CN106924171B - 一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，通过先在中空结构的MWNTs上负载抗癌药物DOX，即为负载DOX的MWNTs粉体；之后再将负载DOX的MWNTs粉体与可生物降解的高分子PLGA在特定条件下进行静电纺丝，得到复合纳米纤维膜；最后将复合纳米纤维膜进行破碎、均质处理后，制得的所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维具有良好的缓释性能，可注射，药物利用率高，稳定性高，能够更精准、有效、安全地对肿瘤部位进行治疗；具有良好的血液相容性和细胞相容性，杀伤癌细胞的同时对人体正常组织细胞基本不造成损伤；能够自发两种荧光，被人体细胞吞噬，能实现对癌细胞治疗机理进行研究。

Description

一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维DOX/MWNTs/PLGA及其制备方法和应用。
背景技术
随着环境污染的加剧以及人们不良习惯的养成，使得癌症的发生率变得越来越高。目前癌症的治疗手段依然是以手术疗法、放射疗法和化学疗法为主。手术疗法和放射疗法属于局部治疗，带有一定的局限性。化学疗法可以通过药物的释放，对全身进行治疗，同时还可以对潜在的癌细胞转移和复发以及中晚期癌细胞有较好的疗效。但目前临床用于癌症治疗的大多数化疗药物显示出低的水溶性、有限的稳定性、快速的血液清除和缺乏选择性等问题，进入机体后不仅分布于肿瘤组织也分布在正常组织，在杀伤癌细胞的同时也损伤了人体正常组织细胞，从而导致疗效低、毒副作用强。
针对化疗存在的问题，学者也纷纷提出通过降低全身化疗药物浓度的同时提高癌细胞部位药物浓度并延长药物作用时间来达到肿瘤更好更长时间的治疗效果。近年来，随着纳米技术的兴起和各种生物相容性高分子材料的大量涌现，高分子材料的纳米级药物控释系统受到了人们的广泛关注。静电纺丝法制备载药纤维构建的给药系统因其包封率高、稳定性好、控释给药以及可实现局部给药的特点有望解决这一世界难题，已成为当前癌细胞治疗领域研究的热点。
然而，目前通过静电纺丝技术制备出具有复合性能的载药纤维膜，多是作为外敷的医用材料，药效低、利用率低，大大影响了其广阔的研究价值和使用价值。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维及其制备方法和应用。所述载抗癌药物的纳米纤维膜为直径在纳米级、长度在微米级的短纤维，可注射，提高了药物的利用率，能够更精准、有效、安全地对肿瘤部位进行治疗。
本发明所采用的技术方案为：
一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照质量比1:2～2:1分别称取DOX和MWNTs，超声条件下进行充分均匀混合，之后调节pH为9.5～10，搅拌条件下进行充分反应，得到反应产物经洗涤、离心、干燥，得到负载DOX的MWNTs粉体；
(2)取PLGA并加入到THF/DMF混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.2～0.3g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将步骤(1)所述负载DOX的MWNTs粉体加入到步骤(2)所述纺丝液中，所述负载DOX的MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为4:1～6:1mg/mL，搅拌条件下进行充分分散，之后进行静电纺丝，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；
(4)将步骤(3)所述的DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入分散剂并浸泡10～20min，之后进行均质处理，得到均质液依次进行洗涤、离心、干燥，得到所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维。
步骤(1)中，所述MWNTs采用如下方法制备得到：以LaNiO3为催化剂，导入甲烷在660～700℃催化裂解100～140min，再调温至600～1000℃继续裂解15～25min，得到MWNTs。
步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24～48h；
采用pH为9.5～10的碱液(由稀盐酸和稀氢氧化钠调配制得)进行所述洗涤2～5次；
进行所述离心的转速为8000～8500rpm，进行所述离心的时间为20～30min；
所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-75℃，所述冷冻干燥的时间为48～72h。
步骤(2)中，所述混合溶剂中THF与DMF的体积比为2:1～3:1。
