CN112402617B - 血影紫杉醇及其制备方法与应用 - Google Patents

血影紫杉醇及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血影紫杉醇及其制备方法与应用；本发明采用助水溶剂DEN作为PTX溶剂，极大提高PTX的溶解度；DEN与红细胞孵育，获得装载高浓度PTX的血影，且PTX以晶体形式存在；DEN显著提高PEG‑脂肪修饰血影细胞膜表面的效率，从而提高血影的生物相容性。步骤包括(1)制备压积红细胞；(2)用戊二醛固定红细胞；(3)用DEN与步骤(2)所得红细胞孵育，获得表面修饰PEG的血影紫杉醇；(4)对步骤(3)制得血影表面进行RGD修饰。本发明血影紫杉醇所含紫杉醇浓度为20g/L，且紫杉醇以晶体形式存在，具备缓慢释放药物的效果，血影表面PEG修饰防止吞噬细胞清除，提高生物相容性，延长循环时间，血影表面RGD修饰提高靶向新生血管内皮细胞和肿瘤细胞的能力。

Description

血影紫杉醇及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及材料生物学技术，尤其涉及血影紫杉醇的制备及其对血管内皮和肿瘤细胞的毒性作用的应用。
背景技术
目前已上市的多种抗肿瘤药物中，紫杉醇因其抗肿瘤效果显著，广泛用于乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的临床化疗治疗。但是紫杉醇因其极低水溶性，不利于临床应用，改进紫杉醇(PTX)剂型一直是研究的着重点。其中，红细胞作为一种新型药物递送系统，其独特的细胞构造可保护载体不被内源物质降解失活，且细胞膜的半透膜性质可以达到缓释药物的效果，维持血药浓度，增加循环和作用时间，从而提高抗肿瘤效果。红细胞属于自体细胞而具有更好的生物相容性和可降解性。而且在红细胞表面修饰多肽等物质(例如RGD，Arg-Gly-Asp精-甘-天冬氨酸)使其具有靶向能力。红细胞作为一种优势载体应用于药物投递被广泛研究，在临床给药中具有非常重要的意义。
目前采用红细胞作为PTX载体的研究中，大致分为两种装载方法：第一种，直接将PTX装载于红细胞，但是载药量过低，因为其制备方法是将PTX溶于水溶液中与红细胞孵育，通过低渗裂解法将PTX包被于红细胞；第二种，先将PTX与其他纳米材料制备成载药纳米颗粒后，再将这些颗粒用红细胞装载进行投递，这种方法较前种方法载药量提高，但是引入了外源物质，会激活机体的免疫反应。
发明内容
本发明的第一目的在于为疏水性药物在临床上的应用提供一个新的解决思路，采用助水溶剂体系解决疏水性化疗药物的装载问题，不同药物通过选择合适的助水溶剂增加其溶解度，提高抗肿瘤效果的同时，减少药物佐剂或是外源性载药载体的副作用。
本发明提供一种血影包被疏水性物质的组合物，所述疏水性物质为紫杉醇、阿霉素、顺铂、7-乙基-10-羟基喜树碱或坦螺旋霉素；所述血影包被疏水性物质；所述血影表面修饰PEG；所述PEG上面连接有RGD多肽，所述疏水性物质为晶体状。结合PEG后血影直径增大，可以说明PEG-脂肪已经插入血影细胞膜。
PTX要形成晶体，需要从溶解度高的溶液转换成溶解度低的溶液。PTX在细胞质膜内部是无法形成晶体的，因为紫杉醇处于疏水环境。PTX晶体的外形有多种，PTX量少时，形成颗粒状晶体，多时，形成针状晶体。
本发明的第二目的在于提供一种装载紫杉醇的血影递送载体，所获产品对新生血管内皮细胞和癌细胞具有高毒性。
一种紫杉醇新剂型——血影紫杉醇，所述血影包被浓度为10-20g/L浓度紫杉醇；所述血影表面修饰PEG；所述血影表面修饰RGD多肽，所述紫杉醇为晶体状。所述血影紫杉醇表面修饰大量聚乙二醇(PEG)，DEN显著提高PEG-脂质整合到细胞膜上的效率，提高载PTX血影的生物相容性。所述血影紫杉醇表面修饰RGD，增加靶向血管内皮和肿瘤细胞的效率，提高抗肿瘤活性。
