CN113133988B - 一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用。本申请以聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料，醋酸泼尼松龙(PA)为模型药物，利用表面包覆红细胞膜的策略，构建具有肾靶向性的新型仿生纳米载药系统(RBC‑PA‑NPs)。该载药系统结合红细胞膜的生物相容性和纳米粒的靶向性，以期提高PA的肾靶向性，使肾小球肾炎得到更有效的治疗。对此，本申请从载药系统的制备工艺、理化性质、细胞毒性和摄取、体内靶向性等方面进行评价。

Description

一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用。

背景技术

肾小球肾炎(Glomerulonephritis,GN)是一种国内外常见的免疫介导的肾脏疾病，可表现为肾小球内炎症反应和细胞增殖，是导致终末期肾病的主要病因。一般可分为原发性肾脏疾病和系统性疾病的继发肾炎。尽管目前在GN的发病机制、临床表现、诊断和治疗等方面均已取得进展，但对大部分原发性GN的治疗效果尚不明显。鉴于该疾病存在潜在的免疫学机制，临床上主要采用激素和免疫抑制剂进行治疗。由于治疗方案缺乏特异性，大剂量使用激素和免疫抑制剂将带来严重的毒副作用，极大地限制了GN的治疗。因此，研究开发肾靶向给药系统，在降低药物毒副作用的同时，提高GN的治疗效果，是近年来建立个性化治疗策略的主要目标。

纳米载药系统一直是生物医药领域的研究热点。其中，纳米粒(Nanoparticles,NPs)是近年来发展较快的新型药物载体，具有稳定性好、药物泄漏慢、缓控释性等优点。由于NPs粒径可控、表面功能稳定，为靶向炎症微环境提供了可能，弥补了传统抗炎药物的局限性，为靶向治疗提供了一个理想的平台。然而，NPs免疫原性高，生物相容性低，进入血液后会被机体单核吞噬细胞系统识别而快速清除，无法按照设计预期到达病灶部位，因而难以充分发挥疗效。如何降低NPs免疫原性，提高其生物相容性，使其避开单核吞噬细胞系统的吞噬成为研究的关键。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本申请以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料，醋酸泼尼松龙(PA)为模型药物，利用表面包覆红细胞膜的策略，构建具有肾靶向性的新型仿生纳米载药系统(RBC-PA-NPs)。该载药系统结合红细胞膜的生物相容性和纳米粒的靶向性，以期提高PA的肾靶向性，使肾小球肾炎得到更有效的治疗。对此，本申请从载体系统的制备工艺、理化性质、细胞毒性和摄取、体内靶向性等方面进行评价。

本发明是这样实现的，一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体材料包载肾炎治疗药物，制备纳米粒，再用红细胞膜包裹所述纳米粒，得到红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统。

本发明还提供了一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统的制备方法，包括：将肾炎治疗药物与载体材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合后，溶解于有机溶剂得到有机相；将表面活性剂溶解于水中得到水相；将有机相迅速加入水相中，超声处理；挥发除去有机溶剂得到纳米粒；将纳米粒与红细胞膜混合，得到红细胞膜包裹的纳米载药系统。

进一步地，所述有机溶剂为丙酮。

进一步地，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆188和吐温80中的任一种。

进一步地，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物为50/50PLGA(1.5-3W)75/25PLGA(1.5-2.3W)、75/25PLGA(2.3-3.7W)中的任一种。

进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物为75/25PLGA(1.5-2.3W)，外消旋乳酸-乙醇酸比例为75/25，分子量为1.5-2.3W。

进一步地，纳米粒与红细胞膜体积比1:1，所述红细胞膜膜蛋白浓度为0-30mg/mL。

进一步地，所述红细胞膜膜蛋白浓度为15mg/mL。

进一步地，红细胞膜通过超声波细胞破碎仪冰浴超声制备。

进一步地，采用超声处理使红细胞膜包裹纳米粒。

进一步地，所述肾靶向药物包括糖皮质激素和免疫抑制剂中的至少一种。

进一步地，所述糖皮质激素包括醋酸泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、氢化可的松、地塞米松中的至少一种；所述免疫抑制剂包括环磷酰胺、霉酚酸酯、他克莫司、环孢素A、中药雷公藤多甙中的至少一种。

