CN105188673A - 包括化合物相互作用性结构域的制剂和载体系统 - Google Patents

Abstract

制备化合物的制剂的方法，包括确定包含至少一个与所述化合物相互作用的基团的化合物相互作用性试剂，通过将包含所述至少一个与所述化合物相互作用的基团的化合物相互作用性结构域缀合至至少一个亲水性结构域来制备载体试剂，并且将所述化合物与所述载体试剂结合以制备所述制剂。制备载体试剂还包括将所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合至至少一个疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

Description

包括化合物相互作用性结构域的制剂和载体系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请序列号61/736,100的权益，其公开内容通过引用并入本文。

政府利益

本发明是在国立卫生研究院给予的拨款号AI068021、GM067082、HL091828和GM085043的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定权利。

背景技术

提供下面的信息以帮助读者理解下面公开的技术和通常可以使用该技术的环境。本文使用的术语并不意欲被限制到任何特别窄的解释，除非在本文件中另外清楚地说明。本文提到的参考文献可以有助于理解其技术或背景。本文引用的全部参考文献的公开内容通过引用并入本文。

水溶性差是开发候选药物进入临床应用的主要障碍之一。大多数药物公司专注于可口服递送的药物。然而，不是所有的药物都是可口服生物利用的。生物利用度可以例如定义为到达例如体循环的未改变的药物的施用的剂量部分。一些化合物/药物可能在消化道降解，一些可能对上皮层太过有害，且在许多情况下，一旦吸收，游离药物在血液中的持续时间非常短。对于候选药物的这些问题中的任何一个或其组合可能导致药物开发的放弃或中断(作为制药工业中的惯例)。

因此，对于许多被施用/被身体吸收的药物试剂，无论它是通过口服、局部或全身途径，化合物的分散和/或溶解是必不可少的第一步。两性试剂(其具有亲水片段或头和疏水片段或尾)例如表面活性剂和各种基于脂质的制剂，例如胶束、乳剂、霜剂、脂质体、固体脂质纳米颗粒经常被用于低可溶性药物的制剂系统。基于脂质的制剂，例如脂质体、乳剂和胶束由于它们优异的安全性成为用于体内应用的引人注目的药物递送系统。水溶性聚合物、基于聚合物的水凝胶和聚合物-纳米颗粒也是可用于口服、局部或全身使用的药物递送系统。

目前，在临床环境中使用各种类型的脂质药物制剂用于治疗癌症和感染性疾病。目前用于确定脂质制剂的方法通过从现有的组分中选择适当的起始材料使用试错法。即使对于作为载体的合成分子的更复杂的工作，制剂仍然是根据经验的，并非基于机械的。

发明概述

一方面，制备化合物制剂的方法包括确定包含至少一个与所述化合物相互作用的基团的化合物相互作用性试剂，通过将至少一个包含所述至少一个与所述化合物相互作用的基团的化合物相互作用性结构域缀合或连接至至少一个亲水性结构域，并且将所述化合物与所述载体试剂结合以制备所述制剂。在多个实施方式中，制备所述载体试剂还包括将所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合或连接至至少一个疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

所述至少一个亲水性结构域可以例如包括至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性多聚物。术语“多聚物”通常是指高相对分子量的分子，其结构包括实际上或概念上源自低相对分子量的分子(单体)的重复单元。术语“低聚物”通常是指中间相对分子量的分子，其结构包括实际上或概念上源自较低相对分子量的分子(单体)的少量单元。通常，多聚物是具有>1且更通常>10个重复单元或单体单元的化合物，而低聚物是具有>1且<20，并且更通常地小于十个重复单元或单体单元的化合物。在多个实施方式中，所述亲水性低聚物或亲水性多聚物是聚环氧烷烃、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或多肽。在多个实施方式中，所述聚环氧烷烃是聚乙二醇。所述至少一个亲水性结构域可以例如包括至少一个离子基。在多个实施方式中，所述至少一个亲水性结构域包括至少一个羧酸基，至少一个胺基、至少一个糖基或至少一个聚糖基。

所述化合物相互作用性结构域可以例如包括至少一个氨基酸基团或至少一个肽基团。所述氨基酸基团或肽基团可以例如包括至少一个对化合物具有亲和力的侧基。在多个实施方式中，所述化合物相互作用性结构域包括芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹啉酮基、异喹啉酮基、或作为选自以下分子的残基的基团：化合物、化合物的一部分或整个化合物、(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘、1,1’-二-2-萘酚(BINOL)、喜树碱、喜树碱类似物(例如羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康和高喜树碱)，培美曲塞、多西他赛、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、长春花碱、长春地辛、依托泊苷、羟基喜树碱、米托蒽醌、它莫西芬、维甲酸、维生素A(例如视黄醇、视黄醛、视黄酸和维生素A类胡萝卜素例如β-胡萝卜素)、维生素E(例如生育酚和生育三烯酚)、维生素K(例如叶绿醌或甲基萘醌)、维生素D(例如开环甾体化合物诸如胆钙化醇或钙化醇)、姜黄素、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、索拉菲尼和硼替佐米，或其衍生物。在多个实施方式中，化合物相互作用性结构域包括至少一个芴甲氧羰基或其衍生物。

与所述化合物相互作用的所述至少一个基团可以例如对该化合物具有亲和力。与该化合物相互作用的所述至少一个基团可以例如通过π-π堆积、疏水性相互作用或氢键与化合物相互作用。

所述制剂可以例如形成复合物例如胶束、乳剂、霜剂、脂质体、球粒、固体脂质纳米颗粒、水凝胶或立方相脂质体凝胶。

所述至少一个疏水性结构域可以例如是至少一个脂质、至少一个生育酚(例如维生素E)、至少一个疏水性低聚物或至少一个疏水性多聚物。在多个实施方式中，所述至少一个疏水性结构域包括聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或其衍生物中的至少一个。在大量的实施方式中，所述至少一个疏水性结构域包括法呢基硫代水杨酸酯(FTS)基。在多个实施方式中，所述至少一个疏水性结构域包括至少一种脂质。

载体系统可以例如提供至少10％，至少20％，至少30％或甚至至少40％的载药量。通常，经由化合物相互作用性结构域增加载体系统的载荷能力。同样地，还可以增加稳定性。例如，本文中的两性载体系统的载荷能力大于仅包括疏水性结构域和本文的两性载体系统的亲水性结构域的两性分子。

在多个实施方式中，所述至少一个亲水性结构域具有至少1KDa(例如在大约1KDa至10KDa的范围内)的分子量，所述至少一个化合物相互作用性结构域具有大约300Da至2KDa范围内的分子量，并且所述至少一个疏水性结构域具有至少2KDa(例如在大约2KDa至20KDa的范围内)的分子量。在多个实施方式中，所述至少一个亲水性结构域具有大约1KDa至5KDa的范围内的分子量，并且所述至少一个疏水性结构域具有大约2KDa至5KDa的范围内的分子量。所述结构域可以例如包括单个或多个链。

在多个实施方式中，所述化合物是药物。药物是对机体具有效果(例如药物或治疗效果、兴奋效果、性能增强效果或其它效果)的生物活性物质。在多个实施方式中，所述化合物是JP4-039、紫杉醇、FK506、环孢菌素A、原卟啉、GW4064、孟加拉玫瑰红、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素、吲哚美辛、它莫西芬或多柔比星。在多个实施方式中，所述化合物是紫杉醇、所述亲水性结构域包括聚乙二醇且所述相互作用性结构域包括至少一个芴甲氧羰基或其衍生物。

在多个实施方式中，所述载体的所述至少一个化合物相互作用性结构域与所述至少一个亲水性结构域共价结合。在多个实施方式中，所述载体试剂的所述至少一个化合物相互作用性结构域与所述至少一个亲水性结构域共价结合且与所述至少一个疏水性结构域共价结合。

在另一方面，将所述化合物递送至患者的制剂包括所述化合物和包括所述至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的亲水性结构域的载体试剂。所述化合物相互作用性结构域包括所述至少一个与该化合物相互作用的基团。在多个实施方式中，所述载体试剂进一步包括所述至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

在另一方面，制备将所述化合物递送至患者的制剂的方法包括提供包括所述至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的亲水性结构域的载体试剂，其中所述化合物相互作用性结构域包括至少一个与该化合物相互作用的基团，和将该化合物与所述载体试剂结合。在多个实施方式中，所述载体试剂进一步包括所述至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

在另一方面，物质的组合物包括连接至至少一个选自芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹诺酮基、异喹诺酮基，和作为选自(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘、1,1'-二-2-萘酚(BINOL)、喜树碱、喜树碱类似物、培美曲塞、多西他赛、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、长春花碱、长春地辛、依托泊苷、羟基喜树碱、伊立替康、米托蒽醌、它莫西芬、维甲酸、维生素A、维生素E、维生素K、维生素D、姜黄素、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、索拉非尼和硼替佐米，或其衍生物的分子的残基的基团的亲水性多聚物。亲水性多聚物可以例如是聚环氧烷烃、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或多肽。在多个实施方式中，亲水性多聚物是聚环氧烷烃。亲水性多聚物可以例如是聚乙二醇。聚乙二醇可以例如具有至少1KDa的分子量。在多个实施方式中，聚乙二醇具有大约1KDa至10KDa范围内的分子量。至少一个基团可以例如通过至少一个氨基酸基团或至少一个肽基团连接至至少一个亲水性多聚物。