所述血影紫杉醇制备方法中，采用助水溶剂——二乙基烟酰胺(DEN)作为紫杉醇(PTX)溶剂，极大提高PTX的溶解度，提升血影包被紫杉醇量；所述血影紫杉醇采用DEN孵育红细胞，制备包被高浓度(20g/L)PTX的血影，包封率为80％；所述血影紫杉醇包被紫杉醇晶体。
本发明的第三目的在于提高一种高效、快速的血影紫杉醇制备方法，包括以下步骤：
(1)制备无菌压积红细胞；
(2)用戊二醛溶液重悬压积红细胞并避光孵育，并洗涤定容；
(3)将步骤(2)制得红细胞与DEN、PTX和DSPE-PEG2K-MAL混合液孵育制备表面修饰PEG的血影紫杉醇；
(4)将步骤(3)制得的血影紫杉醇与RGD避光孵育过夜，洗涤，制得表面修饰PEG和RGD的血影紫杉醇。
进一步的，所述步骤(3)包括以下步骤：
(a)配制DEN，PTX，DSPE-PEG2K-MAL混合液，用注射器吸取；
(b)将步骤(a)所述混合液往步骤(2)红细胞中快速打入并快速吸打多次，避光孵育后制得含血影紫杉醇的混合液；
(c)将步骤(b)混合液离心处理，去除上清液；
(d)血影沉淀按照顺序用DEN水溶液梯度洗涤，洗涤多次后，离心处理；
(e)用1×PBS洗涤多次，离心处理；
(f)定容制得表面修饰PEG的血影紫杉醇。
进一步的，步骤(2)中所述戊二醛溶液的加入量为每3μL压积红细胞中加600μL，浓度为0.03％的戊二醛溶液；600μL，浓度为0.03％，压积红细胞量为3μL，步骤(3)中每3μL压积红细胞中加入360μL DEN、PTX和DSPE-PEG2K-MAL混合液，360μL混合液含1.26mmol DEN，0.612μmol DSPE-PEG2K-MAL和9mg PTX，步骤(4)中每3μL压积红细胞中加0.612μmol RGD的加入量为0.612μmol。
二乙基烟酰胺(DEN)是一种助水溶剂，自缔合作用是含芳香环结构的助水溶剂的作用机制之一。虽然DEN的自缔合反应局限于生成二聚体，但DEN具有很强的氢键能力，吡啶环的氢键能力是溶解PTX能力显著的关键原因。同时，溶质的芳香环数量对助水溶剂的增溶作用有重要影响，PTX恰好包含多个芳香环结构，具有很强的氢键能力，与DEN氢键之间强烈的相互作用提高了PTX的水溶性。此外，疏水相互作用也是疏水性药物增溶的主要动力之一，疏水性越强，在水中自聚集性增强，其溶解能力也越强。总之，DEN与PTX的氢键相互作用及疏水作用提升了PTX的水溶性。另外DEN会干扰磷脂酸粉子层产生孔隙，有利于PTX进入血影内部，提升血影中PTX的负载量。
DEN还能促进DSPE-PEG2K-MAL更好地整合到细胞膜上，从而在血影细胞膜表面产生空间位阻效应，阻碍吞噬细胞的识别，逃避RES的清除，从而延长血液循环时间。
与现有技术相比，本发明采用DEN作为PTX溶剂，可极大提高紫杉醇的溶解度，使红细胞载药量大幅度提升，包被高浓度紫杉醇(晶体)；血影表面PEG化，能够阻碍载体与血液蛋白聚团，提升血影稳定性，避免RES系统清除，延长循环时间，提高生物相容性；通过细胞膜表面修饰RGD靶向肿瘤细胞和新生血管，从而提高抗肿瘤效果。
本发明成功实现血影包被紫杉醇晶体，有望使药物在血液循环中或肿瘤微环境中持续释放，长时间内维持血药浓度，提高抗肿瘤活性，延长给药周期；药物的缓慢且持续释放，与载药脂质体等纳米药物的快速释放不同，还可能避免产生耐药性；晶体形式存在的药物比之游离药物分子的稳定性更好，不易降解失效。DEN制备血影体系中，加入DSPE-PEG这种含有与细胞膜磷脂成分相似的脂类修饰物，在DEN作用下，提高了整合到细胞膜上的效率，从而提高红细胞这类生物膜载药系统的可修饰性，改善了血影的生物相容性。另外，血影的RGD修饰进一步增加靶向性，提高血影紫杉醇靶向肿瘤细胞和血管内皮细胞的效率，提高细胞内吞血影紫杉醇的效率，从而提高应用能力。经细胞毒性实验证明，血影紫杉醇具有高细胞毒性，在24h杀死95％以上的细胞。
附图说明
图1为本发明血影紫杉醇的制备方法示意图；
