CN110898029B - 一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药plga材料及其制备和应用 - Google Patents

一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药plga材料及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药PLGA材料及其制备和应用，包括：红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体RBCM‑PDA‑CUR@PLGA。使用的红细胞膜、PLGA、TPGS、DA都是生物相容性非常好的生物材料，不会对机体产生毒性。制备方法操作简单，反应条件温和。

Description

一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药PLGA材料及其制备和 应用
技术领域
本发明属于化疗和光热一体药物及其制备和应用领域，特别涉及一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药PLGA材料及其制备和应用。
背景技术
红细胞是一种天然的长效循环载体，其表面的膜蛋白CD47，可以通过与巨噬细胞表面CD47受体-信号调节蛋白之间的作用，从而调控巨噬细胞的摄取作用，使纳米载体可以逃避体内的免疫识别，通过EPR效应聚集在肿瘤部位，实现对癌细胞的抑制作用。目前红细胞膜(RBCM)已被广泛用于药物输送和其他治疗应用。
聚多巴胺(PDA)是一种由多巴胺(DA)聚合而成的生物聚合物，具有优异的生物相容性和低细胞毒性。在光学性质方面，其在紫外光到可见光的范围乃至近红外区域都有光吸收，因此光热转换效率较高，在细胞和动物实验中均证明其光热治疗效果显著。
PLGA是一种高分子材料。具有生物相容性、可降解性被广泛用于生物医学领域，因此选择PLGA作为药物递送的载体。选择抗癌药物姜黄素(CUR)作为模型药物，其不仅是天然的保健品，具有抗氧化等作用，还具有抗癌、直接抑制肿瘤增长的作用。
CN108703959A公开了一种红细胞包裹抗癌药物的PLGA纳米载体及其制备和应用，但其单单只限于化学治疗手段。本发明为了进一步提高对癌症的治疗，在选取了合适的特异性药物载体基于化疗的基础上，使用光热材料PDA作为光热剂，增加了光热治疗的方法，提高对癌细胞的抑制效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药PLGA材料及其制备和应用，克服现有技术中药物的靶向释放率低的缺陷，本发明通过PLGA在TPGS和CUR条件下自组装成纳米载体，加入DA在碱性条件下搅拌反应得到PDA涂覆在纳米载体表面，然后加入红细胞膜挤压得到的红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载药PLGA材料实现化疗与光热治疗。
本发明的一种纳米复合材料，所述复合材料以载药的PLGA为纳米载体，载体表面依次包覆聚多巴胺和红细胞。
本发明的一种纳米复合材料的制备方法，包括：
(1)将多巴胺DA溶解在缓冲液中，并逐滴加入纳米载体CUR/PLGA，搅拌，离心，去离子水重悬，得到PDA-CUR/PLGA；
(2)将红细胞膜解冻摇匀，洗涤，加入PDA-CUR/PLGA溶液中，超声，挤压，即得纳米复合材料。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中缓冲液为Tris-缓冲液pH＝8.5～10；多巴胺DA、Tris-缓冲液和去离子水的比例为4～6mg:1～3mL:5～6mL。
所述步骤(1)中多巴胺DA、纳米载体CUR/PLGA的质量比为1:1～1:3。
所述步骤(1)中纳米载体CUR/PLGA具体为：将PLGA、TPGS和CUR溶于丙酮中，超声，加入到去离子水中，搅拌，干燥使丙酮挥发，离心，并用少量Tris-缓冲液溶解，得到载药的纳米载体CUR/PLGA，其中PLGA与CUR的质量比为8:1～12:1，PLGA与TPGS的质量比为3:1～7:1，PLGA、丙酮、Tris-缓冲液和去离子水的比例为8～12mg:1～2mL:2～4mL:3～7mL。所述纳米载体CUR/PLGA中的超声时间为3～8min；搅拌温度为室温，搅拌时间为3～4h，搅拌速率为800～1000rpm；离心速率为8000～10000rpm，温度为25℃，时间为10～15min；Tris-缓冲液为pH＝8.5的Tris-缓冲液。
所述步骤(1)中搅拌温度为25℃，搅拌时间为6～8h，搅拌速率为600～800rpm；离心速率为10000～15000rpm，洗涤次数为3～4次。
所述步骤(2)中红细胞膜具体为：将动物心脏取血后离心，PBS洗涤除去血清，将红细胞重悬于EDTA溶液，再次离心除去上清液，重复重悬和离心直到上清液没有红色，将得到的红细胞膜储存于含蛋白酶抑制剂的PBS中，-20℃左右保存。
所述红细胞膜制备过程中的所用PBS为pH＝7.4的PBS缓冲液；EDTA溶液浓度为0.2mM；再次离心速率为10000～15000rpm，温度为4℃，时间为5～10min。
所述步骤(2)中红细胞膜、PDA-CUR/PLGA的比例为200～300μL:2～3mL。
所述步骤(2)中超声时间为5～8min，超声功率为80～120w；挤压次数为11～13次。
本发明提供一种所述方法制备的纳米复合材料。
本发明的一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体的应用。包括应用于癌细胞的药物递送。