本发明还提供了上述的一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统、制备方法在制备肾靶向纳米药物制剂中的应用。

红细胞(Red blood cells,RBC)是机体血液中数量最多的循环细胞，具有极好的生物相容性、无免疫原性和可完全降解等优点。将天然红细胞膜(Red blood cellmembranes,RBCm)作为外壳修饰合成的NPs内核，可形成具有核壳结构的纳米载药系统。通过这一策略，RBCm的结构与功能，尤其是RBCm表面的特异性功能蛋白得以保留。而合成的NPs作为核心，不但可以起到支撑作用，还可以负载药物或进行结构修饰。由于其结合了两者的优势，在纳米医学和药学领域表现出极大的发展潜力和应用前景。RBCm仿生修饰虽然具备诸多优点，但RBCm本身由于静脉注射后分布至全身，对病灶不具备靶向性。由此，我们根据肾小球的结构特征，调整NPs的粒径，来达到被动靶向的目的。

肾小球位于肾小体内，是肾皮质内肾单位的起始端，由一簇毛细血管和支持组织(系膜)组成。肾小球中，肾小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)是一层300nm厚的结缔组织膜，富含硫酸肝素(孔径为3nm)，能通过大小和电荷过滤小分子。在GBM的后面是足细胞，它们形成32nm宽的滤过缝隙，以滤过某些小分子蛋白。整体来看，肾小球内皮细胞、GBM和足细胞构成肾小球滤过器，滤过器的有效截留粒径为10nm，有利于小于该粒径的小分子在肾脏中的快速清除。肾小球内，没有GBM和足细胞的阻隔作用，肾小球系膜(系膜细胞和细胞外基质)直接连接到有孔的内皮。肾小球血管内皮小孔直径为80-150nm。由于这种特殊的肾结构，NPs可以穿过有孔的内皮后一定程度地积聚在肾小球系膜中，且95nm左右的NPs更易于在肾小球系膜聚集。所以NPs的粒径大小是实现靶向递药的关键。

本申请选择醋酸泼尼松龙(Prednisolone acetate，PA)为模型药物，首先制备载PA的PLGA纳米粒(PA-NPs)，再用RBCm仿生修饰，构建一种生物相容性好的新型仿生纳米载药系统(RBC-PA-NPs)，通过控制粒径以获得GN靶向性。选用大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)和小鼠单核吞噬细胞(RAW 264.7)来检测其对RBC-PA-NPs的摄取，验证其靶向肾小球系膜和逃避单核吞噬细胞系统吞噬的能力。并通过静脉注射后体内活体成像，观察RBC-Cy5-NPs在SD大鼠体内的组织分布，验证其肾靶向性。RBCm仿生修饰的新型纳米载药系统有望通过被动靶向和免疫逃逸将治疗药物PA精确地输送到肾脏，从而达到更有效和更安全的治疗GN的目的。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1.筛选了影响PA-NPs性状和稳定性最明显因素，得到最优处方，成功制备了PA-NPs。EE为94.73±5.28％，DL为1.80±0.02％，粒径为87.25±0.20nm，电位为-45.67±2.69mV，PDI为0.115±0.014。

2.采用水浴超声法成功制备RBC-PA-NPs，并考察了一系列理化性质。结果表明RBC-PA-NPs的粒径、电位和PDI分别为104.20±0.35nm、-15.07±2.13mV、0.222±0.004。由于PLGA外层多一层RBCm，因此粒径增大了约17nm。TEM观察到RBC-PA-NPs具有经典的“核壳”结构。当RBCm浓度为15mg/mL时，细胞膜能完全覆盖NPs。该仿生系统可在室温下稳定保存3.5h。

4.采用CCK-8法，选取浓度范围为6.25–200.00ng/mL的PA、NPs、PA-NPs、RBC-PA-NPs与HBZY-1细胞共同孵育24h后检测其各组细胞活力。结果表明，各组药物在给药浓度范围内没有明显毒性，细胞存活率均大于85％。通过激光共聚焦显微镜检测细胞对各组药物的摄取情况。结果表明，相比Cy5溶液组和Cy5-NPs组，HBZY-1细胞对RBC-Cy5-NPs摄取效率显著增强，同时RAW 264.7细胞对RBC-Cy5-NPs几乎无摄取。