图2为本发明血影紫杉醇的的红外光谱图及衍射峰谱图；其中图2中(A)图为血影紫杉醇(PTX-EG)、空载血影(EG)、红细胞(RBC)和紫杉醇标准品(PTX)的红外光谱图，图2中(B)图为PTX-EG、EG、RBC和PTX标准品的晶体衍射峰谱图；
图3为本发明血影紫杉醇的高效液相色谱图；其中图3中(A)图为10μg/mLPTX标准品的洗脱峰的高效液相色谱图，图3中(B)图为PTX-EG的洗脱峰的高效液相色谱图；
图4为本发明血影紫杉醇的PTX和DEN的载药量、浓度、包封率的统计柱状图，其中图4中(A)图为单个血影紫杉醇(PTX-EG)中PTX和DEN的载药量的统计柱状图，图4中(B)图为单个PTX-EG中PTX和DEN的浓度的统计柱状图，图4中(C)图为单个PTX-EG中PTX和DEN的包封率的统计柱状图；
图5为本发明血影紫杉醇的药物释放曲线，其中图5中(A)图为血影紫杉醇(PTX-EG)的体外药物释放曲线，图5中(B)图为PEG修饰的血影紫杉醇(PTX-EG-PEG)的体外药物释放曲线；
图6为本发明血影紫杉醇的表征实验结果图，其中图6中(A)图为红细胞(RBC)、空载血影(EG)、血影紫杉醇(PTX-EG)和PEG修饰的血影紫杉醇(PTX-EG-PEG)用50μg/mL FITC染色的荧光图和明场图，比例尺：2μm；图6中(B)图为RBC、EG、PTX-EG和PTX-EG-PEG用Annexin V FITC染色的荧光图，比例尺：2μm；图6中(C)图为RBC、EG、PTX-EG和PTX-EG-PEG的FITC绿色荧光强度统计柱状图，白柱：染色5min，黑柱：染色30min；图6中(D)图为RBC、EG、PTX-EG和PTX-EG-PEG的直径统计柱状图；图6中(E)图为RBC、EG、PTX-EG和PTX-EG-PEG的Annexin V FITC绿色荧光强度统计柱状图；数据用平均值±标准差表示(n＝3)。ns p＞0.05，***p＜0.001；
图7为本发明血影紫杉醇的细胞膜流动性检测结果图，其中图7中(A)图为红细胞(RBC)、空载血影(EG)、血影紫杉醇(PTX-EG)和PEG修饰的血影紫杉醇(PTX-EG-PEG)用10μMDiI染色并进行荧光漂白恢复的荧光图；红圈区域：0.03μm2细胞膜的荧光漂白区域；图7中(B)图为RBC、EG、PTX-EG和PTX-EG-PEG的荧光恢复曲线。数据用平均值±标准差表示(n＝3)；***p＜0.001；
图8为本发明血影紫杉醇的细胞膜硬度检测结果图，其中图8中(A)图为空载血影(EG)和PEG修饰的空载血影(EG-PEG)的AFM扫描图像；图8中(B)图为EG和EG-PEG的力-距离曲线；黑线：空载血影，红线：EG-EPG；图8中(C)EG和EG-PEG的杨氏模量统计柱状图；数据用平均值±标准差表示(n＝3)；***p＜0.001；
图9为本发明血影紫杉醇与小鼠腹腔巨噬细胞和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)共培养实验结果图，其中图9中(A)图为红细胞(RBC)、戊二醛固定的红细胞(GA-EG)、空载血影(EG)和PEG修饰的血影(EG-PEG)与小鼠腹腔巨噬细胞共培养4h的明场图片，比例尺：10μm；图9中(B)图为10μMDiI染色的RBC、GA-EG、EG和EG-PEG与HUVEC细胞共培养12h的Z-stack正交视图，比例尺：20μm；图9中(C)图为黏附和吞噬RBC、GA-EG、EG和EG-PEG的小鼠巨噬细胞比例统计柱状图；白柱：1h，黑柱：4h；图9中(D)图为吞噬RBC、GA-EG、EG和EG-PEG的HUVEC细胞比例统计柱状图；数据用平均值±标准差表示(n＝3)；***p＜0.001。
