CN108703959A - 一种红细胞膜包裹载抗癌药的plga纳米载体及其制备和应用 - Google Patents

一种红细胞膜包裹载抗癌药的plga纳米载体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体及其制备和应用。该载体是通过PLGA在TPGS和PTX条件下自组装成纳米载体，然后加入红细胞膜挤压得到。制备方法包括：载药的纳米载体PTX@PLGA制备，红细胞膜制备，红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体制备。使用的红细胞膜、PLGA、TPGS都是生物相容性非常好的生物材料，不会对机体产生毒性。制备方法操作简单，反应条件温和。

Description

一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体及其制备和应用
技术领域
本发明属于化疗药物递送纳米载体及其制备和应用领域，特别涉及一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
红细胞作为血液中最丰富的细胞类型，提取的红细胞膜用于仿生包衣纳米载体，由于其固有的生物相容性，长血液半衰期，以及易于表面结构改性，已被广泛用于药物输送和其他治疗应用。CD47是红细胞表面的膜蛋白，通过与巨噬细胞表面CD47受体-信号调节蛋白之间的作用，从而调控巨噬细胞的摄取作用。因此，选择红细胞作为理想的体内药物运载体可以实现体内的长效循环，避免巨噬细胞对其吞噬，调控载药体系的粒径，通过EPR效应聚集在肿瘤部位，实现对癌细胞的抑制作用。
PLGA是一种高分子材料。具有生物相容性、可降解性被广泛用于生物医学领域，因此选择PLGA作为药物递送的载体。选择抗癌药物紫杉醇(PTX)作为模型药物，其作为当今公认的广谱、高效、低毒的天然抗癌药物，对各种肿瘤都具有抑制作用，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌和其他类型的癌症。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体及其制备和应用，以克服现有技术中药物的靶向释放率低的缺陷。
本发明的一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体，通过PLGA在TPGS和PTX条件下自组装成纳米载体，然后加入红细胞膜挤压得到。
本发明的一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体的制备方法，包括：
(1)将PLGA、TPGS和PTX溶于丙酮中，超声，加入到去离子水中，搅拌，干燥使丙酮挥发，得到载药的纳米载体PTX@PLGA溶液，其中PLGA与PTX的质量比为8:1～12:1，PLGA与TPGS的质量比为3:1～7:1，PLGA、丙酮和去离子水的比例为8～12mg:1～2mL:3～7mL；
(2)将动物心脏取血后离心，PBS洗涤除去血清，将红细胞重悬于EDTA溶液，再次离心除去上清液，重复重悬和离心直到上清液没有红色，将得到的红细胞膜储存于含蛋白酶抑制剂的PBS中，-20℃左右保存；
(3)将步骤(2)中红细胞膜解冻摇匀，取少量去离子水洗涤，加入到步骤(1)中载药的纳米载体PTX@PLGA溶液中，超声，挤压，得到红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体。
所述步骤(1)中超声时间为3～8min。
所述步骤(1)中搅拌温度为室温，搅拌时间为3～4h，搅拌速率为800～1000rpm。
所述步骤(2)中PBS为pH＝7.4的PBS缓冲液；EDTA溶液浓度为0.2mM。
所述步骤(2)中再次离心速率为10000～15000rpm，温度为4℃，时间为5～10min。
所述步骤(3)中超声时间为8～15min，超声功率为80～150w。
所述步骤(3)中挤压次数为11～13次。
本发明的一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体的应用。包括应用于癌细胞的药物递送。
本发明中PLGA溶于丙酮后缓慢滴加到水中，会在室温搅拌的条件下发生自组装形成纳米载体。由于PLGA可溶于丙酮但不溶于水，当丙酮挥发后，溶液的密度增大发生相似相溶，疏水端聚集，亲水端朝向外侧。加入表面活性剂TPGS，增加难溶性水溶性药物的溶解度，同时使PLGA微球产生孔径，使药物更好的包裹在内部，提高释药率。
有益效果
(1)本发明使用的红细胞膜、PLGA、TPGS都是生物相容性非常好的生物材料，不会对机体产生毒性；
(2)本发明方法操作简单，反应条件温和，制备的PLGA纳米载体在加入TPGS后，产生孔径，通透性提高，增加难溶性水溶性药物的释药率；
(3)本发明使用红细胞膜包裹在PLGA纳米载体表面，生物相容性极好，可以减少排异反应。红细胞表面的膜蛋白CD47通过与巨噬细胞表面CD47受体-信号调节蛋白之间的作用，调控巨噬细胞的摄取。通过EPR效应聚集在肿瘤部位，从而实现对癌细胞的高效杀灭作用。实现肿瘤微环境响应、红细胞仿生包衣长效循环的纳米载药体系。
附图说明
图1为本发明红细胞膜包裹载药的多孔PLGA纳米载体制备过程图；
图2为实施例2中PLGA纳米载体(a)和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体(b)在透射电镜下的形貌图；
图3为实施例3中PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体在25℃下的粒径变化曲线；
图4为实施例4中PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体的Zeta电势图；
图5为实施例5中载PTX的PLGA纳米载体和载PTX的TPGS-PLGA纳米载体分别在酸性和中性环境中的释放曲线；
图6为实施例6中载PTX的PLGA纳米载体和载PTX的红细胞膜包裹的PLGA纳米载体在不同浓度下对MCF-7细胞毒性比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将10mg PLGA、1mg PTX和2mg TPGS溶于1mL丙酮中，超声直至溶解，然后缓慢加入到转速为1000rpm，含5mL去离子水的圆底烧瓶中。搅拌3小时，放入真空干燥箱中，使丙酮挥发，得到载药的纳米载体。