5.选取SD大鼠为模型动物，等剂量注射Cy5、Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs，研究不同时间Cy5在体内的分布情况。结果表明，RBC-Cy5-NPs的粒径大小最适宜分布至肾小球系膜，同时由于RBCm的仿生修饰作用，使RBC-Cy5-NPs具有免疫逃逸能力，从而具有显著的肾靶向作用。

附图说明

图1是RBCm仿生修饰前后粒径电位对比数据图；

图2是透射电镜图；

图3是PA-NPs和RBC-PA-NPs的稳定性数据图；

图4是PA、NPs、PA-NPs、RBC-PA-NPs对HBZY-1细胞的毒性实验数据图；

图5是Cy5、Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs孵育HBZY-1细胞1h后的摄取结果图；

图6是Cy5、Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs孵育RAW264.7细胞1h后的摄取结果图；

图7是大鼠肾脏Cy5荧光信号的平均强度数据图，**p<0.01vs.Cy5，^##p<0.01vs.Cy5-NPs。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统、制备方法及应用，本发明中涉及的实验细胞株：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院，储存于本实验室；大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1，购自上海赛百慷生物技术股份有限公司；在37℃、5％CO₂环境下，采用含10％胎牛血清和1％(v/v)青霉素链霉素的DMEM高糖培养基常规培养。具体实验内容如下实施例所示。

实施例1制备工艺的优化

本申请本实施例中采用纳米沉淀法制备PA-NPs，基本方法如下：称取醋酸泼尼松龙(PA)及载体材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)于10mL EP管中，加入有机溶剂，超声使其完全溶解，作为有机相。称取表面活性剂于烧杯中，加入超纯水，搅拌使其完全溶解，作为水相。将有机相迅速加入水相，通过功率为60W的超声波细胞破碎机，超声处理。在室温下低速搅拌，挥发除去有机溶剂，得到包载PA的PLGA纳米粒。

有机溶剂：实验在保持制备工艺及其他成分不变的前提下，通过选择不同的有机溶剂作为有机相制备纳米粒，来考察对PA-NPs外观性状和稳定性的影响。结果见表1。

表1有机溶剂种类对PA-NPs的影响

由上表结果可知，不同有机溶剂对包载PA的纳米粒产生的影响不同，其中以丙酮作为溶剂，可以制备出理想的纳米粒，且较稳定。因此，选用丙酮作为有机相。

表面活性剂：实验在保持制备工艺及其他成分不变的前提下，通过选择不同的表面活性剂，来考察对PA-NPs外观性状和稳定性的影响。结果见表2。

表2表面活性剂种类对PA-NPs的影响

由上表结果可知，不同表面活性剂对包载PA的纳米粒产生的影响不同，其中以十二烷基硫酸钠作为表面活性剂，可以制备出理想的纳米粒，且较稳定。因此，选用十二烷基硫酸钠作为表面活性剂。

PLGA种类：实验在保持制备工艺及其他成分不变的前提下，通过选择不同分子量和乳酸-乙醇酸比例的PLGA制备纳米粒，来考察对PA-NPs外观性状和稳定性的影响。结果见表3。

表3 PLGA种类对纳米粒的影响

由以上结果可知，不同分子量和乳酸-乙醇酸比例的PLGA对包载PA的纳米粒产生的效果不同，分子量过大制备的纳米粒易浑浊，分子量过小纳米粒不稳定。其中以75/25PLGA(1.5-2.3W)作为载体材料时，可以制备出理想的纳米粒，且较稳定。因此，选用75/25PLGA(1.5-2.3W)作为载体材料。

实施例2 RBC-PA-NPs的制备及应用

1、PA-NPs的制备

称取2.00mg的醋酸泼尼松龙(Prednisolone acetate，PA)，以及载体材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)12.00mg，共同溶解于5mL丙酮中，超声使其完全溶解。配制1％的十二烷基硫酸钠溶液，溶解于10mL水中。在超声功率为60W、超声时间为7min的条件下，将有机相迅速加入水相中，并在常温下搅拌至有机溶剂挥发完全后，用0.8μm的滤头过滤，得到PA-NPs。采用纳米粒度电位仪进行扫描测定粒径、Zeta电位、PDI，每个样品平行测定3次，采集温度为室温。