图10为本发明RGD修饰的血影提高HUVEC、HeLa和MCF-7细胞内吞效率的实验结果图；其中图10中(A)图为载FITC血影(FITC-EG-PEG)和RGD修饰的载FITC血影(FITX-EG-RGD)与HUVEC细胞共培养24h的Z-stack正交视图，比例尺：20μm；图10中(B)图为FITC-EG-PEG和FITX-EG-RGD与HeLa细胞共培养24h的Z-stack正交视图，比例尺：20μm；图10中(C)图为FITC-EG-PEG和FITX-EG-RGD与MCF-7细胞共培养24h的Z-stack正交视图，比例尺：20μm；图10中(D)图为吞噬FITC-EG-PEG和FITX-EG-RGD的HUVEC细胞比例统计柱状图；图10中(E)图为吞噬FITC-EG-PEG和FITX-EG-RGD的HeLa细胞比例统计柱状图；图10中(F)图为吞噬FITC-EG-PEG和FITX-EG-RGD的MCF-7细胞比例统计柱状图，Control：FITC-EG-PEG，RGD：FITC-EG-RGD，白柱：12h，黑柱：24h，灰柱：48h；数据用平均值±标准差表示(n＝3)，***p＜0.001。
图11为本发明血影紫杉醇对HUVEC、HeLa和MCF-7的体外细胞毒性，其中图11中(A)图为HUVEC、HeLa和MCF-7细胞与血影紫杉醇(PTX-EG-RGD)共培养24h和48h后进行Hoechst33342和PI/Annexin V FITC染色的荧光-明场图，比例尺：50μm；图11中(B)图：根据细胞核染色结果，皱缩核型细胞比例统计柱状图；图11中(C)图：根据PI/Annexin V FITC染色结果，PI染色细胞(红色)和Annexin V FITC染色细胞(绿色)比例统计柱状图，空心柱：PI染色细胞百分比，实心柱：Annexin V FITC染色细胞百分比；黑色：HUVEC细胞，红色：HeLa细胞，蓝色：MCF-7细胞。数据用平均值±标准差表示(n＝3)；ns p＞0.05，*p＜0.05，***p＜0.001。
具体实施方式
为使本发明的目的/技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1
血影紫杉醇的制备。每10μL戊二醛处理的红细胞(含3μL压积红细胞)与350μL3.5M DEN、25mg/mL PTX、1.7mM DSPE-PEG2K-MAL混合液孵育5min制备血影紫杉醇。
制备方法如图1所示：于一个2mL离心管里面加入600μL 0.03％戊二醛溶液和3μL压积红细胞，混匀，避光孵育15min；500×g离心5min，去除上清液后用500μL1×PBS重悬，重复此步骤3次；用1×PBS重悬红细胞到10μL体积，用1mL注射器抽取350μL 3.5M DEN、25mg/mL PTX、1.7mM DSPE-PEG2K-MAL混合液，往10μL红细胞中快速打入并快速吸打6次，避光静置孵育5min；1100×g离心5min，去除上清液，不重悬血影沉淀，按顺序用2M、1M、0.5M、0.5MDEN水溶液洗涤4次，每次2min，离心条件：1100×g，1min；用1×PBS洗涤4次，每次10min，离心条件：500×g，1min；用1×PBS重悬到100μL，转移到1.5mL棕色玻璃试剂瓶中，加入100μL3.4mM RGD溶液混匀，置于水平摇床(转速100rpm)避光孵育过夜(12-16h)；将溶液转移到2mL离心管中，500×g离心5min，去除上清液，用1×PBS洗涤3次，最后用1×PBS重悬到100μL，制得PEG和RGD修饰的血影紫杉醇。
制备得到的血影紫杉醇的大小为7.89μm左右，血影内部包被高浓度紫杉醇，且紫杉醇以晶体形式存在，血影表面修饰PEG和RGD，PEG修饰在血影膜表面产生空间位阻效应，防止巨噬细胞识别和吞噬，血影表面修饰的RGD可识别血管内皮和肿瘤细胞细胞膜表面过表达的整合素受体，促进细胞内吞血影紫杉醇，从而提高细胞毒性。
实施例2
血影紫杉醇的鉴定，包括XRD、FTIR和HPLC检测方法。XRD法：实施例1制得血影紫杉醇(PTX-EG)和对照组正常红细胞(RBC)、戊二醛固定的红细胞(GA-EG)和紫杉醇标准品粉末分别平铺到XRD检测专用载样金属板上；用Rigaku MiniFlex600 PXRD仪器检测晶体衍射峰图谱。检测条件：范围：2θ＝4-15°，速度：0.2°/min；通过仪器自带软件分析和确定样本图谱的晶体衍射峰，从而判断样本是否含有PTX晶体。