步骤(3)中，所述静电纺丝的条件为：纺丝温度20～30℃，湿度为40～50％，施加电压为15～20kV，接收距离为10～20cm，纺丝推进速度为0.4～0.8ml/h。
步骤(4)中，所述分散剂为质量分数为0.5～1wt％的聚乙烯醇溶液。
步骤(4)中，进行所述均质处理的转速为15000～16000rpm，进行所述均质处理的时间为30～60min。
步骤(4)中，采用蒸馏水进行所述洗涤以去除分散剂，所述洗涤的次数为3～5次；
进行所述离心处理的转速为8000～8500rpm，进行所述离心处理的时间为20～30min；
所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-75℃，所述冷冻干燥的时间为48～72h。
所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径为400～700nm，长度为20～50m，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维中DOX的质量百分含量为0.5～2.5％。
所述方法制备得到可注射纳米短纤维在制备抗癌药物中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，通过先在中空结构的MWNTs上负载抗癌药物DOX，即为负载DOX的MWNTs粉体；之后再将负载DOX的MWNTs粉体与可生物降解的高分子PLGA在特定条件下进行静电纺丝，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；最后将DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎、均质处理后，制得的所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维具有良好的缓释性能，从而能够更好、更长时间发挥癌细胞治疗功效；可注射，药物利用率高，稳定性高，能够更精准、有效、安全地对肿瘤部位进行治疗；具有良好的生物相容性，具体表现为良好的血液相容性和细胞相容性，杀伤癌细胞的同时对人体正常组织细胞基本不造成损伤；此外，本发明所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维能够自发两种荧光，从而注射到人体被细胞吞噬后，通过对所述纳米短纤维进行实时检测，有利于实现对癌细胞治疗机理进行研究；本发明所述可注射纳米短纤维的制备方法简单，易于操作，应用前景广阔。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1所得载抗癌药物的可注射纳米短纤维的SEM图；
图2是本发明实施例1所得载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径分布统计图；
图3是对比例2所得DOX/PLGA和实施例1所得DOX/MWNTs/PLGA短纤维在醋酸盐缓冲液中的药物缓释对比图；
图4A为DOX(10g/mL)、MWNTs(1％)/PLGA、DOX(1％)/PLGA、DOX/MWNTs(1％)/PLGA短纤维(短纤维浓度1mg/mL)及TCPs分别与A549细胞(人肺癌细胞)共培养得到的细胞存活率图；
图4B为DOX(20g/mL)、MWNTs(2％)/PLGA、DOX(2％)/PLGA、DOX/MWNTs(2％)/PLGA短纤维(短纤维浓度0.5mg/mL)及TCPs分别与A549细胞共培养得到的细胞存活率图；
图4C为不同时间(24h、48h、72h)下，A549细胞分别在的DOX(10g/mL)、MWNTs(2％)/PLGA、DOX(2％)/PLGA、DOX/MWNTs(2％)/PLGA短纤维(短纤维浓度0.5mg/mL)以及对照组TCPs下共培养得到的细胞存活率图；
图4D为不同时间(24h、48h、72h)下，L929细胞分别在DOX(10 g/mL)、MWNTs(2％)/PLGA、DOX(2％)/PLGA、DOX/MWNTs(2％)/PLGA短纤维(短纤维浓度0.5mg/mL)以及对照组TCPs下共培养得到的细胞存活率图；
(备注：图4A-4D中，在不同浓度、不同组分、不同时间下，每组都会测试5种不同的材料，从左到右依次为TCPs、MWNTs/PLGA、DOX、DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA，其中TCPs为对照组)
图5A为A549细胞分别与TCPs、DOX、MWNTs/PLGA、DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA共培养24h后的荧光显微镜图；
图5B为L929细胞分别与TCPs、DOX、MWNTs/PLGA、DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA共培养24h后的荧光显微镜图；
图6A为H2O、PBS及不同浓度梯度的复合纳米短纤维(2、4、6mg/mL)MWNTs/PLGA和DOX/MWNTs/PLGA与血红细胞共培养后在450-700nm范围内的紫外吸收图；