如图1，其中A.粒径变化；B.表面Zeta电位变化。测得粒径为87.25±0.20nm，电位为-45.67±2.69mV，PDI为0.115±0.01。

2、RBCm的提取和纯化

取SD大鼠，股动脉取得全血，收集到含肝素钠的离心管中。使用离心机2000g离心10min，弃掉上层血浆、白细胞和血小板，收集下层RBC。将得到的RBC用1×PBS缓冲溶液清洗3次(250g,10min)，加入到0.25×PBS溶液中进行溶血处理1h。再用离心机3500g离心30min，弃去上层血红蛋白。收集下层深红色细胞膜，用超纯水清洗3次(3500g,30min)。超声波细胞破碎仪冰浴超声(60W,5min)，即得RBCm。

纯化后的RBC经0.25×PBS低渗裂解后，通过粒度电位仪可测定裂解后的粒径为2768.43±224.98nm，电位为-14.51±1.07mV(图1)。RBCm经超声波细胞破碎仪冰浴超声5min后，测得粒径为319.90±7.29nm，电位为-15.30±0.70mV(图1)。

3、RBC-PA-NPs的制备

将1mL新制备的PA-NPs溶液与1mL RBCm囊泡混合，水浴超声3min(200W)，即得红色透明的RBC-PA-NPs溶液。

如图1，RBC-PA-NPs测得粒径为104.20±0.35nm。RBCm的厚度约为8nm左右。与包膜前相比，RBC-PA-NPs比PA-NPs粒径增加了17nm左右，与两层RBCm的厚度相当，证明RBCm刚好完全包裹在核心NPs表面。在RBCm仿生修饰后，RBC-PA-NPs的Zeta电位为-15.07±2.13mV，与RBCm的电位(-15.30±0.70mV)相当。这是因为包裹RBCm后，隔绝了PA-NPs的表面电位，所以检测出的电位与RBCm的电位基本一致。进一步证明，RBCm被成功包裹于PA-NPs表面。同时，RBC-PA-NPs在超纯水中分散性良好，PDI为0.222±0.004。

4、透射电镜分析

利用透射电子显微镜观察PA-NPs和RBC-PA-NPs的形态。如图2显示(A.PA-NPs；B.RBC-PA-NPs)，RBC-PA-NPs具有经典的“核-壳结构”，外层的白色圆环为RBCm，内层为球形的核心PA-NPs，且包膜后粒径相比于PA-NPs有所增大，其结果与粒度仪测定结果一致，进一步说明RBCm成功修饰在NPs表面。

5、稳定性试验

取新鲜制备的RBC-PA-NPs和PA-NPs溶液，放置于室温环境下，每隔一定时间，进行取样检测，根据其粒径和PDI变化，评价载药系统的稳定性。如图3，PA-NPs的粒径稳定在75-85nm左右，PDI稳定在0.07-0.12左右，表明PA-NPs能在30天内稳定储存。RBC-PA-NPs的粒径稳定在95-105nm左右，PDI稳定在0.2-0.3左右，说明RBC-PA-NPs在3.5h内比较稳定，且分布均匀。

6、细胞毒性实验

调整HBZY-1细胞悬液浓度为3×10⁴个/mL，按每孔加入100μL的单细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞贴壁且汇合度达80％左右，向96孔板中加入不同浓度的PA溶液、PA-NPs和RBC-PA-NPs，并设置空白组和不加药对照组，每组设置3个复孔。放入培养箱中继续孵育24h后，取出96孔板，向每孔加入10μL的CCK-8溶液。将培养板置于培养箱内孵育1h后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞存活率。

如图4所示，不同浓度的PA、NPs、PA-NPs和RBC-PA-NPs溶液，与HBZY-1细胞孵育24h后，在PA浓度为6.25–200.00ng/mL的范围内，细胞活性均大于85％，说明PA及纳米载体材料在此浓度范围内，对细胞均无损害且影响较小，具有较好的体外安全性。

7、细胞摄取实验

以荧光染料Cy5标记的纳米粒进行细胞摄取实验。Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs的制备按照PA-NPs和RBC-PA-NPs的制备方法进行，将药物PA替换为Cy5。