本发明提供一种所述纳米复合材料在制备化疗和光热一体药物中的应用。
有益效果
(1)本发明使用的红细胞膜、PLGA、TPGS、DA都是生物相容性非常好的生物材料，不会对机体产生毒性；
(2)本发明方法操作简单，反应条件温和，加入TPGS可以使PLGA纳米载体产生孔径，增加难溶性水溶性药物的释药率；
(3)本发明使用的PDA是一种由DA聚合而成的生物聚合物，具有优异的生物相容性和低细胞毒性，光热转换效率较高，可以有效的抑制癌细胞的生长。
(4)本发明使用红细胞膜包裹在PDA涂覆的PLGA纳米载体表面，生物相容性极好，低免疫原性，可以减少排异反应。红细胞表面的膜蛋白CD47通过与巨噬细胞表面CD47受体-信号调节蛋白之间的作用，释放出“不吃我”信号，可以调控巨噬细胞的摄取。
(5)本发明的细胞毒性实验中，在功率为0.5W/cm2的较低功率的激光照射下可产生高热，使化疗与激光治疗组的细胞存活率最低，对癌细胞具有高效杀灭作用。
(6)本发明使用光热材料PDA作为光热剂，在激光照射下的载药纳米载体温度升高后释药量显著增加，证明其有温度依赖性，因此可以通过激光照射条件控制抗癌药物的释放量。另外，在中性环境下具有较高的药物释放量，证明其具有pH依赖性，这会使药物在弱酸环境下的肿瘤部位聚集，长期稳定存在，达到抑制癌细胞的作用。
附图说明
图1为实施例1中PLGA纳米载体(a)、PDA涂覆PLGA纳米载体(b)和红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA纳米载体(c)在透射电镜下的形貌图；
图2为实施例2中不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆PLGA载药纳米载体和红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体在25℃下的水动态粒径变化曲线；
图3为实施例3中红细胞膜、不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆PLGA载药纳米载体和红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体的Zeta电势图；
图4为实施例4中PLGA空白纳米载体和PDA涂覆PLGA空白纳米载体的红外图谱；
图5为实施例5中RBCM-PDA-CUR@PLGA纳米载体在不同pH环境下及不同温度条件下的药物释放曲线；
图6为实施例6中游离CUR、PDA-CUR@PLGA、RBCM-PDA-CUR@PLGA、PDA-CUR@PLGA+激光、RBCM-PDA-CUR@PLGA+激光在不同浓度下对H22的MTT细胞毒性结果；
图7中的(a)、(b)、(c)为体外升温结果和光热稳定性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
主要材料的来源及规格参数
Figure BDA0002282421280000041
实施例1
(1)将10mg PLGA、1mg CUR和2mg TPGS溶于1mL丙酮中，超声直至溶解，然后缓慢加入到转速为1000rpm，含5mL去离子水的圆底烧瓶中。搅拌3小时，放入真空干燥箱中，使丙酮挥发，8000rpm离心10min后，用3mL的Tris-缓冲液重悬，得到载药的纳米载体。
(2)将5mg DA溶解于2mL的Tris-缓冲液中，并逐滴加入步骤(1)中的载药的纳米载体。25℃以800rpm搅拌6小时，11000rpm离心洗涤三次，用5mL去离子水重悬，得到PDA涂覆的载药纳米载体。
(3)SD大鼠心脏取血，将血液以3000rpm离心5min，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)洗涤三次以除去血清。将红细胞重悬于0.2mM EDTA溶液中以诱导膜破裂。4℃以14800rpm离心7min除去上清液。重复前两个步骤直到上清液没有红色。提取的红细胞膜储存在含抑制剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)中，-20℃保存备用。
(4)将步骤(3)中提取的红细胞膜解冻摇匀。取300μL悬液，加入2mL去离子水重悬，10000rpm离心5min后再次重悬。搅拌下将红细胞膜悬液缓慢加入步骤(2)制备的载药纳米颗粒中，并在功率100w下超声5min。使用挤压器挤压过200nm膜，每次挤压次数为12次。得到红细胞膜包裹的PDA涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体。
按照上述步骤的方法制备不载药的纳米载体，并对其进行形貌表征，透射电镜结果如图1所示，PDA涂覆PLGA纳米载体粒径大小约为160～190nm，在PLGA纳米载体的表面有深色层状物质。红细胞膜包裹后，其载体最外层表面有透明膜状物质。
实施例2
按照实施例1的方法制备不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆PLGA载药纳米载体和红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体。分别用去离子水配成浓度为500μg/mL的溶液，然后在25℃下测其水动态粒径。