在多个实施方式中，至少一个基团选自芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹诺酮基、异喹诺酮基或其衍生物。在多个实施方式中，至少一个基团选自芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、或其衍生物。在多个实施方式中，至少一个基团选自芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、或咔唑基。在多个实施方式中，至少一个基团是芴甲氧羰基或其衍生物。组合物可以例如是聚乙二醇-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂。

在多个实施方式中，组合物进一步包括至少一个疏水性基团，其中至少一个基团位于疏水性基团和至少一个亲水性多聚物之间。所述至少一个疏水性基团可以例如包括至少脂质、聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽或其衍生物。在多个实施方式中，所述至少一个疏水性基团包含至少一个脂基。所述至少一个疏水性基团可以例如包括至少一个油酰基。

在进一步的方面，与所述化合物一起使用的载体试剂包括所述至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域(其包括至少一个与该化合物相互作用的基团)缀合的亲水性结构域。在多个实施方式中，所述载体试剂进一步包括与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的至少一个疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

在更进一步的方面，用所述化合物治疗患者的方法包括向患者递送包括所述化合物和包括所述至少一个化合物相互作用性结构域(包括至少一个与化合物相互作用的基团)的载体试剂的制剂。所述至少一个化合物相互作用性基团与所述至少一个亲水性结构域缀合。在多个实施方式中，所述载体试剂进一步包括与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的至少一个疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。可以通过上述方法形成制剂。

根据下面的详细说明并结合附图可以最好地领会和理解本发明的系统、方法和组合物以及其属性和伴随的优点。

附图简要说明

图1示出在JP4-039的溶解度研究中研究的各种氨基酸衍生物的结构(疏水性、基于肽-TEMPO-(2,2,6,6-四甲基哌啶基氧基)的稳定的氮氧化物自由基抗氧化剂)。

图2示出在本文的JP4-039的多个代表性研究中使用的PEG-脂质和PEG-脂肽缀合物的化学结构。

图3A示出脂肽-4-胶束的cryo-EM图像。

图3B示出脂肽和JP4-039-脂肽复合物的cryo-EM图像。

图3C示出用于脂肽胶束和药物-脂肽复合物的推荐的理想化模型。

图4示出通过PEG-脂肽4胶束促进的JP4-039的溶解的研究。

图5示出脂肽4单独(-◆-)时和脂肽4与JP4-039的重量比为100:2.5(-■-)和100:5(-▲-)时的荧光淬灭研究的结果。

图6示出表面活性剂-●-TritonX100,¨○¨吐温80,-▼-PEG₂₀₀₀-油酸酯,-Δ-脂肽5(PEG₂₀₀₀-α-Cbz-ε-油酰基赖氨酸)；-■-,脂肽1(PEG₂₀₀₀α-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸),-□-,脂肽2(PEG₂₀₀₀α-Fmoc-赖氨酰基-α-Fmoc-赖氨酰基-ε-二油酰基-赖氨酸),-◆-,脂肽3[PEG₂₀₀₀-赖氨酰基-(α，ε二-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸)₂,和-◇-,脂肽4PEG_5000-赖氨酰基-[赖氨酰基-(α，ε-二-Fmoc--油酰基赖氨酸)₂]₂对大鼠血红细胞溶血活性的比较。

图7示出助表面活性剂对于含有JP4-039的芝麻油-卵PC乳剂的胶体稳定性和载药量的影响，其中在从这些制剂中回收JP4-039之后测定芝麻油-卵PC乳剂(SOPC，其中20％PC被PEG-OA代替)、脂肽5、6和7在新鲜制备时(黑条)和第7天(浅灰条)的药物包封率，并且起始的％(深灰条)由这些数据计算(数据以平均值±SD(n＝3)表示)。

图8示出配制在针对小鼠的全身辐射的乳剂中的JP4-039的体内辐射缓减活性的研究，其中给小鼠腹腔注射单独的乳剂(实线圆)或配制在乳剂中的JP4-039(虚线圆，20mg/kg，辐射后24h)。

图9A示出由相对肿瘤体积的变化表示的配制在PEG_5k-Fmoc-FTS₂胶束中的多柔比星或DOX的增强的抗肿瘤活性。

图9B示出施用配制在PEG_5k-Fmoc-FTS₂胶束内的DOX后体重的变化。

图10A示出PEG₅₀₀₀-VE₂(PEG-VE₂)的合成，其中VE代表维生素E。

图10B示出PEG₅₀₀₀-Fmoc-VE₂(PEG-FVE₂)的合成。

图11示出配制在PEG-FVE₂胶束中的DOX在透析实验中表现出的慢的释放动力学研究。

图12示出在皮下注射的鼠乳腺癌模型(4T1.2)中，配制在PEG-FVE₂胶束中的DOX显示出优于游离DOX或(盐酸多柔比星脂质体注射剂来自JanssenBiotech,Inc.ofHorsham,Pennsylvania)的抗肿瘤活性(P<0.01(对比PEG-VE₂/DOX在10mg/kg)；P<0.001(对比DOXIL))。

图13示出PEG-Fmoc的合成路线和在载体-药物分子间π-π堆叠的基础上的自组装PEG-Fmoc/紫杉醇的理想化示意图。

图14A示出4T1.2小鼠乳腺癌细胞系的体外肿瘤细胞抑制。

图14B示出人前列腺癌细胞系PC-3的体外肿瘤细胞抑制。

图14C示出人前列腺癌细胞系DU145的体外肿瘤细胞抑制。

图15A示出三个剂量的PEG-Fmoc/PTX较之盐水和TAXOL(紫杉酚)的疗效的体内研究(在不同组中(n＝5)的携带4T1.2鼠乳腺癌移植物的小鼠)，其中肿瘤生长被绘制成随时间(起始注射之后的天数)的相对肿瘤体积。

图15B示出三种剂量的PEG-Fmoc/PTX较之盐水和TAXOL(紫杉酚)的疗效的体内研究(在不同组(n＝5)中携带4T1.2鼠乳腺癌移植物的小鼠)，其中显示了平均肿瘤重量(切除后测量)，并且使用盐水处理的小鼠作为对照计算肿瘤生长抑制率(IR)。

发明内容

如在本文的附图中普遍描述和阐明的那样，容易理解实施方式的组分可以在各种不同构型中布置和设计除了所描述的实例实施方式。因此，下面的实例实施方式的更为详细的说明，如附图所表示的，不意欲限定声称的实施方式的范围，仅仅是实例实施方式的代表。

贯穿本说明书的对于“一个实施方式”或“实施方式”(等)的引用意指所描述的与实施方式有关的具体特征、结构或特性包括在至少一个实施方式中。因此，短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”等在本说明书的不同地方的出现并不必然地都是指相同的实施方式。

而且，所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式合并在一个或多个实施方式中。在下面的说明中，提供众多具体的细节以给出对实施方式的全面理解。然而相关领域的技术人员会承认各种实施方式可以在没有一个或多个具体细节，或用其它方法、组分、材料等实施。在其它情况下，为了避免混淆，没有详细显示或描述众所周知的结构、材料或操作。

如本文和附带的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括了复数参照，除非上下文另外清楚地说明。因此，例如提到“一个相互作用片段”包括了多个这种相互作用片段和对本领域技术人员已知的其等价物等，而提到“所述相互作用片段”是指一个或多个这种相互作用片段和本领域技术人员已知的其等价物等。本文对数值范围的描述仅仅意欲作为分别针对落在范围内的每个单独的值的快捷方法。除非本文另外指出，每个单独的值以及中间范围被并入说明书，好像其在本文被分别描述。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序实施，除非本文另外指出或被本文明确禁止。

现存的基于脂质的制剂更适用于亲水性(例如脂质体制剂)或疏水性药物(例如脂质体、胶束和乳剂制剂)。然而，这些制剂通常不太适用于多种仅适度疏水或适度亲水的药物。疏水性较差的试剂与表面活性剂中和乳剂的油核心中的高度亲脂性脂族链的不充分混合可能导致低的载药量和制剂的不稳定性。最初与油核心混合的药物趋于缓慢地移动至乳剂颗粒的界面并最终与颗粒分离。具有中等疏水性或亲水性的药物还具有从脂质体制剂中渗漏的问题。