(2)SD大鼠心脏取血，将血液以3000rpm离心5min，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)洗涤三次以除去血清。将红细胞重悬于0.2mM EDTA溶液中以诱导膜破裂。4℃以14800rpm离心7min除去上清液。重复前两个步骤直到上清液没有红色。提取的红细胞膜储存在含抑制剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)中，-20℃保存备用。
(3)将步骤(2)中提取的红细胞膜解冻摇匀。取300μL悬液，加入2mL去离子水重悬，10000rpm离心5min后再次重悬。搅拌下将红细胞膜悬液缓慢加入步骤(1)制备的载药纳米颗粒中，并在功率100w下超声10min。使用挤压器挤压过200nm膜，每次挤压次数为12次。得到红细胞膜包裹的PLGA纳米载体。
实施例2
按照实施例1的方法制备不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体。将不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体分别用去离子水配成浓度为200μg/mL的溶液，然后在透射电镜下测其形貌。
两种胶束的透射电镜如图2所示。红细胞膜包裹的PLGA纳米载体粒径大小约为80～100nm，在PLGA纳米载体的表面有一层深色的物质包裹，进一步证明红细胞膜的包裹。
实施例3
按照实施例1的方法制备不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体。将不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体分别用去离子水配成浓度为500μg/mL的溶液，然后在25℃下测其水动态粒径。
两种纳米载体在25℃下测其水动态粒径的结果如图3所示，PLGA空白纳米载体在25℃的粒径为120.5±3nm；红细胞膜包裹的PLGA空白纳米载体在25℃的粒径为125.0±4nm。结果表明红细胞膜包裹的PLGA空白纳米载体粒径变大，证明红细胞膜的成功包裹。
实施例4
按照实施例1的方法制备不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体。将不载药的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的PLGA纳米载体分别用去离子水配成浓度为500μg/mL的溶液，然后在25℃下测其Zeta电势。
两种纳米载体Zeta电势如图4所示，PLGA空白纳米载体的Zeta电势为-28.4±1mv；红细胞膜包裹的PLGA空白纳米载体的Zeta电势为-34.3±1.2mv。结果表明红细胞膜包裹的PLGA空白纳米载体Zeta电势变大，证明红细胞膜的成功包裹。
实施例5
(1)取2mL载PTX的PLGA纳米载体(按照实施例1制备)和2mL实例1中载PTX的TPGS-PLGA纳米载体分别加入截留分子量为7000的透析袋中，随后将其浸入18mL的缓冲液(0.1％吐温80，PBS，pH＝7.4)和缓冲液(0.1％吐温80，PBS，pH＝5.5)。
(2)将上述释药体系转移到37℃转速为100rpm的恒温摇床中。每隔0.5、1、2、4、8、12、24、36和48h，取出1mL在227nm下检测其吸光度，并补足1mL相同的新鲜缓冲液。收集数据并计算药物释放情况。
两种载体中的PTX在有或无TPGS环境下的释放曲线如图5所示。在48h后，载药PLGA纳米载体最终的PTX在中性PBS缓释液中的累积释放量只有29.2±2.0％，在弱酸性PBS缓释液中的累积释放量提高为38.5±2.5％。然而在加入TPGS的中性PBS缓释液中的累积释放量为76.8±2.2％，当在酸性环境下可以达到85.8±2.5％。结果表明，制备的载药TPGS-PLGA纳米载体具有较高的载药量，在弱酸性环境下释药率较高，有利于实现药物在癌细胞内的靶向释放，减少对机体的毒副作用。
实施例6
(1)在96孔细胞培养板中每孔加入200μL细胞培养液，放进培养箱中培养2h。吸去培养液，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL MCF-7细胞悬液，并补足每孔100μL的培养液。在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。
(2)第二天倒掉旧培养基，加入PBS溶液、浓度梯度的药物即：PTX溶液、载药的PLGA纳米颗粒和红细胞膜包裹的载药PLGA纳米载体，药物浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，每孔100μL。并补足每孔100μL的培养液。在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。倒置显微镜下观察。
(3)吸去含材料的培养液，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)和180μL的培养液，在摇床中避光继续培养3h。
(4)终止培养，吸去孔内的培养液。每孔加入200μL二甲基亚砜，置于摇床上振荡15min，振速为100rpm，使结晶物充分溶解。使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
游离的PTX或不同浓度载药纳米载体对MCF-7细胞的MTT结果(如图6所示)表明：经过材料孵化后，用红细胞膜包裹的载药PLGA纳米载体在高浓度时对癌细胞有较强的抑制作用，说明红细胞膜仿生包衣的载药纳米材料具有很好的抗癌效果。
实施例7
(1)在24孔细胞培养板中放入盖玻片，并种入MCF-7细胞，每孔细胞密度大约为30,000个，并补足每孔1mL的培养液，在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。
(2)第二天倒掉旧培养基，加入100μL的PBS溶液、20μg/mL FITC标记的PLGA纳米载体和红细胞膜包裹的FITC标记的PLGA纳米载体，并补足900μL新鲜培养基，孵育2h。
(3)吸去含材料的培养液，并用PBS冲洗，加1ml 2.5％的戊二醛4℃下固定15min。
(4)吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加1mL 10μg/mL Hoescht 33342染色15min。
(5)吸去Hoescht 33342，并用PBS冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。
游离的PTX或不同载药纳米载体对MCF-7细胞的激光共聚焦显微镜检测结果表明：经过材料孵化后，用红细胞膜包裹的载药PLGA纳米载体表现出了较强的胞内FITC荧光强度，表明该材料被成功摄取，说明载药胶束对乳腺癌细胞表现出一定的靶向性选择性。