将HBZY-1和RAW264.7细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于铺有细胞爬片的6孔板中，并置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，向6孔板中加入不同浓度的Cy5溶液、Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs，继续培养1h。弃去细胞培养液，用PBS清洗3次，将Hochest33342染料加入6孔板中，使其浸没细胞，在室温下染色2min后，用PBS清洗3次。使用4％多聚甲醛固定细胞15min，将细胞爬片从6孔板中取出，置于载玻片上，并滴1滴抗荧光淬灭剂封片，使用激光共聚焦扫描显微镜观察摄取情况。

HBZY-1细胞是大鼠肾小球系膜细胞，以HBZY-1细胞为研究对象，模拟大鼠肾小球内环境。如图5所示，在HBZY-1细胞与Cy5溶液共培养1h后，HBZY-1细胞中几乎未观察到红色荧光，表明Cy5溶液组在HBZY-1细胞中无富集作用，Cy5溶液组没有肾靶向性。而给予Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs组1h后，红色荧光在HBZY-1细胞中能够被清楚地观察到，说明Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs组被摄取进入到了细胞内部。但Cy5-NPs在HBZY-1细胞中呈现较少红色荧光，说明Cy5-NPs对肾小球系膜细胞几乎无靶向作用。而RBC-Cy5-NPs组的红色荧光较为明显，表明经过RBCm仿生修饰后，RBC-Cy5-NPs在HBZY-1细胞中的摄取效率明显提高，RBCm的仿生修饰可以有效改善RBC-Cy5-NPs的细胞摄取能力，能够更多地在肾小球系膜细胞积累，从而达到靶向肾小球系膜细胞，在肾小球内富集的目的。

RAW264.7细胞是小鼠单核吞噬细胞，属于巨噬细胞系，并具有识别外来物质并将其吞噬清除作用。纳米载药系统进入机体后，极易被单核吞噬系统识别并吞噬，由此我们以RAW264.7细胞为研究对象，模拟体内单核吞噬细胞系统。如图6所示，给予Cy5组1h后，RAW264.7细胞中几乎无红色荧光，说明RAW264.7细胞几乎对Cy5溶液组几乎无摄取作用。而Cy5-NPs组被RAW264.7细胞摄取1h后，红色荧光出现在整个细胞内，且绝大部分Cy5-NPs已经进入细胞核中，这说明未经过RBCm仿生修饰的Cy5-NPs生物相容性差，免疫原性高，极易被单核吞噬细胞摄取并吞噬。而给予RBC-Cy5-NPs溶液1h后，红色荧光主要存在于细胞外且荧光强度明显降低，说明RBCm仿生修饰后赋予了Cy5-NPs免疫逃逸的能力，使纳米载药系统能够躲避单核吞噬细胞的吞噬，具有免疫逃逸的作用。

8、肾靶向性研究

取180-220g SD大鼠，随机分为4组，每组5只，给药前12h禁食不禁水。实验组分别尾静脉注射Cy5溶液、Cy5-NPs和RBC-Cy5-NPs，按Cy5给药剂量为0.2mg/kg，对照组注射等体积生理盐水。分别于给药后5min和30min处死大鼠，解剖摘取心、肝、脾、肺、肾、脑，组织表面用生理盐水洗净，并用滤纸吸干，用小动物活体成像仪观察荧光在SD大鼠体内的分布情况。

5min时，Cy5溶液组大部分器官均显示荧光分布，没有明显的选择性，无肾靶向性作用。与Cy5相比，Cy5-NPs组肝脏荧光强度增强，脾脏荧光强度减弱，而肾脏荧光强度无明显变化，表明Cy5-NPs无肾靶向性，反而倾向于分布到肝脏中。而与Cy5和Cy5-NPs相比，RBC-Cy5-NPs组肾脏荧光强度显著增强，脾脏荧光强度显著减弱，表明RBC-Cy5-NPs具有具有显著的肾靶向作用。30min后，各组药物在肝脏分布都显著减弱，而肾脏荧光强度进一步增强。其中，Cy5组除肾脏分布增多外，肺部荧光强度显著增强，表明随着时间的推移，Cy5倾向于分布到肺部。与Cy5相比，Cy5-NPs组肾脏分布逐渐累积，表明Cy5-NPs的粒径大小具有一定的肾靶向性。而RBC-Cy5-NPs组肾脏荧光强度最强，在大鼠肾脏部位大量富集，表明RBC-Cy5-NPs的粒径大小最适宜分布至肾小球系膜，同时由于RBCm的仿生修饰作用，使RBC-Cy5-NPs具有免疫逃逸能力，从而具有显著的肾靶向作用。肾脏荧光强度分析如图7所示，RBC-Cy5-NPs组给药后不同时间点，肾脏的平均荧光强度均显著强于Cy5及Cy5-NPs组(p<0.01)，具有显著的肾靶向性。同时，比较5min和30min时RBC-Cy5-NPs在肾脏中的分布情况，30min时荧光强度比5min增强了20.51％，可以看出随着时间推移，RBC-Cy5-NPs在肾脏部位的聚集量显著增加。该结果表明，RBCm-Cy5-NPs具有一定缓释作用，主要在肾脏部位蓄积且滞留时间较长，具有较好的肾靶向性。