四种纳米载体在25℃下测其水动态粒径的结果如图2所示，空白PLGA纳米载体粒径为164.2±2nm；空白PDA涂覆PLGA纳米载体粒径为190.2±3nm；PDA涂覆PLGA载药纳米载体粒径为190.5±3nm；红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体粒径为220.2±4nm。结果表明红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体粒径变大，证明红细胞膜的成功包裹。
实施例3
按照实施例1的方法制备红细胞膜、不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆不载药的PLGA纳米载体、PDA涂覆PLGA载药纳米载体和红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体。分别用去离子水配成浓度为500μg/mL的溶液，然后在25℃下测其Zeta电势。
五种载体Zeta电势如图3所示，RBCM的Zeta电势为-19.2±2mv；空白PLGA纳米载体的Zeta电势为-14.8±2mv；空白PDA涂覆PLGA纳米载体的Zeta电势为-25.3±1mv；PDA涂覆PLGA载药纳米载体的Zeta电势为-28.8±2mv；红细胞膜包裹的PDA涂覆PLGA载药纳米载体的Zeta电势为-23.0±2mv。结果表明红细胞膜包裹后的Zeta电势变大，证明红细胞膜的成功包裹。
实施例4
按照实施例1的方法制备不载药的PLGA纳米载体和PDA涂覆不载药的PLGA纳米载体，冷冻干燥，进行结构确证。由图4红外图谱所示，PLGA在3200cm-1处有-OH峰，1700cm-1处有羰基峰。PDA-PLGA的图谱显示，在约为750cm-1，1500cm-1，1600cm-1处出现新的吸收峰信号，表现为苯环的吸收峰，从而证实了PDA的成功涂覆。
实施例5
(1)取2mL载CUR的RBCM-PDA-PLGA纳米载体(按照实施例1制备)加入截留分子量为7000的透析袋中，随后将其分别浸入18mL的缓冲液(1％SDS，PBS，pH＝7.4)和缓冲液(1％SDS，PBS，pH＝5.5)。
(2)将上述释药体系分别转移到37℃和45℃转速为100rpm的恒温摇床中。每隔0.5、1、2、4、8、12、24、36和48h，取出1mL在425nm下检测其吸光度，并补足1mL相同的新鲜缓冲液。收集数据并计算药物释放情况。
两种载体中的不同pH和不同温度环境下的释放曲线如图5所示。在48h后，载药纳米载体最终的CUR在37℃下酸性PBS缓释液中的累积释放量只有12.8±2.6％，在中性PBS缓释液中的累积释放量提高为53.8±3.2％。升高温度后的释放量显著增加，酸性PBS缓释液中的累积释放量为19.5±3.5％，当在中性环境下可以达到63.8±3.5％。结果表明，在45℃下，药物的释放量更高。不同pH下释放存在显著差异，在中性环境下释药率较高，说明药物释放具有pH依赖性，酸性条件下不易释放。这会使药物在弱酸环境下的肿瘤部位聚集，长期稳定存在，达到抑制癌细胞的作用。
实施例6
(1)在96孔细胞培养板中每孔加入200μL细胞培养液，放进培养箱中培养2h。吸去培养液，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL H22细胞悬液，并补足每孔100μL的培养液。在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。
(2)第二天倒掉旧培养基，加入PBS溶液、浓度梯度的药物即：游离CUR、PDA-CUR@PLGA、RBCM-PDA-CUR@PLGA、PDA-CUR@PLGA+激光和RBCM-PDA-CUR@PLGA+激光，每孔100μL。并补足每孔100μL的培养液。最终确定药物浓度分别为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL，在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。倒置显微镜下观察。
(3)吸去含材料的培养液，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)和180μL的培养液，在摇床中避光继续培养3h。
(4)终止培养，吸去孔内的培养液。每孔加入200μL二甲基亚砜，置于摇床上振荡15min，振速为100rpm，使结晶物充分溶解。使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
游离CUR、PDA-CUR@PLGA、RBCM-PDA-CUR@PLGA、PDA-CUR@PLGA+激光、RBCM-PDA-CUR@PLGA+激光在不同浓度下对H22的MTT细胞毒性结果如图6所示(在波长808nm,功率0.5W/cm2下，照射5min)，经过材料孵化后，CUR浓度在0.1～20μg/mL会对H22细胞产生一定毒性。PDA涂覆的载药材料在激光照射后具有良好的光热效果，且红细胞膜包裹后，可以有效的抑制H22细胞的生长，说明红细胞膜仿生包衣的载药纳米材料具有很好的抗癌效果。
实施例7
(1)在24孔细胞培养板中放入盖玻片，并种入H22细胞，每孔细胞密度大约为30,000个，并补足每孔1mL的培养液，在5％CO2的条件下于培养箱中培养24h。
(2)第二天倒掉旧培养基，加入100μL的PBS溶液、20μg/mL FITC标记的PDA-PLGA纳米载体和FITC标记的RBCM-PDA-PLGA纳米载体，并补足900μL新鲜培养基，孵育2h。
(3)吸去含材料的培养液，并用PBS冲洗，加1ml 2.5％的戊二醛4℃下固定15min。
(4)吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加1mL 10μg/mL Hoescht 33342染色15min。