Claims (9)

1.一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体，其特征在于，通过PLGA在TPGS和PTX条件下自组装成纳米载体，然后加入红细胞膜挤压得到。
2.一种红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体的制备方法，包括：
(1)将PLGA、TPGS和PTX溶于丙酮中，超声，加入到去离子水中，搅拌，干燥使丙酮挥发，得到载药的纳米载体PTX@PLGA，其中PLGA与PTX的质量比为8:1～12:1，PLGA与TPGS的质量比为3:1～7:1，PLGA、丙酮和去离子水的比例为8～12mg:1～2mL:3～7mL；
(2)将动物心脏取血后离心，PBS洗涤，将得到的红细胞重悬于EDTA溶液中，再次离心，重复重悬和离心直到上清液没有红色，将得到的红细胞膜储存于含蛋白酶抑制剂的PBS中；
(3)将步骤(2)中红细胞膜摇匀，洗涤，加入到步骤(1)中载药的纳米载体PTX@PLGA溶液中，超声，挤压，得到红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中超声时间为3～8min。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌温度为室温，搅拌时间为3～4h，搅拌速率为800～1000rpm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PBS为pH＝7.4的PBS缓冲液；EDTA溶液浓度为0.2mM。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中再次离心速率为10000～15000rpm，温度为4℃，时间为5～10min。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中超声时间为8～15min，超声功率为80～150w。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中挤压次数为11～13次。
9.一种如权利要求1所述的红细胞膜包裹载抗癌药的PLGA纳米载体的应用。
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