本申请提供了一种红细胞膜仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统(RBC-PA-NPs)，通过RBCm对PA-NPs的仿生修饰来赋予NPs免疫逃逸的能力，然后再通过控制粒径大小以达到靶向肾小球部位的目的。本申请成功制备出了粒度适宜，稳定性好的RBC-PA-NPs。

根据RBC的特点一般采用低渗裂解法制备RBCm。但通过低渗得到的RBCm，粒径为2768.43±226.98nm，其大小很难完全包裹较小的载药NPs。本申请采用冰浴超声细胞破碎法制备的RBCm，粒径为319.90±7.29nm，其大小更有助于NPs的包封，同时减少了RBCm的损耗，最大限度地保留其结构与功能的完整性。

本实验曾采用共挤出法，将裂解得到的RBCm通过多孔碳酸酯膜反复挤压得到RBCm囊泡后，再将囊泡与载药NPs同时挤出。发现挤出法所制得的RBCm载药纳米系统存在样品损失量大、重现性差以及费时费力等不足，从而选择超声法作为融合细胞膜和NPs的方法。由于本试验所制备的NPs经检测表面带有负电，而RBCm呈现内外两侧的电荷不对称性，即细胞膜内测为电正性，外侧为电负性。在超声的过程中，由于静电作用表面带负电的聚合物NPs会吸引带正电的细胞膜内侧，从而使RBCm以外侧在外、内侧在内的方式覆盖在整个聚合物NPs表面。

PLGA已被证明是安全性较高的生物可降解聚合物之一。但不添加表面活性剂时，所选75/25PLGA载体材料无法形成NPs，且溶液中出现较为明显的分层现象，进一步优化制粒条件也不能避免分层现象发生。由于表面活性剂SDS的加入，有可能增加纳米载药系统的细胞毒性，可能会诱导肾小球细胞凋亡或坏死。所以为了深入对RBC-PA-NPs的研究，我们选用了HBZY-1细胞作为细胞模型来进行体外细胞毒性实验。结果发现，在PA浓度为6.25–200.00ng/mL条件下，各组药物对HBZY-1细胞的毒性较小，细胞存活率均保持85％以上，具有较好的生物相容性，可以进行药物的递送。

纳米材料注射入体内后会被机体的单核吞噬细胞系统快速识别并清除出体外，使纳米载药系统的治疗效果受限。因此，通过仿生修饰纳米载体材料来躲避单核吞噬细胞系统的吞噬，增强药物靶向性是一个重要的研究方向。RBCm是NPs理想的表面修饰材料，可以减少单核吞噬细胞的摄取，使纳米载药系统具备免疫逃逸的能力。在体外摄取实验中，通过比较RBC-Cy5-NPs和Cy5-NPs在HBZY-1和RAW264.7细胞中的摄取效率，来考察RBC-Cy5-NPs和Cy5-NPs的肾靶向性和免疫逃逸能力。以HBZY-1细胞为研究对象，RBC-Cy5-NPs的细胞摄取明显高于Cy5和Cy5-NPs，HBZY-1细胞是大鼠正常的肾小球系膜细胞，从摄取结果可以看出，RBCm仿生修饰之后，易于被正常的肾小球系膜细胞摄取，因此RBCm的修饰增加了NPs的靶向性。而RAW264.7细胞是医学研究中常见的大鼠巨噬细胞系，在体外表现出巨噬细胞的吞噬特性。本申请采用RAW264.7细胞作为单核吞噬细胞模型，对比研究RBC-Cy5-NPs和Cy5-NPs在RAW264.7细胞中的摄取情况。结果表明，相比RBC-Cy5-NPs，Cy5-NPs在RAW264.7中表现出较高的摄取效率，可能因为是经细胞膜的包裹，使RBCm蛋白对载药纳米系统进行表面修饰，尤其是RBCm表面的CD47可以与巨噬细胞表面的信号调节蛋白相互作用来抑制巨噬细胞的吞噬，最终使RBC-Cy5-NPs具有RBC样免疫逃逸能力。