结果如图2中(A)所示晶体衍射峰图，紫杉醇标准品在2θ＝4.80°出现晶体衍射峰，PTX-EG在2θ＝5.04°出现晶体衍射峰，而另外两组阴性对照组样本(RBC及GA-EG)没有晶体衍射峰，说明紫杉醇在血影中存在结晶形式。但是血影紫杉醇组的特征峰较之紫杉醇标准品右移，且峰值较低。
FITR法：实施例1制得血影紫杉醇(PTX-EG)和对照组正常红细胞(RBC)、戊二醛固定的红细胞(GA-EG)和紫杉醇标准品用等体积无水乙醇重悬(取相等血影或细胞数量)，4℃避光抽提过夜；1100×g离心5min，取10μL萃取样本用于检测；制备溴化钾薄片，将不同样本萃取液滴加到薄片上，完全晾干后，上机检测(在4000-400cm-1范围内扫描)；通过仪器自带软件分析和确定样本红外光谱的各个峰对应的波长，对照紫杉醇标准品的红外光谱，从而判断其他3组样本是否含有紫杉醇。
结果如图2中(B)所示红外光谱图，紫杉醇标准品的红外光谱图含有一系列特征峰，包括3440.39cm-1(N-H伸缩振动特征峰)、2927.41cm-1(烯烃C-H伸缩振动特征峰)、1720.19cm-1(C＝O伸缩振动特征峰)、1635.34cm-1(C＝C伸缩振动特征峰)、1247.72cm-1(C-N伸缩振动特征峰)、1106.94cm-1(C-O伸缩振动特征峰)以及709.67cm-1(烷烃C-H伸缩振动特征峰)。PTX-EG样本具有同样的基团特征峰，其他两组阴性对照样本(RBC及GA-EG)不存在这些特征吸收峰，说明血影中确实包被了紫杉醇，紫杉醇化学结构和性质不发生改变。
HPLC法：PTX标准曲线样本制备：精密称取干燥至恒重的PTX标准样粉末，用无水乙醇配置成5、10、15、20、25μg/mL的标准溶液；DEN标准曲线样本制备：精密量取DEN标准样，用无水乙醇配置成10、50、100、500、1000、5000和10000μM的溶液；待测样本制备：将一定量的血影紫杉醇用无水乙醇重悬，4℃避光抽提过夜；1100×g离心5min，收集上清液，用0.22μmPVDF滤膜过滤，并转移到HPLC专用的1.5mL棕色玻璃上样瓶中；上机(Agilent 1100)检测。色谱条件：色谱柱：C18高效液相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈：水(v：v＝55：45)；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；检测波长：227nm(PTX)、263nm(DEN)；柱温：35℃。通过仪器自带软件分别确定PTX和DEN的洗脱峰和峰面积，再用EXCEL软件绘制标准曲线和计算样本中紫杉醇和二乙基烟酰胺的含量、负载量和包封率。
结果如图3和4所示，图3中(A)中紫杉醇标准品(10μg/mL)的洗脱峰出现在11.794min，图3中(B)中血影紫杉醇的洗脱峰出现在11.801min，说明血影紫杉醇中检测到的洗脱峰代表紫杉醇。如图4所示，以单个血影计算(单个血影体积为25fL，EG直径4.8μm)，紫杉醇含量为487.6pg，等同于紫杉醇浓度约为20g/L，比之水中PTX溶解度(＜1μg/mL)增加2万倍，比Taxol(6mg/mL)高3倍多，比Abraxane(5mg/mL)高4倍，且包封率达到80％。单个血影中DEN含量为34.7pmol，浓度为1.4mol/L，包封率为42.7％。
实施例3
血影紫杉醇的表征。检测EG的形态大小及渗漏情况(FITC染色法)。将实施例1制得血影紫杉醇。用50μg/mL FITC对红细胞(RBC)、戊二醛固定的红细胞(GA-EG)、血影(EG)和PEG修饰血影(EG-PEG)进行染色，避光孵育30min；用1×PBS洗涤3次，离心条件：1100×g离心1min；用1×PBS定容到100μL；将悬液滴加到共聚焦皿中，用激光扫描共聚焦显微镜LSM800进行观察，并用自带软件计算细胞内部的FITC荧光强度和血影的直径。