(5)吸去Hoescht 33342，并用PBS冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。
游离的CUR或不同载药纳米载体对H22细胞的激光共聚焦显微镜检测结果表明：经过材料孵化后，RBCM-PDA-PLGA纳米载体表现出了较强的胞内FITC荧光强度，表明该材料被成功摄取，说明载药胶束对癌细胞表现出一定的靶向性选择性。
实施例8
为了进一步探究RBCM-PDA-PLGA纳米载体的性能并和CN108703959A作为对比，对其光热效果进行了研究。
(1)配置浓度为1.0mg/mL的RBCM-PDA-PLGA，取1mL在808nm的激光下照射，功率分别为0.5W/cm2，0.8W/cm2，1.0W/cm2，2.0W/cm2的条件下测试，照射300秒，得到不同功率的升温曲线。
(2)配置浓度为0.1mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL的RBCM-PDA-PLGA纳米载体各1mL，在808nm的激光下照射，功率1.0W/cm2的条件下测试，照射300秒，得到不同浓度的升温曲线。
(3)为了验证RBCM-PDA-PLGA纳米粒子的光热稳定性，在808nm的激光下照射测试五次开关循环的温度曲线(1.5W/cm2，1.0mg/mL)。
体外升温结果和光热稳定性如图7所示。由图7(a)中可以看出，RBCM-PDA-PLGA纳米载体具有功率依赖性，温度会随着功率的升高而升高。图7(b)中可得RBCM-PDA-PLGA纳米载体具有浓度依赖性，浓度越高，升温越高。图7(c)中，在五次的升降温度循环后，其温度大致一致，证明了RBCM-PDA-PLGA纳米载体具有很好的光热稳定性。

Claims (13)

1.一种红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体的制备方法，包括：
（1）将PLGA、TPGS和CUR溶于丙酮中，超声，加入到去离子水中，搅拌，干燥使丙酮挥发，离心，并用少量Tris-缓冲液溶解，得到载药的纳米载体CUR@PLGA，其中PLGA与CUR的质量比为8:1~12:1，PLGA与TPGS的质量比为3:1~7:1，PLGA、丙酮、Tris-缓冲液和去离子水的比例为8~12mg:1~2mL: 2~4mL: 3~7mL；
（2）将DA溶解于Tris-缓冲液中，并逐滴加入步骤（1）中的纳米载体CUR@PLGA，搅拌，离心，洗涤，去离子水重悬，得到纳米载体PDA-CUR@PLGA，其中DA、 Tris-缓冲液和去离子水的比例为4~6mg:1~3mL:5~6mL；
（3）将动物心脏取血后离心，PBS洗涤除去血清，将红细胞重悬于EDTA溶液中，再次离心，重复重悬和离心直到上清液没有红色，将得到的红细胞膜储存于含蛋白酶抑制剂的PBS中；
（4）将步骤（3）中红细胞膜解冻摇匀，洗涤，加入到步骤（2）中纳米载体PDA-CUR@PLGA溶液中，超声，挤压，得到红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中超声时间为3~8min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中搅拌温度为室温，搅拌时间为3~4h，搅拌速率为800~1000rpm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中离心速率为8000~10000 rpm，温度为25℃，时间为10~15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的Tris-缓冲液为pH=8.5的Tris-缓冲液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中搅拌温度为25℃，搅拌时间为6~8h，搅拌速率为600~800rpm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中离心速率为10000~15000 rpm，洗涤次数为3~4次。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中PBS为pH=7.4的PBS缓冲液；EDTA溶液浓度为0.2mM。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中再次离心速率为10000~15000 rpm，温度为4℃，时间为5~10min。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中超声时间为5~8min，超声功率为80~120w。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中挤压次数为11~13次。
12.一种权利要求1所述方法制备的红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体，其特征在于，通过PLGA在TPGS和CUR条件下自组装成纳米载体，加入DA在碱性条件下搅拌反应得到PDA涂覆在纳米载体表面，然后加入红细胞膜挤压得到。
13.一种如权利要求1所述方法制备的红细胞膜包裹聚多巴胺涂覆载抗癌药的PLGA纳米载体在制备化疗和光热一体药物中的应用。
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