图6B为PBS及不同浓度梯度的复合纳米短纤维(2、4、6mg/mL)MWNTs/PLGA和DOX/MWNTs/PLGA与血红细胞共培养后在500-600nm范围内紫外吸收的放大图；
图7为人全血分别与TCPs、MWNTs/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA共培养5min、10min、20min、40min、60min后，动态凝血实验研究540nm处的紫外吸收图；
图8为在Alexa Fluor 488、Redmond Red及DAPI通道下，观察A549肺癌细胞进行细胞吞噬的共聚焦显微镜图；
图9为在Alexa Fluor 488、Redmond Red及DAPI通道下，观察可注射复合纳米短纤维自发两种荧光的共聚焦显微镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照质量比1:1分别称取DOX和MWNTs，超声条件下进行充分均匀混合，之后调节pH为9.5，搅拌条件下进行充分反应24h，得到反应产物先采用pH为9.5的氢氧化钠水溶液洗涤4次，再在转速为8500rpm条件下进行离心30min，最后在-80℃进行冷冻干燥72h，得到负载DOX的MWNTs粉体；经检测，所述负载DOX的MWNTs粉体的载药量为99.6wt％，封装率为49.9wt％；
其中，所述MWNTs采用如下方法制备得到：以LaNiO3为催化剂，分散到瓷舟中，将瓷舟置于石英管中，并位于管式炉恒温区内，抽真空，通入氢气，压力为常压，在氢气流中缓慢升温还原，至600℃稳定30min后，迅速调到680℃，导入甲烷催化裂解120min，再调温至800℃继续裂解20min，反应到设定时间后，逐渐冷却至室温，收集并称量，得到MWNTs粗品。MWNTs粗品经盐酸浸泡48h，并采用超声波震荡分离，彻底溶解去除催化剂颗粒，再经蒸馏水多次洗涤至pH等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到所述MWNTs。
(2)取PLGA并加入到THF(四氢呋喃)与DMF(N-N-二甲基甲酰胺)按照体积比3:1配成的混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.25g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将步骤(1)所述负载DOX的MWNTs粉体(20.04mg)加入到步骤(2)所述纺丝液(4ml)中，所述负载DOX的MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为5:1mg/mL，搅拌条件下进行充分分散，之后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，真空干燥48h后，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；所述静电纺丝的条件为：纺丝温度25℃，湿度为45％，施加电压为15kV，接收距离为15cm，纺丝推进速度为0.6ml/h；
(4)将步骤(3)所述的DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入质量分数为0.5wt％的聚乙烯醇溶液作为分散剂，浸泡10min，之后利用均质机在转速为16000rpm条件下进行均质处理40min，得到均质液先采用蒸馏水进行洗涤3次以除去分散剂聚乙烯醇，再在转速为8500rpm离心机中进行离心20min，最后在-80℃温度下进行冷冻干燥72h，得到所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维；经检测，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径为485±136nm、长度为24.8±16.1μm，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维中DOX的质量百分含量为0.980％，MWNTs的质量百分含量为0.984％。
实施例2
本实施例提供一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照质量比1:2分别称取DOX和MWNTs，超声条件下进行充分均匀混合，之后调节pH为10，搅拌条件下进行充分反应48h，得到反应产物先采用pH为10的氢氧化钠水溶液洗涤3次，再在转速为8000rpm条件下进行离心25min，最后在-75℃进行冷冻干燥48h，得到负载DOX的MWNTs粉体；经检测，所述负载DOX的MWNTs粉体的载药量为95.4wt％，封装率为48.2wt％；