如果不是所有，大部分市场上可以得到的并用于制剂目的的两性或表面活性剂分子具有有限的或非常简单的界面结构域(如果根本就存在)。在大多数情况下，疏水性基团共价结合至亲水性基团，没有任何界面或中间区域。两性或表面活性剂分子的实例包括Triton-X100、吐温、PEG-烷基醚或酯、PEG-磷脂偶联物、SDS、油酸或其它脂肪酸、单-、二-或三-甘油酯、胆汁酸、磷脂、胆固醇衍生物和生育酚(维生素E)衍生物。通常，两性表面活性剂的界面区域(即亲水头和疏水尾之间的区域)在药物配制过程或实践中不被重视。然而，根据用于药物制剂的热动力原理，界面区域应当受到更多的重视。从这点上说，仅具有中等疏水性的低水溶性药物会存在对于基于脂质系统的稳定性问题，因为药物对于油核心而太过亲水，而对于水相太过疏水。经过一段时间，这种低相容性问题会导致药物由起始油核心向界面迁移。迁移会在界面区域停止，因为低水溶性药物不会迁移进入水相。在界面区域生成的增加的局部浓度会引起药物局部过饱和的情况，随后活性药物组分结晶/沉淀并最终离开制剂。由此在界面区域增加的局部浓度造成制剂的不稳定。这种机理解释了为什么许多传统的基于脂质的制剂对于表现出低水溶性但本质上仅是中等疏水性的化合物/药物存在低的载荷能力和不稳定性问题。

本文的系统、方法和组合物提供了减少或消除与传统两性制剂相关的制剂问题的困难的策略。在多个实施方式中，本文的合理设计的两性或表面活性分子(载体试剂)具有有效化合物、例如位于亲水性片段或结构域和疏水性片段或结构域之间的药物相互作用片段或药物相互作用性结构域(即，它们之间的界面区域)。相互作用片段或结构域起化合物/药物相互作用性结构域的作用(例如对于化合物/药物具有亲和力)并可以例如从小分子化合物库筛选。一旦被鉴定，药物相互作用基序、化合物或基团可能以模块形式被并入两性试剂或分子中以形成药物相互作用性结构域。例如，可以将这种结构域安装在脂质或疏水性锚与聚环氧烷烃(例如聚乙二醇或PEG)或其它亲水性基团(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或具有例如带电荷或亲水性残基的多肽)之间。具有位于水(亲水性)相和油(疏水性)相的界面的药物相互作用性结构域的整体结构具有表面活性。尽管可能适用于所有疏水性或亲水性化合物，这种设计容纳了具有中等疏水性或比之前制剂更好的亲水性的化合物。此外，具有含有足够数量的作为侧基的药物相互作用性结构域的支链或直链骨架构型的聚合物也可以与药物形成复合物。本文的试剂/分子对于具有多种结构的药物分子具有广泛的用途。在本文的多个实施方式中，没有疏水性片段、区域或结构域存在于本文的载体制剂中。从这点上说，一旦被鉴定，可以将药物相互作用性结构域并入或连接至亲水性基团。

通过载体-药物相互作用和时间依赖性分散方法，可以以例如脂质体、水凝胶、颗粒剂、丸剂和其它物理形式从药物-载体给药方案获得规定的药物释放。尽管本文的载体试剂主要与药物的代表性实例一起讨论，但是本文的载体试剂适于与其它化合物或分子一起使用。

在多个实施方式中，将两性试剂/分子的界面区域通过插入相互作用片段例如氨基酸或肽片段进行改性(例如扩大和/或延伸)。此外，可以并入表现出药物相互作用潜力的氨基酸上的侧基或其它残基。这种侧基可以例如能够进行π-π疏水性/芳环堆积或氢键相互作用以增强载体-药物相互作用，从而作为稳定药物制剂的一种方式。

化合物/药物相互作用片段、区或结构域(无论用于包括药物相互作用片段、区域或结构域和亲水性片段、区域或结构域的本文的两性试剂或试剂)可以例如通过例如各自基序(例如具有增加的水溶性的保护的氨基酸或保护的氨基酸的PEG-偶联物)的溶解度测试经实验测定。检测模式例如对于结晶形成的抑制/消失通过光密度(OD)读取、通过高压液相(HPLC)或用于低水溶性游离药物(其有助于在水溶液中形成纳米结构溶液)的可溶解部分任何其它合适的测量方法可以是可见的(例如在显微镜下)。适用于相互作用的其片段、区域或结构域的实例包括但不限于芴甲氧羰基(FMOC)、苄氧羰基(Cbz或Z)和作为小分子(例如充分水溶性的氨基酸衍生物)的一部分的异丁氧基氨基甲酸酯基。与相互作用的片段、区域或结构域相互作用的化合物或化合物的一部分也可以用于相互作用的片段、区域或结构域中。例如，化合物或其部分上的反应性基团(化合物/部分原有或通过改性在其上产生)可以用于与载体试剂中的化合物/部分的残基结合。较之未改性的固相支撑物，固定于固相支撑物上的基序还可以例如通过例如与待测试的具体试剂的结合或吸收用于鉴定方法。

基于具体试剂的已知结构特征(例如电荷性质、芳环结构、氢键潜能等)理论上可以例如额外地或选择地预测基序。例如可以预测萘基乙酰基并通过实验确定其活性与FMOC基团相同。

例如已经发现Fmoc基、其衍生物和本文的试剂中的类似基团(例如咔唑、喹诺酮、异喹诺酮、(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘和联萘酚)在将一组不同药物例如紫杉醇(PTX)、类固醇、基于氧杂蒽和卟啉的光动力试剂配制至在载药量和药物保留方面具有明显改进的疏水性肽药物中是有活性的。这些数据表明例如用作“制剂chemophor”的基团例如Fmoc在与各种药物试剂的相互作用中表现出潜在的活性以及因此表现出改进载体-药物相容性的能力。不受限于任何机理，相信这种相互作用的分子机制是Fmoc单元的紧密稠合的芳环结构与携带例如一个或多个芳环的药物(或其它化合物)分子之间的π-π堆叠相互作用(其通常强于范德华相互作用)的结果。

药物相互作用基序、基团或试剂可以作为相互作用的片段上(在界面区)的侧基(例如肽侧链或侧基)被并入例如基于脂质的表面活性剂中以形成具有三个不同的结构域的设计者的两性/表面活性分子：亲水性头基或片段(例如PEG)、延伸的中间片段或界面区(相互作用片段)和疏水性片段、尾区或锚区(例如脂质)。在界面区布置的基序构型可以例如是连续的或不连续的、直链的或支链的。脂质链的数量还可以从例如0至4或更多个变化。

因此，本文的载体试剂可以通过并入基于实验方法和/或理论预期选择的一个或多个药物相互作用基序而量身设计。再次，即使没有疏水性或脂质链的亲水性片段-药物相互作用性基序缀合物可以具有功效，因为它们依赖基序-基序相互作用的倾向可以形成例如胶束、可溶性复合物或形成载药水凝胶。水溶胶例如可以用作具有缓慢/延迟释放特征的局部应用。

如上所述，PEG链可用于本文的亲水性片段。PEG链可以例如被其它亲水性基团(包括例如具有亲水性的羧基或氨基或其它亲水性聚合物、糖等)取代。

本文的载体试剂/分子例如可以单独用于与作为包合复合物的药物形成胶束或可以例如用于混合的胶束，作为添加的共表面活性剂与其它脂质组分一起形成载药胶束、乳剂、霜剂、脂质体、球粒、固体脂质纳米颗粒、水凝胶、立方相脂质体凝胶等。通常，本文的两性或表面活性剂载体试剂用作用于化合物/药物的界面稳定剂以增强制剂稳定性并增加载药量。

本文的载体试剂还可以是通过与药物相互作用片段/基序的共聚作用或化合物改性制备的聚合物(包括疏水性-亲水性或亲水性重复单元)。在包括亲水性结构域和与药物相互作用性结构域连接或缀合的疏水性结构域的载体试剂的情况下，可以将药物相互作用片段/基序并入疏水性片段或亲水性和疏水性片段的边界处。例如，亲水性片段可以是但不限于PEG或富含亲水性残基或其亲水性衍生物的肽序列。疏水性片段可以例如包括至少一个聚甲基丙烯酰基、至少一个聚乙烯基、至少一个聚苯乙烯基、至少一个聚异丁烷基、至少一个聚酯基、至少一个多肽基或其任何衍生物。如上所述，药物相互作用基序可以例如是至少一个Fmoc基(例如氨基酸残基的侧基)。

本文的试剂可以例如是用于口服给药试剂的“药物分散剂”以例如增强在胃或肠液中的药物吸收和/或并增加残留时间。试剂还可以例如用于增加用于局部或粘膜应用的渗透率。而且，试剂还可以用作用于全身注射的胶体制剂试剂。

细胞表面分子特异性配体可以例如在末端位置被并入本文的亲水性片段(例如PEG)中以促进细胞摄取率或特异性。

在多个实施方式中，本文的自下而上的方法以选择药物相互作用性结构域开始，然后构建载体试剂(例如两性试剂、表面活性剂或聚合物)，并且进一步发展成例如制剂例如胶束制剂、乳剂制剂、脂质体制剂、水凝胶制剂、或用于特定药物的其它制剂。还可以使用含有药物/化合物相互作用功能的天然或合成分子并且将这些分子安装至表面活性剂内以生成具有例如亲水性、相互作用性和疏水性倾向的分子。这些基序可以与疏水性结构域/片段一起工作以与特定的试剂结合/溶解/关联。本文的设计原理可以扩展至使用例如脂质和聚合物系统用于改进体内药物递送的许多药物。在这一点上，本方法提供了用于配制中等疏水性或中等亲水性并且不能用传统制剂有效配制的各种治疗剂的广泛应用。