结果如图6中(A)所示，RBC、GA-EG、EG和EG-PEG的细胞形态相似，都呈中心下凹的圆饼状，但是直径不相同；如图6中(D)，RBC和GA-EG的直径分别是6.44和6.32μm，而EG和EG-PEG的直径分别为4.95μm和7.89μm。DEN处理红细胞后(EG组)直径变小，说明DEN处理后，细胞膜成分减少从而导致直径缩小。PEG修饰后血影直径变大，DSPE-PEG可以整合到细胞膜，导致血影直径增大。直径缩小可能提示了细胞膜中存在孔洞，为此，我们将血影与FITC荧光染料相孵育。如图6中(A)和图6中(C)所示，RBC和GA-EG这2组均无荧光，而DEN处理后的血影组有很强的绿色荧光信号。PEG修饰后，EG-PEG组的绿色荧光强度显著下降。
检测EG的PS外翻(Annexin V FITC染色法)。将同等细胞数量的RBC、GA-EG、EG和EG-PEG分别用1×Binding Buffer洗涤2次，并定容到100μL；加入5μL Annexin V FITC避光染色20min；用1×Binding Buffer洗涤2次并重悬到50μL；悬液滴加到共聚焦皿中，用激光扫描共聚焦显微镜LSM 800进行观察，并用自带软件计算细胞膜(Annexin V FITC)绿色荧光强度。
以上结果说明DEN处理后细胞膜磷脂层发生严重扰动，我们进一步确定细胞膜双磷脂层不对称性是否同样遭受破坏。Annexin V FITC染色及细胞膜荧光强度统计结果如图6中(B)和图6中(E)所示，RBC组无荧光信号，GA-EG组细胞膜有绿色荧光，细胞内部无荧光信号，说明GA处理后红细胞膜PS发生水平翻转。EG组不论细胞膜还是细胞内部均有很强的绿色荧光，说明DEN处理后，PS不仅发生翻转，产生孔洞还导致染料进入胞内。EG-PEG组结果虽与EG组相似，细胞膜和胞内均有荧光信号，但是较前者荧光强度显著下降，且膜部分的荧光甚至弱于GA-EG组。
实施例4
血影紫杉醇的RGD修饰，提高血管内皮和肿瘤细胞的内吞效率。每10μL戊二醛处理的红细胞(含3μL压积红细胞)与350μL 3.5M DEN、50μg/mL FITC、1.7mM DSPE-PEG2K-MAL混合液孵育5min制备PEG修饰的载FITC血影，与3.4mM RGD孵育过夜，制备RGD修饰的载FITC血影。
制备方法为：于一个2mL离心管里面加入600μL 0.03％戊二醛溶液和3μL压积红细胞，混匀，避光孵育15min；500×g离心5min，去除上清液后用500μL 1×PBS重悬，重复此步骤3次；用1×PBS重悬红细胞到10μL体积，用1mL注射器抽取350μL 3.5M DEN、50μg/mLFITC、1.7mM DSPE-PEG2K-MAL混合液，往10μL红细胞中快速打入并快速吸打6次，避光静置孵育5min；1100×g离心5min，去除上清液；用1×PBS洗涤3次，每次10min，离心条件：500×g，1min，最后用1×PBS重悬到100μL，制得PEG修饰的载FITC血影(FITC-EG-PEG)。
将100μL PEG修饰的载FITC血影转移到1.5mL棕色玻璃试剂瓶中，加入100μL3.4mM RGD溶液混匀，置于水平摇床(转速100rpm)避光孵育过夜(12-16h)；将溶液转移到2mL离心管中，500×g离心5min，去除上清液，用1×PBS洗涤3次，最后用1×PBS重悬到100μL，制得RGD修饰的载FITC血影(FITC-EG-RGD)。
提前一天将HUVEC、HeLa和MCF-7细胞分别铺板在96孔板中，50％细胞密度；12-16h后，往每孔细胞中加入2倍于细胞数量(即80000个)的FITC-EG-PEG或FITC-EG-RGD；细胞培养箱中培养2天，在不同时间点，将细胞消化下来，洗涤并重悬到50μL，滴加到共聚焦皿上，静置10min；用激光扫描共聚焦显微镜LSM 800对不同样本采用“Z-stack”模式拍摄3D图，从三维图像分析来判断RGD修饰的EG是否提高了细胞内吞效果。