其中，所述MWNTs采用如下方法制备得到：以LaNiO3为催化剂，分散到瓷舟中，将瓷舟置于石英管中，并位于管式炉恒温区内，抽真空，通入氢气，压力为常压，在氢气流中缓慢升温还原，至600℃稳定30min后，迅速调到660℃，导入甲烷催化裂解100min，再调温至600℃继续裂解25min，反应到设定时间后，逐渐冷却至室温，收集并称量，得到MWNTs粗品。MWNTs粗品经盐酸浸泡48h，并采用超声波震荡分离，彻底溶解去除催化剂颗粒，再经反复蒸馏水洗涤至pH等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到提纯的所述MWNTs。
(2)取PLGA并加入到THF与DMF按照体积比2:1配成的混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.2g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将步骤(1)所述负载DOX的MWNTs粉体(30.4mg)加入到步骤(2)所述纺丝液(4ml)中，所述负载DOX的MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为4:1mg/ml，搅拌条件下进行充分分散，之后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，真空干燥24h后，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；所述静电纺丝的条件为：纺丝温度20℃，湿度为40％，施加电压为15kV，接收距离为10cm，纺丝推进速度为0.4ml/h；
(4)将步骤(3)所述的DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入质量分数为1wt％的聚乙烯醇溶液作为分散剂，浸泡20min，之后利用均质机在转速为15000rpm条件下进行均质处理30min，得到均质液先采用蒸馏水进行洗涤5次，以去除分散剂聚乙烯醇，再在转速为8000rpm离心机中进行离心30min，最后在-75℃温度下进行冷冻干燥48h，得到所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维；经检测，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径为404±127nm、长度为22.2±15.6μm，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维中DOX的质量百分含量为0.971％，MWNTs的质量百分含量为1.941％。
实施例3
本实施例提供一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照质量比2:1分别称取DOX和MWNTs，超声条件下进行充分均匀混合，之后调节pH为9.5，搅拌条件下进行充分反应36h，得到反应产物先采用pH为9.5的NaOH水溶液(由1mol/mL的HCL和NaOH调配后制得)洗涤5次，再在转速为8500rpm条件下进行离心20min，最后在-80℃进行冷冻干燥72h，得到负载DOX的MWNTs粉体；经检测，所述负载DOX的MWNTs粉体的载药量为96.1wt％，封装率为48.9wt％；
其中，所述MWNTs采用如下方法制备得到：以LaNiO3为催化剂，分散到瓷舟中，将瓷舟置于石英管中，并位于管式炉恒温区内，抽真空，通入氢气，压力为常压，在氢气流中缓慢升温还原，至600℃稳定30min后，迅速调到700℃，导入甲烷催化裂解140min，再调温至1000℃继续裂解15min，反应到设定时间后，逐渐冷却至室温，收集并称量，得到MWNTs粗品。MWNTs粗品经盐酸浸泡48h，并采用超声波震荡分离，彻底溶解去除催化剂颗粒，再经反复蒸馏水洗涤至pH等于7，采用甲苯萃取，自然干燥，得到提纯的MWNTs。
(2)取PLGA并加入到THF与DMF按照体积比3:1配成的混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.3g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将步骤(1)所述负载DOX的MWNTs粉体(15.4mg)加入到步骤(2)所述纺丝液(4ml)中，所述负载DOX的MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为6:1mg/ml，搅拌条件下进行充分分散，之后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，真空干燥24h后，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；所述静电纺丝的条件为：纺丝温度30℃，湿度为50％，施加电压为20kV，接收距离为20cm，纺丝推进速度为0.8ml/h；