例如，如下表1的代表性实例中所示，用于其他疏水性以及亲水性试剂的多链PEG化的形成胶束的两性试剂或表面活性剂的功效已经被证实。疏水性且大体积分子的实例包括JP4-039(疏水性的基于肽-TEMPO-(2,2,6,6-四甲基哌啶基氧基-)的稳定的氮氧化物自由基抗氧化剂；紫杉醇(抗癌化疗剂)；他克莫司或FK506(免疫抑制剂)、环孢菌素A(免疫抑制剂)；伊红Y(用于光动力治疗的具有稠合芳环结构的试剂)、孟加拉玫瑰红(用于光动力治疗的具有稠合芳环结构的试剂)、原卟啉IX(用于光动力治疗的具有稠合芳环结构的试剂)；和表没食子儿茶酚没食子酸酯或ECGC(绿茶提取物，有效的亲水性抗氧化剂和已知的化疗敏化剂)。

例如，如下表2的代表性实例所示，用于其他疏水性试剂的单链PGE化的赖氨酰基-油酰基酰胺衍生物或没有疏水性/脂质链的PEG-肽缀合物的功效已经被证实。疏水性且大体积分子的实例包括吲哚美辛(非甾体抗炎药)；它莫西芬(用于激素受体阳性乳腺的内分泌(抗雌激素)治疗的雌激素受体的配体)；姜黄素(显示出抗肿瘤、抗氧化、抗关节炎、抗淀粉样蛋白、抗缺血和抗炎特性的草药化合物)。在甲氧基-PEG₅₅₀-α-Fmoc-赖氨酰基-ε-油酰基酰胺的情况下，胶束溶液很容易从药物-表面活性剂混合物以药物-表面活性剂1:20的重量比通过水合莱制备。由于药物-表面活性剂混合物看上去是油、糖浆或凝胶，这种混合物可以被包装在软胶囊或硬胶囊中，或以糖浆或在溶液中提供。对于甲氧基-PEG₁₀₀₀-α-Fmoc-赖氨酰基-ε-(α-Fmoc-ε-Boc赖氨酸)，水合之前药物-载体混合物看上去是固体状态。当水合吲哚美辛-载体复合物时，看上去是粘稠的脂质体凝胶状，这需要30分钟至1小时来达到完全水合的状态。缓慢的水合过程可能对于该试剂的缓慢且延时释放是有用的。一旦水合，用于它莫西芬和姜黄素的药物-载体复合物形成具有～1小时的稳定性的悬浮液。下面描述了负载在仅包括缀合至药物相互作用片段、区域或结构域的亲水性片段、区域或结构域的载体试剂上的紫杉醇PTX的其它代表性研究。

在对ECGC的研究中，发现尽管事实上ECGC在磷酸缓冲盐水或PBS中是非常易溶于水的化合物，它的多个芳环结构促进与PEG-Fmoc4-脂肽的相互作用并且生成在一定药物-载体比例内可溶的复合物，但是当药物与PEG-Fmoc4-脂肽的比例超过临界阈限时，其就会到溶液外面。该结果清楚的指出两个实体之间形成了复合物。而且，发现当在PBS中制备溶液之后暴露于空气中时，水溶液中的游离ECGC在24小时的时间很容易被氧化成黄色产物，但是ECGC-脂肽复合物在储存的一周期间阻止或减缓了氧化反应。以复合物的形式保护ECGC不被氧化的准确机理还是未知的。不束缚于任何机制，相信使药物处于不易获得溶解氧的相对疏水的环境中和来自含有UV-吸收Fmoc-基团的脂肽的屏蔽效应可能有助于减缓氧化过程。

疏水性试剂例如维生素E可以容易地并入从包含PEG-Fmoc-脂肽制备的胶束或乳剂中。就这一点而言，这些脂肽起常规表面活性剂的作用并促进疏水性试剂的溶解和配制过程。

表1

表2

如上所述，本文制剂的多个代表性实例包括用于疏水性氮氧化物自由基抗氧化剂JP4-039的乳剂和胶束制剂(参见例如图3C)。在JP4-039的情况下，从一组保护的氨基酸衍生物中鉴别药物相互作用性结构域。在这一点上，由于JP4-039在某种程度上具有的肽的特征，我们从氨基酸衍生物中寻找可以与JP4-039相互作用的结构元素。在代表性的研究中特别要注意赖氨酸，因为它具有可以简化后续的缀合操作的三正交保护的官能团。

由于该化合物的有限的水溶性和高结晶性，用盐水对JP4-039的醇溶液的稀释立即引发晶体的形成。我们用能够抑制水溶液中JP4-039结晶的不同的N-保护基鉴别了几个容易获得的氨基酸衍生物。显微镜研究表明一种赖氨酸衍生物以剂量依赖性方式有效地减小盐水中JP4-039晶体的粒径和数量，并最终以足够的数量完全消除JP4-039晶体的形成。在几个研究中，我们比较了在α-NH₂位上携带各种改性基团的一组ε-Boc-赖氨酸衍生物。基于在不同摩尔比的结晶抑制能力，发现具有最大体积的Fmoc的氨基酸是最有效的，然后是具有中等大小的异丁氧基羰基和苄氧羰基(Cbz)的氨基酸，而具有紧凑的t-Boc和最小的乙酰基的氨基酸的活性最小(表3)。图1阐明在表3中的JP4-039的溶解度研究中研究的不同氨基酸衍生物的结构。我们用甲氧基PEG₁₀₀₀代替α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酰基的游离羧基作为酯并发现其仍然保留了游离酸衍生物的全部能力(未显示)。在表3中，使用下面的命名：U-开始时可溶但是5分钟后不稳定；V-形成囊泡；I-不容；和S-可溶。

表3

摩尔比

5

10

20

30

40

50

Boc-Phe-OH

U

U

U

U

U

V

Cbz-Tyr-OH

V

U

U

U

U

V

Cbz-(Isb)-Lys-OH

V

V

V

V

V

V

Di-(tBoc)-Lys-OH

V

V

V

V

V

V

Cbz-β-Ala-OH

I

I

I

I

I

I

tBoc-(Cbz)-Lys-OH

I

I

I

I

I

S

Cbz-(tBoc)-Lys-OH

I

I

I

I

S

S

Di-(Cbz)-Lys-OH

I

I

S

S

S

S

Isb-(Cbz)-Lys-OH

I

S

S

S

S

S

Fmoc-(tBoc)-Lys-OH

S

S

S

S

S

S

Ace-(Cbz)-Lys-OH

I

I

I

I

I

S

CBz-(Ace)-Lys-OH

I

I

I

I

I

S

Benz-Phe-OH

I

U

U

U

U

S

在表3的代表性研究中的基团中，我们通过实验鉴别了Fmoc胺保护基是JP4-039的最有效的药物相互作用基团。α-Fmoc-ε-tBoc保护的赖氨酸是很容易得到的氨基酸衍生物，其广泛用于固相肽合成。而且，还表明携带这种基团的二肽可能具有固有的抗炎活性。

如图2所示合成在界面区携带不同数目的α-Fmoc或α-Cbz赖氨酸残基的七种PEG-脂肽和对照PEG-脂质缀合物。首先通过用α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸酯化单甲氧基PEG-OH来合成单链PEG-脂氨基酸衍生物1，然后是t-Boc基的去保护，然后用油酰氯封端。通过用α,ε-二油酰基赖氨酸封端单甲氧基PEG-α-Fmoc-赖氨酰基-α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸制备具有两个连续的α-Fmoc-赖氨酸残基的双链脂肽以获得PEG-脂肽2。通过封端携带两个或四个通过一个或三个赖氨酸桥与油酰氯连接的α-Fmoc-赖氨酰基的单甲氧基PEG-赖氨酸缀合物制备PEG-脂肽3和4。长链脂尾使得这些PEG衍生物在胶束中互相紧密结合，或用其他脂质组分连接至(anchorto)乳剂或脂质体制剂。类似地合成含有1-3个连续的α-Cbz-赖氨酰基的其他的单脂质链甲氧基-PEG-脂肽(PEG-脂肽5-7)。根据发表的方法通过将棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺与用光气活化的甲氧基-PEG_2,000反应合成甲氧基-PEG_2,000-氨基甲酰基-POPE(8)。

通过动态光散射方法对于在0.1MKHCO₃中制备的α-Fmoc-ε-tBoc-赖氨酸的粒径测量揭示大部分颗粒具有2-5nm之间的测量直径，这表明它们是胶束。所有的PEG脂质和脂肽缀合物容易在水中形成透明的分散体，其中由含有α-Fmoc-赖氨酰基单元的PEG-脂肽制备的悬浮液显示明显增加的粘度，表明相互之间自缠绕的细长的、蠕虫状胶束组装体(filomicelles)的存在。3.4-6.8μM的测量的临界胶束浓度(CMC)值在与报道的具有长脂族链的非离子表面活性剂相当的范围内(表4)。