实验结果如图10所示，在不同细胞系中，RGD修饰的血影内吞效率均显著高于无RGD修饰血影组，HUVEC、HeLa和MCF-7细胞内吞效率分别为60.4％、54.1％和44.2％，说明RGD修饰的血影具有靶向HeLa、MCF-7和HUVEC细胞的能力，提高细胞内吞血影效率。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (4)

1. 血影紫杉醇，其特征在于，血影包被浓度为10-20 g/L紫杉醇PTX；所述血影表面修饰PEG；所述血影表面修饰RGD多肽，所述紫杉醇为晶体状；所述血影直径为6-8 μm；
所述的血影紫杉醇的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备无菌压积红细胞；
（2）用戊二醛溶液重悬压积红细胞并避光孵育，并洗涤定容；
（3）将步骤（2）制得红细胞与二乙基烟酰胺DEN、PTX和DSPE-PEG2K-MAL混合液孵育制备表面修饰PEG的血影紫杉醇；
（4）将步骤（3）制得的血影紫杉醇与RGD避光孵育过夜，洗涤，制得表面修饰PEG和RGD的血影紫杉醇；
其中步骤（2）中每3 μL压积红细胞中加600 μL 0.03%戊二醛溶液；步骤（3）中每3 μL压积红细胞加入350 μL 3.5 M DEN、25 mg/mL PTX、1.7 mM DSPE-PEG2K-MAL混合液；步骤（4）中每3 μL压积红细胞加100 μL 3.4 mM RGD；
步骤（3）包括以下步骤：
（a）配制DEN， PTX， DSPE-PEG2K-MAL混合液，用注射器吸取；
（b）将步骤（a）所述混合液往步骤（2）红细胞中快速打入并快速吸打多次，避光孵育后制得含血影紫杉醇的混合液；
（c）将步骤（b）混合液离心处理，去除上清液；
（d）血影沉淀按照顺序用DEN水溶液梯度洗涤，洗涤多次后，离心处理；
（e）用1× PBS洗涤多次，离心处理；
（f）定容制得表面修饰PEG的血影紫杉醇。
2.一种根据权利要求1所述的血影紫杉醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备无菌压积红细胞；
（2）用戊二醛溶液重悬压积红细胞并避光孵育，并洗涤定容；
（3）将步骤（2）制得红细胞与DEN、PTX和DSPE-PEG2K-MAL混合液孵育制备表面修饰PEG的血影紫杉醇；
（4）将步骤（3）制得的血影紫杉醇与RGD避光孵育过夜，洗涤，制得表面修饰PEG和RGD的血影紫杉醇；
其中步骤（2）中每3 μL压积红细胞中加600 μL 0.03%戊二醛溶液；步骤（3）中每3 μL压积红细胞加入350 μL 3.5 M DEN、25 mg/mL PTX、1.7 mM DSPE-PEG2K-MAL混合液；步骤（4）中每3 μL压积红细胞加100 μL 3.4 mM RGD；
步骤（3）包括以下步骤：
（a）配制DEN， PTX， DSPE-PEG2K-MAL混合液，用注射器吸取；
（b）将步骤（a）所述混合液往步骤（2）红细胞中快速打入并快速吸打多次，避光孵育后制得含血影紫杉醇的混合液；
（c）将步骤（b）混合液离心处理，去除上清液；
（d）血影沉淀按照顺序用DEN水溶液梯度洗涤，洗涤多次后，离心处理；
（e）用1× PBS洗涤多次，离心处理；
（f）定容制得表面修饰PEG的血影紫杉醇。
3.一种包含权利要求1所述血影紫杉醇的制剂。
4.权利要求1所述血影紫杉醇在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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