(4)将步骤(3)所述的DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入质量分数为0.5wt％的聚乙烯醇溶液作为分散剂，浸泡10min，之后利用均质机在转速为16000rpm条件下进行均质处理60min，得到均质液先采用蒸馏水进行洗涤4次，以除去分散剂聚乙烯醇，再在转速为8500rpm离心机中进行离心25min，最后在-80℃温度下进行冷冻干燥72h，得到所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维；经检测，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径为610±158nm、长度为23.4±17.2μm，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维中DOX的质量百分含量为0.985％，MWNTs的质量百分含量为0.493％。
对比例1
本对比例提供一种纳米短纤维MWNTs/PLGA的制备方法，包括如下步骤：
(1)取PLGA并加入到THF(四氢呋喃)与DMF(N-N-二甲基甲酰胺)按照体积比3:1配成的混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.25g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将MWNTs粉体(20.04mg)加入到步骤(2)所述纺丝液(4ml)中，MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为5:1mg/mL，搅拌条件下进行充分分散，之后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，真空干燥48h后，得到MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；所述静电纺丝的条件为：纺丝温度25℃，湿度为45％，施加电压为15kV，接收距离为15cm，纺丝推进速度为0.6ml/h；
(4)将步骤(3)所述的MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入质量分数为0.5wt％的聚乙烯醇溶液作为分散剂，浸泡10min，之后利用均质机在转速为16000rpm条件下进行均质处理40min，得到均质液先采用蒸馏水进行洗涤3次，再在转速为8500rpm离心机中进行离心20min，最后在-80℃温度下进行冷冻干燥72h，得到纳米短纤维MWNTs/PLGA。
对比例2
本对比例提供一种DOX/PLGA的制备方法，包括如下步骤：
(1)取PLGA并加入到THF(四氢呋喃)与DMF(N-N-二甲基甲酰胺)按照体积比3:1配成的混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.25g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将DOX加入到步骤(2)所述纺丝液中，DOX与所述纺丝液的体积之比为5:1g/ml，搅拌条件下进行充分分散，之后利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，真空干燥48h后，得到DOX/PLGA复合纳米纤维膜；所述静电纺丝的条件为：纺丝温度25℃，湿度为45％，施加电压为15kV，接收距离为15cm，纺丝推进速度为0.6ml/h；
(4)将步骤(3)所述的DOX/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入质量分数为0.5wt％的聚乙烯醇溶液作为分散剂，浸泡10min，之后利用均质机在转速为16000rpm条件下进行均质处理40min，得到均质液先采用蒸馏水进行洗涤3次，再在转速为8500rpm离心机中进行离心20min，最后在-80℃温度下进行冷冻干燥72h，得到纳米短纤维DOX/PLGA。
实验例
1、缓释效果测试
将实施例1制得的可注射纳米短纤维DOX/MWNTs/PLGA和对比例2制得的纳米短纤维DOX/PLGA分别作为待测样品进行缓释效果测试，检测方法具体如下：
取待测样品30mg，置于截流分子量为3500透析袋中，取10mM醋酸盐缓冲液(pH＝5.4)2mL分散短纤维，另取13mL醋酸盐缓冲液分散在透析袋外部。缓释外部条件为37℃的摇床中，摇床转速为150rpm。前期要间隔时间短些，后期间隔长些。每次取出2mL，然后再加入2mL醋酸盐缓冲液。检测用紫外分光光度计，测在481nm波长处特征吸收峰出的吸收值，根据标准曲线算出DOX浓度。计算出DOX累计释放量，比较分析两者的药物缓释情况，测试结果如图3所示，可以看出DOX/MWNTs/PLGA复合纳米短纤维相较于DOX/PLGA具备更好的缓释效果，40天内释放量低于50％。
2、细胞毒性评价
细胞毒性研究中，癌细胞采用A549肺癌细胞，正常细胞采用L929小鼠成纤维细胞，对复合纳米短纤维进行细胞毒性评价。步骤包括：