表4

以1:1.5至1:15的药物-载体摩尔比含有各种数量的Fmoc和油酰基的甲氧基PEG脂肽衍生物能有效增溶盐水中的JP4-039。基于以形成可溶解的混合胶束所需的载体和药物之间最小的摩尔比，带有四-ε-Fmoc-赖氨酰基(4)的缀合物比含有两个Fmoc赖氨酰基的缀合物2和3更有效，而与含有单-Fmoc赖氨酰基的缀合物1形成的混合胶束是随时间不稳定的(表4)。

考虑到充足的载体-药物比，PEG-脂肽4有效地将稳定的制剂保存延长的时间期(>一个月)，期间没有注意到晶体形成的信号。用大约1.6:1的最小载体-药物摩尔比为脂肽4和固定量的JP4-039建立剂量依赖性增溶关系(参见图4)。相反，可比较的PEG-α-Cbz-赖氨酰基脂质缀合物在这些比例只能减缓JP4-039的结晶，但是未能形成稳定的含有JP4-039胶束的溶液(未显示)。形成缺少赖氨酰基结构域的PEG-脂质缀合物的对照胶束甲氧基-PEG_2,000-氨基甲酰基-POPE8在可比较的摩尔比是非活性的(未显示)。

Fmoc基含有能够提供强疏水性和与其它芳族部分(包括其自身)的π-π堆叠相互作用的大体积、稠合的芴甲基环结构。将环结构与赖氨酸连接的氨基甲酰基键还可以提供氢键能力。Fmoc促进了携带通常导致形成细长的纳米组装体的相同基团的单个短肽的平行的相互作用。实例包括形成相互连接的管状结构并变为水凝胶的含有Fmoc的短肽，和脂肽3(未显示)和4(参见图3A和3B)。不束缚于任何机制和模型，需要过量的α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸和含有α-Fmoc-赖氨酰基的脂肽缀合物来溶解JP4-039的事实表明涉及被几个含有Fmoc的化合物包围的一个JP4-039的模型通过药物-载体、和载体自身的氢键、亲水性和疏水性协作的相互作用的组合结合在一起(参见图3)。以约束方式在界面上具有四个Fmoc基且具有Fmoc基的高局部浓度的脂肽4要求载体-药物的最低摩尔比以实现完全的溶解(参见表4和图4)并提供研究组的最好表现。在图4的溶解研究中，将各种量的四链PEG_5,000-赖氨酰基-[赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸)₂]₂与JP4-039在CHCl₃中混合，然后蒸发溶剂，在盐水中通过水合制备载药胶束。从上清液中通过OD₄₄₈测量测定溶解的JP4-030的量。

Fmoc-JP4-039相互作用的上述模型通过我们的荧光淬灭研究来支持。在这一点上，为了证明在混合胶束中药物和载体分子相互之间物理相关，我们使用荧光淬灭实验研究了基团-基团相互作用。图5显示没有JP4-039(-◆-)以及脂肽4与JP4-039以重量比100:2.5(-■-)和100:5(-▲-)的源自脂肽4的Fmoc基团的固有荧光的荧光光谱(在300nm的激发波长)。当将JP4-039以1:4-5的药物/载体摩尔比添加时记录大规模的淬灭效应。当置于离5-TAMRA标记的短DNA近距离时，已知富电子的氮氧化物基团对于5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)是强荧光淬灭剂。因此我们的数据表明在脂肽4胶束中JP4-039离Fmoc基的距离近。我们还进行了2-D核磁共振(NMR)谱以进一步确定Fmoc和JP4-039之间的相互作用。结果表明在胶束组装体内JP4-039被Fmoc基包含并包围，其中它比分子的剩余部分离环结构更近。

在负载JP4-039的胶束中，Fmoc可能不是在载体-药物相互作用中涉及的唯一基团。Cryo-EM图像显示贯穿可见结构载药胶束具有明显的电子密集区域，而在空的管状胶束中，核心区域是电子稀疏(light)的，这表明JP4-039分子可以通过大量的再组织过程被并入含有界面和脂质部分的区域，或者，黑暗的外表仅是沿着位于界面的Fmoc基分布的JP4-039制备的相对稠密的壳的投影图像的结果。

我们还检查了由PEG-脂质和脂肽缀合物制备的纯胶束对大鼠血红细胞的溶血活性并将结果与两种广泛使用的乙氧基化的非离子表面活性剂：TritonX-100和吐温80比较。在图6的研究中，用指示浓度的表面活性剂将大鼠血红细胞(1％)在37℃孵育2小时。该孵育后，在发生全部溶血的情况下将上清液小心取出，在OD540nm测量，并基于OD值计算。如图6所示，当TritionX-100在5mM显示100％的溶血，对于吐温80和本工作中报道的所有PEG-脂质缀合物在该浓度或低于该浓度没有注意到明显的溶血(≤2％)。

在多个实施方式中，可以使用一种或多种助表面活性剂以稳定本文的载药乳剂。与作为用于JP4-039的单独的胶束制剂的含有α-Fmoc-赖氨酰基的脂肽相反，含有一至三个线性构型的α-Cbz-赖氨酰基的脂肽未能与JP4-039形成稳定的混合胶束(未显示)。然而，我们发现它们作为助表面活性剂起作用且稳定大豆磷脂酰胆碱-芝麻油乳剂制剂，而我们之前发现该制剂随着时间对于JP4-039具有差的保留性(参见图7)。在制备后的7天大约15-30％的药物从乳剂(有和没有聚乙二醇化)中分离。当20％摩尔的大豆磷脂酰胆碱被等量的含有α-Cbz-赖氨酰基的脂肽之一代替时，药物保留率明显改进。而且，添加的助表面活性剂还通过超声处理加快了乳剂的制备。当暴露于辐射致死剂量24小时后通过腹腔途径用单次注射向动物给药时，配制在改进的乳剂制剂中的JP4-039相对于对照组显示出明显的辐射保护效果和改进的动物存活(存活时间和总的存活率)(参见图8)，证实配制在这些制剂中的JP4-039在体内是药理活性的。图8阐明针对小鼠全身辐射的体内辐射缓减活性：在图8的研究中，所有小鼠用全身剂量的9.5Cy以0.8Gy/min剂量率辐射。将小鼠用单独乳剂(实线圆)或配制在乳剂中的JP4-039(虚线圆，20mg/kg，辐射24小时后)腹腔注射。追踪小鼠直至它们失去了20％的体重或出现濒死状，此时将它们处死。

上面描述的系统非常实用。在这一点上，氨基酸衍生物和PEG都容易以高纯度获得。涉及Fmoc和t-Boc保护/去保护和偶联的化学都进行了详细的研究，并且具有在界面区引入选择的基序的灵活性。采用高效的聚合物促进的液相合成方案来制备克数量级的聚乙二醇化的脂肽，而无需使用色谱纯化步骤。模块化设计允许生成一系列具有类似一般结构和自组装性质的化合物，而且具有在界面区改变基序的灵活性。最后，逐步的方法允许从药物相互作用性基团的鉴别、量身设计的表面活性剂的合成顺利地转至胶束、脂质体或基于乳剂的药物制剂系统。上面描述的与JP4-039有关的方法可以容易地扩展至用于改进除了JP4-039以外的治疗剂的体内递送的各种类型的新的脂质和聚合物系统的开发。

例如，表5阐明了药物相互作用性结构域的内含物(Fmoc)明显改进了紫杉醇或PTX的载药量和负载PTX的PEG₅₀₀₀-Fmoc-FTS₂和PEG₅₀₀₀-FTS胶束的稳定性，其中FTS是指法呢基硫代水杨酸酯基。

表5

同样，图9A和9B阐明了配制在PEG_5k-Fmoc-FTS₂胶束中的多柔比星或DOX的增强的抗肿瘤活性。图9A阐明了相对肿瘤体积的变化，而图9B阐明了施用后体重的变化。在图9A和9B的研究中，使用同源鼠乳腺癌模型(4T1.2)检查DOX的不同制剂的疗效。将小鼠随机分成八组(n＝5)且分别在第1、4和7天静脉施用PBS(对照)、DOX(5mgDOX/kg)、脂质体/DOX(5mgDOX/kg)、负载DOX的PEG_5K-Fmoc-FTS₂胶束(5、10mgDOX/kg)和负载DOX的PEG_5K-FTS₂(5mgDOX/kg)。用数字卡尺一周三次测量肿瘤大小。每三天测量来自不同组的所有小鼠的体重。

表6的数据表明包含药物相互作用性结构域Fmoc还明显改进了基于PEG-维生素E的胶束系统的DOX负载量。在表6中，使用下面的命名：PEG-VE₂-PEG-维生素E₂-PEG-FVE₂:PEG-Fmoc-维生素E₂；DLC–负载量；和DLE–负载率。