纳米载药系统由于具有一定的尺寸，进入循环系统后，会被正常的肾小球组织截留，使其无法像小分子、蛋白质等被重吸收而富集在肾小球部位。而由于肾小球内部具有淋巴系统，使得NPs可能被识别为外来物质，而被单核吞噬细胞吞噬清除，从而无法在肾小球中富集并释放药物，发挥相应的抗炎作用。所以本申请分别对RBC-Cy5-NPs和Cy5-NPs在SD大鼠体内的肾靶向性进行考察。研究结果表明，与空白组和对照组相比，因RBC-Cy5-NPs和Cy5-NPs具有较为适宜的粒径，能被肾脏这类单核吞噬细胞系统丰富的组织截留，并在注射后大部分迅速富集到肾组织当中。而随着注射时间的延长，由于RBCm的仿生修饰作用提高了RBC-Cy5-NPs的生物相容性，可显著减少单核吞噬系统对RBC-Cy5-NPs的清除，最终使其有效的逃避免疫系统的识别而能够更有效的靶向肾小球部位并在肾脏中逐渐积累。

综上所述，基于肾小球部位的特殊结构和RBCm的仿生修饰作用，RBCm仿生修饰的新型肾靶向纳米载药系统RBC-PA-NPs在体内外实验中表现出较好的肾靶向性和免疫逃逸特性，表面RBCm的仿生修饰是提高PA-NPs靶向肾脏的有效策略。这项研究将会为肾靶向载药系统当前存在的瓶颈提供一个有效的解决方案。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统，其特征在于：以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体材料包载肾炎治疗药物，制备纳米粒，再用红细胞膜包裹所述纳米粒，得到红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统，NPs粒径为95nm左右；该红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统的制备包括如下过程：将肾炎治疗药物与载体材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合后，溶解于有机溶剂得到有机相；将表面活性剂溶解于水中得到水相；将有机相迅速加入水相中，超声处理；挥发除去有机溶剂得到纳米粒；将纳米粒与红细胞膜混合，得到红细胞膜包裹的纳米载药系统，所述有机溶剂为丙酮，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物为75/25PLGA 1.5-2.3W。

2.如权利要求1所述的一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括：将肾炎治疗药物与载体材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合后，溶解于有机溶剂得到有机相；将表面活性剂溶解于水中得到水相；将有机相迅速加入水相中，超声处理；挥发除去有机溶剂得到纳米粒；将纳米粒与红细胞膜混合，得到红细胞膜包裹的纳米载药系统，所述有机溶剂为丙酮，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物为75/25PLGA 1.5-2.3W。

3.根据权利要求2所述的一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统的制备方法，其特征在于：红细胞膜通过超声波细胞破碎仪冰浴超声制备。

4.根据权利要求2所述的一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统的制备方法，其特征在于：采用超声处理使红细胞膜包裹纳米粒。

5.如权利要求1所述的一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统、或权利要求2-4任一所述的制备方法，其特征在于：所述肾炎治疗药物包括糖皮质激素和免疫抑制剂中的至少一种。

6.如权利要求5中所述的肾炎治疗药物，其特征在于，所述糖皮质激素包括醋酸泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、氢化可的松、地塞米松中的至少一种；所述免疫抑制剂包括环磷酰胺、霉酚酸酯、他克莫司、环孢素A、中药雷公藤多甙中的至少一种。

7.如权利要求1所述的一种红细胞膜仿生修饰的肾靶向纳米载药系统、或权利要求2-4任一所述的制备方法制备的载药系统在制备肾靶向纳米药物制剂中的应用。

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