(1)先种板培养。处于生长旺盛期的细胞在25mL细胞瓶中培养2～3天，倒出培养液，用PBS洗涤3次，加胰蛋白酶1mL消化5min，取出置于15mL离心管中，离心5min，加入1mL新鲜培养液，取出40L均匀的细胞悬浮液于2mL离心管中，再加入360 L生理盐水，通过细胞计数器计算细胞总数。配置细胞悬浮液浓度为5万/mL，往96孔板每孔加入200L，保障每个孔板加1万细胞，在37℃的5％二氧化碳培养箱中培养12h。
(2)加材料培养。取出培养12h的细胞，倒出细胞培养液，往里分别加入复合纳米短纤维MWNTs/PLGA、DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA(本发明实施例1所得)及DOX四个材料进行培养。
(3)一部分进行CCK-8测细胞存活率，另一部分细胞染色，荧光显微镜下观察活细胞分布。取出加材料培养24h、48h、72h后的细胞，倒出细胞培养液，生理盐水洗涤，加CCK-8共培养2小时，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，结果如图4A-图4D所示，在不同浓度、不同组分、不同时间下，每组都会测试5种不同的材料，从左到右每组材料依次为TCPs、MWNTs/PLGA、DOX、DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA，其中TCPs为对照组；另一部分也用生理盐水洗涤干净，加4％多聚甲醛浸泡20～30min，生理盐水洗涤3～5次。DAPI避光下浸泡5min，生理盐水洗涤3～5次。然后在倒置荧光显微镜下，观察细胞的形貌，结果如图5A和图5B所示。
可以得出：短纤维DOX/MWNTs/PLGA比DOX/PLGA有更好的更长间的癌细胞治疗效果，同时复合纳米短纤维DOX/MWNTs/PLGA表现出可以杀死癌细胞细胞，而对正常细胞影响较小。同时也辅证了本发明所述DOX/MWNTs/PLGA有更好的药物缓释效果。
3、血液相容性评价
血液相容性研究中，设计了可注射复合纳米短纤维的溶血实验和动态凝血实验。
取肝素锂稳定的健康成年人全血，加入到15mL离心管中，离心3min，转速为3000r/min，每次加入14mLPBS进行洗涤(大概5次)，直到上清液呈无色，弃去上清液得红细胞HRBCs。取0.2mL红细胞溶于0.8mL的去离子水中，作为阳性对照。再取0.2mL的红细胞溶于0.8mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中，作为阴性对照。接下来取0.2mL的红细胞分别加入到含不同浓度MWNTs/PLGA和DOX/MWNTs/PLGA复合纳米短纤维的磷酸盐缓冲液中，配置成不同的浓度梯度，两种材料的质体比分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL。在37℃恒温箱中共培养2个小时，用酒精棉球擦拭过的无菌镊子，夹出短纤维材料，然后在离心机上10000rpm，离心1min，取出后离心管，按照H2O、PBS、MWNTs/PLGA(2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)和DOX/MWNTs/PLGA(2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)依次排列进行拍照观察。然后再取离心后的上清液，在紫外分光光度计波长为450nm-700nm范围内测吸光度，溶血率均低于5％，表现出良好的血液相容性，如图6A和图6B所示，其中，“1”代表MWNTs/PLGA(2mg/mL)，“2”代表MWNTs/PLGA(4mg/mL)，“3”代表MWNTs/PLGA(6mg/mL)，“4”代表DOX/MWNTs/PLGA(2mg/mL)，“5”代表DOX/MWNTs/PLGA(4mg/mL)，“6”代表DOX/MWNTs/PLGA(6mg/mL)。
动态凝血实验中，直接取肝素锂稳定的健康成人全血，加入到12孔板中，每个孔20L，再将每孔加入0.2mol/L的CaCl2溶液10 L，取复合纳米短纤维DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA，在对应的培养时间的孔中各加入1mg，与12孔板中的溶液充分接触，设置一组为不加材料的对照组实验。将加好材料的孔板加入到37℃的恒温箱中，开始计时，5分钟后，向DOX/PLGA、DOX/MWNTs/PLGA对应的反应5分钟的两个孔中各加入5mL去离子水，滴加过程中，采用从边缘滴加慢慢向中间渗透的方法加入到孔板中。然后放回37℃的恒温箱中，5分钟中后取出2mL待测吸光度。同样的方法，10min、20min、40min、60min到培养的时间之后，加入5mL去离子水，放回37℃的恒温箱中，5分钟中后取出2mL待测吸光度。用UV-Vis测试上清液的血红蛋白在540nm处的吸光值，每组设计三个平行实验，进行比较分析，凝血效果和对照组相差不大，表现出良好的血液相容性，如图7所示。
4、细胞吞噬实验