表6

图10A阐明了PEG₅₀₀₀-VE₂(PEG-VE₂)N的合成且图10B阐明了PEG₅₀₀₀-Fmoc-VE₂(PEG-FVE₂)的合成，其在下文所示的实验部分中进一步描述。如图11所述，如在透析实验中检查，配制在PEG-FVE₂胶束中的DOX表现出缓慢的释放动力学。图12阐明在腹腔鼠乳腺癌模型(4T1.2)中配制在PEG-FVE₂胶束中的DOX显示出优于游离DOX或DOXIL的抗肿瘤活性(P<0.01(相对于PEG-VE₂/DOX在10mg/kg)；P<0.001(相对于DOXIL))。

如上所述，在本文的多个实施方式中，没有疏水性片段、区域或结构域缀合至本文的载体试剂的药物-或化合物-相互作用性结构域。在这一点上，一旦被鉴别，可将药物/化合物相互作用性结构域并入、缀合或连接至亲水性基团。在多个代表性研究中，显示简单的、明确定义的且容易放大的载体PEG_5K-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂缀合物(PEG-Fmoc₂)为紫杉醇或PTX提供高载药量、优异的制剂稳定性和低全身毒性。在多个代表性实施方式中，将如上所述的9-芴甲氧羰基或Fmoc并入作为功能性构造块的载体以与药物/化合物分子相互作用。通过三步法合成路线合成PEG-Fmoc₂，且其很容易与PTX相互作用以形成小粒径(25-30nm)的纳米胶束。PTX的负载量是约36％。不束缚于任何机制，相信在生成的胶束系统中的PTX包封大部分通过Fmoc/PTXπ-π堆叠相互作用实现，其被荧光淬灭研究和¹³C-NMR证明。配制在PEG-Fmoc₂胶束中的PTX证实了持续释放动力学，且通过近红外荧光(NIRF)成像的体内分布研究证实Cy5.5标记的PTX对肿瘤位点的有效递送。发现PTX/PEG-Fmoc₂的最大耐受剂量(MTD>120mgPTX/kg)高于大多数报道的PTX制剂的最大耐受剂量，且体内治疗研究表现出比(临床上使用的来自Bristol-MyersSquibb公司的PTX制剂)明显改进的抗肿瘤活性。

在大量研究中，发现在配制大量疏水性试剂中含有Fmoc的PEG-脂质缀合物比不含脂质基序的对应物更有效。发现没有脂质基序的PEG-Fmoc缀合物PEG₅₀₀₀-lysyl-(α-Fmoc-ε-t-Boc-lysine)₂(PEG-Fmoc₂)对于增溶PTX是高效的。而且，在配制PTX中PEG-Fmoc₂比具有疏水性/脂质片段、区域或结构域(PEG₅₀₀₀-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-油酸-赖氨酸)₂(PEG-(Fmoc-OA)₂))的对应物明显更有效。

PEG-Fmoc₂通过如图13所描述的三个步骤可以容易地合成。在水溶液中PEG-Fmoc₂容易形成小粒径(25-30nm)的胶束。负染色EM显示了均匀分布的球形颗粒。这不同于PEG-(Fmoc-OA)₂，其在EM上显示管状形态，表明形成丝状胶束。已知PEG-OA₂形成球状胶束。总之，这些数据表明Fmoc和脂质基序都有助于PEG-(Fmoc-OA)₂的独特结构的形成。

PEG-Fmoc₂容易与PTX形成混合胶束并且如DLS所测定，负载PTX对于粒径具有最小的影响。颗粒的小粒径和均匀分布可通过负染色TEM进一步测定。¹H-NMR谱分析显示当其在CDCl₃中混合时可以清楚地检测到来自PEG-Fmoc₂和PTX的信号。相反，在重水中Fmoc和PTX的所有的质子信号被极大地抑制，表明在水溶液中自组装颗粒的核心区内的PTX的完全包封。PEG-Fmoc缀合物的CMC值仅为5.244μM,这对于当注射至血液腔大量稀释时保持令人满意的稳定性而言是足够低的。

与PEG-Fmoc-OA相比，在PEG-Fmoc中实现了明显增强的载体/PTX相容性。如表7中所证实，在水溶液中很容易形成稳定的PEG-Fmoc/PTX复合物，其中PTX负载量高达36％(w/w)，与其它制剂相比表现出令人瞩目的高PTX负载量。与含有脂质的表面活性剂PEG-Fmoc-OA(其最大PTX负载量达到15％，在溶液中有几个小时的稳定性)相比，PEG-Fmoc显示出明显改进的载药量和制剂稳定性。

表7

^aPDI，多分散指数。^bPTX浓度保持在1mg/mL，无药载体浓度为5mg/mL。

由于在临床实践中冻干对于长时间储存是必须的，所以研究了冷冻和冻干对于PEG-Fmoc/PTX复合物的影响。冻干后，获得的PEG-Fmoc/PTX白色粉末易溶于水中以在没有添加任何防冻剂时重组为透明溶液。在冻干和重组之后没有观察到粒径分布的重大变化。

作为制剂稳定性的重要指标，PTX从PEG-Fmoc/PTX的释放动力学通过透析方法评价，并且研究了TAXOL用于比较。PEG-Fmoc/PTX复合物在PH7.4的PBS中在37℃表现出持续释放特性。在第一个24小时后，只有19.3％的包封的PTX从PEG-Fmoc/PTX释放，而40.4％的PTX从TAXOL制剂释放。即使72小时后，只有23.5％的PTX从PEG-Fmoc/PTX释放。不束缚于任何机制，强的载体-药物相互作用允许本文的PEG-Fmoc/PTX在生理环境中表现为稳定的PTX制剂，这可有助于在血流中延长循环持续时间、通过被动靶向增强在肿瘤中累积的机会并减少由早期渗漏导致的细胞毒性药物的过早释放。

为了进一步探究PEG-Fmoc/PTX的体内命运，静脉注射之后使用近红外荧光(NIR)成像跟踪小鼠内PEG-Fmoc/PTX的生物分布。在该研究中，将Cy5.5(近红外荧光探针)缀合至PTX并与PEG-Fmoc形成复合物。将该复合物注射至携带CL-1人前列腺癌异种移植物的DCID小鼠内。在施用24小时后发现Cy5.5-PTX主要在肿瘤位点，而在主要器官没有明显的累积，且甚至96小时后在肿瘤位点还留有大量的信号。96小时后该研究完成后，将主要器官和肿瘤切除，并进行离体成像。在肺和肾仅检测到温和的荧光信号，且在肝和脾可检测到微弱的信号，显示通过网状内皮系统(RES)的复合物的清除率降低。然而，在肿瘤位点记录到Cy5.5-PTX的强荧光信号，其与被CremophorEL/乙醇溶解的游离Cy5.5-PTX的命运明显不同，其中在肾观察到主要的分布(表明快速消除)。不束缚于任何机制，PEG-Fmoc/PTX-Cy5.5在肿瘤组织的高效的且肿瘤选择性的累积可能归因于其小的粒径(小于30nm)，充分利用增强的渗透性和保留或EPR效应，且优异的体内稳定性有助于延长循环和增强用于被动靶向的机会。

然后为了评价其体内安全性情况，在无肿瘤小鼠中研究了PEG-Fmoc/PTX的最大耐受剂量(MTD)。TAXOL用作可商购的对照。在BALB/c小鼠中通过静脉注射，然后通过监测这些动物的体重和毒性迹象测试了五种不同剂量的PEG-Fmoc/PTX和三种剂量的TAXOL。如表8所示，TAXL在20mgPTX/kg的最大剂量是可耐受的，避免小鼠死亡，尽管注射之后立即在大多数小鼠中已经观察到几个异常的活动(例如惊厥和迟缓运动)。较之TAXOL，PEG-Fmoc/PTX展现出了改进的安全性情况。即使在高达120mgPTX/kg的剂量，比TAXOL的最大耐受剂量高6倍，在整个测试期间没有观察到小鼠死亡和明显的体重减轻。这种PEG-Fmoc/PTX的高MTD毫不逊色于大多数报道的PTX胶束制剂，并且与其高制剂稳定性、低释放情况和如上所述的在主要器官的低累积倾向一致(其可能为临床癌症治疗提供宽得多的PTX剂量窗口)。

表8

还调查了PEG-Fmoc/PTX体外和体内的肿瘤抑制功效。在小鼠转移性乳腺癌细胞系4T1.2和两种人前列腺癌细胞系PC-3和DU145中评价了PEG-Fmoc/PTX的体外细胞毒性。如图14A至14C中所示，在所有经处理的癌细胞系中，含有PTX的纳米颗粒展现出比TAXOL更强的细胞毒性，而载体本身在测试浓度下对细胞不显示明显的毒性。不束缚于任何机制，例如PEG-Fmoc/PTX的增加的细胞毒性可能归因于PTX容易进入肿瘤细胞。在该研究中，用PEG-Fmoc/PTX、无药PEG-Fmoc和TAXOL处理细胞系72小时，并且通过MTT实验确定肿瘤细胞的抑制(通过TAXOL和PEG-Fmoc/PTX处理的细胞之间的学生t检验测定*p<0.05或**p<0.01)。

