，其特征在于该支架是由以细菌纤维素材料构成的外层和以PLGA/MWNTs静电纺丝多孔材料构成的内层组成，其制备内层的纺丝液中MWNTs的浓度控制在0.5～4%g/mL，PLGA的浓度为15-20%。

2.一种如权利要求1所述的双层复合骨组织工程支架的制备方法，其特征是：首先采用真空冷冻干燥法制备以细菌纤维素材料构成的外层，然后以外层为接收装置，采用高压静电纺丝法将以PLGA/MWNTs静电纺丝多孔材料构成的内层沉积在外层上；

上述采用真空冷冻干燥法制备以细菌纤维素材料构成的外层的具体工艺步骤为：

1）清洗：将细菌纤维素放入0.2-0.3mol/L的NaOH碱液中，煮沸20-40分钟，用蒸馏水淋洗4-5次，直至PH值为中性，得到细菌纤维素支架；

2）冷冻：将细菌纤维素支架放进真空冷冻干燥箱后开始降温，使温度缓慢下降到-15至-20℃，整个预冷冻过程持续时间为7-8小时；

3）干燥：当物料温度低于共晶点时，开启真空泵、排气阀以及各种计量装置，控制升华干燥的时间为11-12小时，解析干燥过程持续7-8小时；

所述内层的纺丝液的制备方法为：将PLGA溶解在三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制PLGA的浓度为15-20%，然后加入MWNTs粉末，控制其浓度分别为0.5-4%g/mL，充分搅拌并超声震荡30-60分钟即可，其中三氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为8：2～7：3。

3.按照权利要求2所述的双层复合骨组织工程支架的制备方法，其特征在于所述共晶点为-11至-13℃。

4.按照权利要求2所述的双层复合骨组织工程支架的制备方法，其特征是:在静电纺丝法中，喷射纺丝液的金属针头和接收纺丝液的细菌纤维素支架之间的接收距离为13-18cm，纺丝液的流量控制在0.2-0.5ml/h。