进一步为了研究复合纳米短纤维对癌细胞治疗的机理，设计了细胞吞噬实验。具体操作为：共聚焦显微镜制样，包括12孔板中加玻片，酒精消毒、生理盐水冲洗以及在DMEM培养基中浸泡12h；癌细胞A549种板，8万/孔，培养12h；复合纳米短纤维DOX/MWNTs/PLGA浓度为0.5mg/mL，共培养24h。接下来生理盐水洗涤3～5次，进行活细胞染色。包括4％多聚甲醛浸泡20～30min，生理盐水洗涤3～5次；0.1％TritonX-100浸泡10min，生理盐水洗涤3～5次；1％BSA浸泡30min，生理盐水洗涤3～5次；鬼笔环肽(10 LL400 LSaline)浸泡30min，生理盐水洗涤3～5次；DAPI避光下浸泡5min，生理盐水洗涤3～5次。
设置一对照组，在加有玻片的孔板中加入复合纳米短纤维DOX/MWNTs/PLGA，密度为0.5mg/mL，加入500 L/孔，共培养36h。
取出玻片在共聚焦显微镜下，选择Alexa Fluor 488、Redmond Red及DAPI通道进行观察分析。对照组选择Alexa Fluor 488、Redmond Red通道进行观察分析。如图8和图9所示，可以看出，自发两种荧光的短纤维(本发明所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维)可以被癌细胞吞噬，进行癌细胞治疗。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照质量比1:2～2:1分别称取DOX和MWNTs，超声条件下进行充分均匀混合，之后调节pH为9.5～10，搅拌条件下进行充分反应，得到反应产物经洗涤、离心、干燥，得到负载DOX的MWNTs粉体；
(2)取PLGA并加入到THF/DMF混合溶剂中，所述PLGA的添加质量与所述混合溶剂的体积之比为0.2～0.3g/ml，搅拌使PLGA充分溶解，得到纺丝液；
(3)将步骤(1)所述负载DOX的MWNTs粉体加入到步骤(2)所述纺丝液中，所述负载DOX的MWNTs粉体的质量与所述纺丝液的体积之比为4:1～6:1mg/mL，搅拌条件下进行充分分散，之后进行静电纺丝，得到DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜；
(4)将步骤(3)所述的DOX/MWNTs/PLGA复合纳米纤维膜进行破碎处理，得到碎片，向所述碎片中加入分散剂并浸泡10～20min，之后进行均质处理，得到均质液依次进行洗涤、离心、干燥，得到所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维；
所述分散剂为质量分数为0.5～1wt％的聚乙烯醇溶液；进行所述均质处理的转速为15000～16000rpm，进行所述均质处理的时间为30～60min；采用蒸馏水进行所述洗涤，所述洗涤的次数为3～5次；进行所述离心处理的转速为8000～8500rpm，进行所述离心处理的时间为20～30min；所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-75℃，所述冷冻干燥的时间为48～72h；
所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维的直径为400～700nm长度为20～50μm，所述载抗癌药物的可注射纳米短纤维中DOX的质量百分含量为0.5～2％。
2.根据权利要求1所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述MWNTs采用如下方法制备得到：以LaNiO3为催化剂，导入甲烷在660～700℃催化裂解100～140min，再调温至600～1000℃继续裂解15～25min，得到MWNTs。
3.根据权利要求1所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述搅拌反应的时间为24～48h；
采用pH为9.5～10的碱液进行所述洗涤2～5次；
进行所述离心的转速为8000～8500rpm，进行所述离心的时间为20～30min；
所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-80℃～-75℃，所述冷冻干燥的时间为48～72h。
4.根据权利要求1所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合溶剂中THF与DMF的体积比为2:1～3:1。
5.根据权利要求1所述的载抗癌药物的可注射纳米短纤维的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述静电纺丝的条件为：纺丝温度20～30℃，湿度为40～50％，施加电压为15～20kV，接收距离为10～20cm，纺丝推进速度为0.4～0.8ml/h。
6.权利要求1-5任一项所述方法制备得到可注射纳米短纤维在制备抗癌药物中的应用。
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