在携带同源鼠乳腺癌模型(4T1.2)的小鼠中检查PEG-Fmoc/PTX的体内治疗功效。已知4T1.2是高转移性癌细胞系，并且如图15A所证实，在盐水处理的小鼠组中观察到了快速肿瘤生长。在TAXOL处理的小鼠中在10mgPTX/kg体重的剂量下获得了肿瘤体积的温和延迟的增加。与TAXOL相比较，在治疗期间PEG-Fmoc/PTX在相同的剂量下表现出更强的抗肿瘤活性(p<0.02)。由于证实了PEG-Fmoc/PTX的高MTD，为了更有效的治疗，提供了比TAXOL可能的剂量更高的剂量方案。因此，将PTX的增加的剂量20和40mg/kg并入本研究中。当PTX在PEG-Fmoc/PTX中的剂量升到20和40mg/kg(p<0.001)时，实现了进一步增强的肿瘤抑制，相对于盐水组导致60-70％的肿瘤生长抑制率(图15B)。已经证实以20-25mgPTX/kg的剂量单次注射TAXOL后发生了中毒和死亡的严重征象(signs)。然而，在包含连续6次注射远比TAXOL最大耐受剂量更高剂量的PTX的16天处理后没有观察到小鼠死亡。在20mg/kg处理组中没有观察到体重减轻，且在研究结束时在连续注射40mg/kgPTX(比TAXOL的MTD高2倍的剂量)后观察到轻微降低的体重(7-8％)。明显增强的肿瘤抑制功效和PEG-Fmoc/PTX的安全性与其生物物理性质和肿瘤选择性递送明确地一致。

本系统、方法和组合物提供了用于开发化合物/药物载体试剂或系统的基于机械的方法。如上所述，经典的基于脂质的药物载体系统依赖于现有的表面活性剂和油且通常涉及对于正确的起始材料的试错选择过程。负载量和制剂稳定性通常受限于在油孔或脂质双层中包封不好的疏水性差的药物。本方法在几个方面与传统的基于脂质的制剂根本上不同。本方法是自下而上的方法，其从选择能够与活性组分相互作用的简单的结构元素(基序或结构域)开始。然后将该化合物/药物相互作用性结构域与亲水性结构域组装或在亲水性结构域与疏水性结构域(例如在一个或多个疏水性脂质链和亲水性PEG刷)之间组装。至于本文的两性试剂，药物相互作用片段位于界面区，其允许在不那么严格的疏水性环境中并入例如非强疏水性药物。

实验部分

1.JP4-039研究

1(a).材料与方法。α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸、二-Boc-赖氨酸、DCC、NHS、TFA、TEA来自AAPPTEC；无水THF来自比利时Geel的AcrosOrganic；MW为1000、2000和5000的单甲氧基PEG、曙红Y、DMAP、茚三酮、油酰氯、芝麻油和其它未指定的试剂纯化合物来自密苏里SaintLouis的Sigma-Aldrich。1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和大豆磷脂酰胆碱(95％)购自北卡罗莱纳Morrisville的AvantiPolarLipids。JP4-039由AsymchemInc.通过已知的程序合成。

1(b).作为JP4-039结晶的增溶剂和抑制剂的保护的氨基酸衍生物的筛选。通过分别在5分钟期间内添加溶于5mLTHF中的过量4倍的乙酸酐或氯甲酸异丁酯由溶于5mL饱和碳酸氢钠溶液中的α-NH₂-ε-Boc-赖氨酸(1mmole)合成α-乙酰基-ε-Boc-赖氨酸、α-异丁氧基氨甲酰基-ε-Boc-赖氨酸。从反应混合物中去除THF，将剩余混合物用50mL乙酸乙酯稀释。有机相用20mL饱和NaHCO₃、盐水、柠檬酸(0.5M)和水顺序洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥，并且去除溶剂。将固体残留物从乙酸乙酯/己烷混合物中重结晶。这些衍生物与一组可商购的赖氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸的胺保护的衍生物一起制备成1-100mM的溶液或在0.1MN₂HPO₄缓冲液中的悬浮液。同时，将溶于5μL甲醇中的0.447μgJP4-039添加至96孔聚苯乙烯板的每一个孔中。将一百μL氨基酸溶液/悬浮液添加至甲醇溶液中并混匀。视觉检查每个孔中样品的物理状态，在2小时内定期出现棕色结晶外观。20分钟后在显微镜下给一些样品拍照。

1(c).PEG-氨基酸或肽脂缀合物的合成。单甲氧基PEG_2,000-α-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸(1)：将单甲氧基PEG_2,000OH(1mmol)与α-Fmoc-ε-t-Boc赖氨酸(2mmol)、DCC(2.2mmol)和DMAP(0.1mmol)在CH₂Cl₂中室温下酯化过夜。通过过滤去除固体沉淀。通过蒸发浓缩滤液。PEG衍生物用10倍体积冷乙醚沉淀，并用相同溶剂洗涤三次。再用冷乙醇洗涤以去除DMAP。将PEG-α-Fmoc-ε-t-Boc赖氨酸酯溶于4mLCH₂Cl₂中，向其中添加4mLTFA，以在室温下去保护Boc基20分钟。去除大部分CH₂Cl₂后，用冷醚沉淀PEG-α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸酯并用相同溶剂再洗涤两次。用油酰氯(2mmol)和TEA(2mmol)封端PEG-α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸酯20分钟。用醚沉淀法纯化PEG-α-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸酯(1)三次，并用乙醇沉淀两次。以PEG_2,000计收率为87％。¹HNMR(400MHz)δ7.69-7.19(m,8H),5.23-5.22(m,2H),5.08(s,2H),4.98-4.95(m,2H),4.12-4.10(m,1H),3.56-3.52(PEG峰),3.26(s,3H),3.21-3.17(m,2H),2.09-1.88(m,6H),1.27-1.16(m,28H),0.77(t,3H)。

单甲氧基PEG_1,000-α-Fmoc-赖氨酰基-α-Fmoc-ε-(二油酰基赖氨酰基)赖氨酸(2)：将PEG-α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸酯(1mmol)与4mmolTEA、α-Fmoc-ε-t-Boc赖氨酸(1.5mmol)、DCC(1.7mmol)和NHS(1.5mmol)在CH₂Cl₂:THF(1:1)中在0℃下反应20分钟，然后在室温下反应过夜。通过用茚三酮测试的阴性结果来确定反应完成。用冷醚和乙醇沉淀法纯化单甲氧基PEG_1,000-α-Fmoc-赖氨酰基-α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸酯，TFA去保护，然后醚沉淀和洗涤得到PEG_1,000-α-Fmoc-赖氨酰基-α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸酯。该ε-NH₂-端PEG_1,000-赖氨酸衍生物用4mmolTEA、用DCC(1.7mmol)和NHS(1.5mmol)预活化的N,N’-二油酰基赖氨酸(1.5mmol)封端过夜。生成的2用类似于醚和醇沉淀法纯化。以甲氧基PEG_1,000计2的收率大约为75％。¹HNMRδ7.70-7.20(m,24H),5.35-5.34(m,2H),5.14-5.09(m,6H),4.27-4.22(m,2H),3.70-3.61(PEG峰),3.39(s,3H),3.21-3.07(m,6H),2.01-1.97(m,6H),1.49-1.23(m,40H),0.89(t,3H)。

单甲氧基PEG_2,000-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-油酰基赖氨酸)₂(3)：将甲氧基PEG_2,000-OH(1mmol)与二-t-Boc赖氨酸(2mmol)、DCC(2.2mmol)和DMAP(0.1mmol)在CH₂Cl₂中酯化过夜，然后用类似醚和乙醇沉淀步骤生成单甲氧基PEG-二-Boc-赖氨酸酯。TFA去保护和醚沉淀并洗涤后，将PEG-赖氨酸酯与4mmolTEA、α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸(3mmol)、DCC(3.5mmol)和NHS(3mmol)在CH₂Cl₂:THF(1:1)中在0℃下缀合20分钟，然后在室温缀合过夜。通过根据茚三酮测试的阴性确定反应的完成。通过冷醚和乙醇沉淀法纯化单甲氧基PEG-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂，TFA去保护，然后通过醚沉淀和洗涤以得到PEG-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸)₂。该ε-NH₂-赖氨酰基端PEG衍生物用4mmolTEA和4mmol油酰氯封端20分钟。在常规的醚和乙醇沉淀和洗涤之后，以72％的收率获得纯化的3。¹HNMRδ7.36-7.34(m,16H),5.35-5.30(m,4H),5.14-5.09(m,4H),4.27-4.22(m,6H),3.70-3.61(PEG峰),3.41(s,3H),3.21-3.07(m,6H),2.01-1.97(m,6H),1.49-1.23(m,62H),0.89(t,6H)。

单甲氧基PEG_5,000-赖氨酰基-[赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-油酰氯赖氨酸)₂]₂(4)：将衍生自甲氧基PEG_5,000的PEG-赖氨酸酯(1mmol)与二-t-Boc赖氨酸(3mmol)、DCC(3.5mmol)和NHS(3mmol)在CH₂Cl₂:THF1:1中在0℃下缀合20分钟，然后在室温缀合过夜。通过茚三酮测试确定反应完成。通过冷醚和乙醇沉淀法纯化单甲氧基PEG_5,000-赖氨酰基-(二-t-Boc-赖氨酸)₂。TFA去保护，然后通过醚沉淀和洗涤生成PEG-赖氨酰基-(α-NH₂-ε-NH₂-赖氨酸)₂。将该四ε-NH₂端PEG-赖氨酸衍生物与α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸(5mmol)、DCC(6mmol)和NHS(5mmol)在CH₂Cl₂:THF1:1中在0℃缀合20分钟，然后在室温缀合过夜。通过茚三酮测试的阴性确定反应完成。通过冷醚和乙醇沉淀法纯化单甲氧基PEG_5,000-赖氨酰基-[赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc赖氨酸)₂]₂，TFA去保护，然后醚沉淀和洗涤得到PEG-赖氨酰基-[赖氨酰基(α-Fmoc-ε-NH₂-赖氨酸)₂]₂。最后，用油酰氯(8mmol)、TEA(10mmol)封端20分钟，然后醚和乙醇沉淀和洗涤得到79％收率的4。¹HNMRδ7.36-7.34(m,32H),5.35-5.27(m,8H),5.14-5.09(m,7H),4.27-4.22(m,6H),3.70-3.61(PEG峰),3.41(s,3H),3.21-3.07(m,9H),2.01-1.97(m,9H),1.49-1.23(m,130H),0.89(t,6H).

甲氧基PEG_2,000-α-Cbz-ε-油酰基赖氨酸(5)、PEG2,000-α-Cbz-赖氨酰基-α-Cbz-ε-油酰基赖氨酸(6)、甲氧基PEG_2,000-α-Cbz-赖氨酰基-α-Cbz-赖氨酰基-α-Cbz-赖氨酰基-ε-油酰基赖氨酸(7)和甲氧基PEG_2,000-氨基甲酰基-1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(PEG-POPE)(8)。将三种具有不同数目α-Cbz-赖氨酸残基和单油酰基链的PEG-赖氨酰基-脂质缀合物类似于1地合成并纯化，除了使用α-Cbz-ε-Boc-赖氨酸代替α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸用于1至3个重复周期。将对照表面活性剂PEG₂₀₀₀-油酸酯通过将甲氧基PEG_2,000与油酰氯和TEA反应来制备；且PEG-磷脂缀合物通过将被光气活化的甲氧基PEG_2,000与POPE和TEA反应，然后醚沉淀来合成。

脂肽5的¹HNMR:¹HNMRδ7.29-7.19(m,5H),5.23-5.22(m,2H),4.98-4.95(m,2H),4.12-4.10(m,1H),3.56-3.52(PEG峰),3.26(s,3H),3.21-3.17(m,2H),2.09-1.88(m,6H),1.27-1.16(m,28H),0.77(t,3H)。

脂肽6的¹HNMR:¹HNMRδ7.37-7.29(m,10H),5.37-5.35(m,2H),5.12-5.09(m,4H),4.25-4.22(m,2H),3.70-3.64(PEG峰),3.40(s,3H),3.21-3.17(m,4H),2.03-1.89(m,6H),1.40-1.24(m,34H),0.90(t,3H)。

脂肽7的¹HNMR:¹HNMRδ7.36-7.34(m,15H),5.35-5.34(m,2H),5.14-5.09(m,6H),4.27-4.22(m,2H),3.70-3.61(PEG峰),3.39(s,3H),3.21-3.07(m,6H),2.01-1.97(m,6H),1.49-1.23(m,40H),0.89(t,3H)。

化合物8PEG-POPE的¹HNMR:¹HNMRδ5.35-5.34(m,2H),3.69-3.64(PEG峰),3.92-3.96(m,4H),3.57-3.55(m,2H),3.39(s,3H),2.29-2.28(m,2H),1.37-1.27(m,50H),0.89(t,3H)。

1(d).临界胶束浓度(CMC).当并入胶束核心的更疏水性的微环境时，基于伊红-Y的最大吸收的红移测定CMC。将伊红Y溶液添加至在蒸馏水中制备的一系列表面活性剂溶液至1mM的最终浓度且在室温下孵育30分钟。测量OD_542nm并对表面活性剂浓度绘图，从中可以估计CMC的值。

1(e).含或不含JP4-039的胶束制剂的制备。通常通过氨基酸衍生物或脂肽的干燥薄膜与具有恒定涡流的合适的水溶液水合制备胶束，直至形成透明溶液。最终浓度大约是100-200mg/mL。首先将脂肽、氨基酸衍生物或氮氧化物化合物溶于氯仿中。将溶液等分至玻璃测试管中，混匀，然后用恒定氮气流吹扫以去除大部分溶剂。通过应用2小时高真空去除残留的溶剂。为了测定JP4-039的胶束促进的增溶作用，使用表面活性剂与药物的各种摩尔比来在水中制备表面活性剂-药物混合物(JP4-039的最终浓度是5mg/mL)。至少30分钟后，将样品以13000rpm短暂离心。回收一半的上清液，向其中添加等体积的乙醇以溶解/破坏胶束药物复合物。使用OD_448nm定量样品中的药物量。

1(f).粒径测量。为了评估胶束颗粒的水力粒径，在蒸馏水中从干燥膜制备表面活性剂溶液(含或不含并入的药物)。在蒸馏水中将样品再稀释十倍且使用粒径仪(ZetasizerNanoZS仪器,来自MalvernInstrumentsLtdofWorcestershire,英国)由激光动态光散射测量粒径。在盐水中稀释100倍后使用CoulterN4粒径仪进行乳剂颗粒的粒径测量。

1(g).脂肽4胶束和脂肽4-JP4-039复合物的Cryo-EM。通过水合最终浓度为100mg/mL的蒸馏水中的干燥脂肽膜来制备胶束。检查的样品是单独的脂肽4(A)和以1.6:1的摩尔比制备的脂肽4-JP4-039复合物(B)。将在蒸馏水中稀释5倍的4μL样品立刻用于带孔的Quantifoil网格(来自QuantifoilMicroToolsofJena,Germany)，用滤纸涂布并使用FEIVitrobot^TMMarkIII(来自FEIofHillsboro,Oregon)在液体乙烷中快速冷冻。在4Kx4KGatanCCD相机(来自Gatan,Inc.ofWarrendale,Pennsylvania)上采集低剂量投影图像,该相机具有FEITecnaiTF20电子显微镜(标称29000至50000的放大率和1.0至2.5μm的弱焦点值)。

使用GatanDigitalMicrograph软件(来自Gatan,Inc.ofWarrendale,Pennsylvania)中的密度图工具测量脂肽4管状胶束的直径(算作～100)和条形JP4-039-脂肽4混合胶束的长度(算作～240)。

用于选择的脂肽的冷冻电子显微镜(cryo-EM)图像证实在20mg/mL的3(未显示)和4(图3A和3B)中存在具有长管形状的自组装结构。管状结构具有厚度为208-4.0nm(3.5±0.4nm,n＝22)的电子-光中心区，可能是由脂质链组成的胶束核心。光核心被高电子致密的外围壁包围，可能是含有Fmoc-赖氨酸的界面区域。从高致密壁的中间点之间的距离测量管状结构的平均直径是～5.6±0.4nm。高电子致密区域的厚度是电子-光中心区域厚度的～1/3至1/2。PEG链的电子致密不足以用cryo-EM显示。显示在脂质体表面上的报道的脂质锚定的PEG_5,000-PE缀合物的厚度是10-15nm。假设该参数应用于这些管状PEG-脂肽胶束，包括PEG层的总直径会在27-40nm的范围内。

负载JP4-039的胶束显示出明显减少的粘度。用激光动态光散射方法测量的负载JP4-039的PEG-脂肽4的粒径也小于空胶束(表4)。当JP4-039存在时，cryo-EM图像显示出许多小圆点(～90％,n＝388,图3B)和截短的条状结构(～10％)的混合物。小圆点和条的直径略小于在单独脂肽样品中观察到的管状胶束的直径。条结构的长度在～30至300nm之间变化，平均长度在60nm以下。在cryo-EM上的负载JP4-039的胶束的粒径分布与由激光动态光散射获得的结果一致。没有游离药物的晶体的迹象(参见图3B)。

1(h).荧光淬灭研究。用含有0、0.25或0.5mgJP4-039的10mg脂肽4通过在300μl盐水中水合的方法制备含有或不含有JP4-039的胶束制剂。使用300nm的激发波长和从350mn至500nm的不同的发射波长在SynergyH1Hybrid读取器(来自BioTekofWinooski,Vermont)上记录荧光强度。

1(i).胶束制剂的¹HNMR谱。在含有100mMNaCl(对于脂肽4)或100mMKHCO₃(对于α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸)的D₂O中，从脂肽4或α-Fmoc-ε-tBoc-赖氨酸(含有或不含有JP4-039或4-乙酰胺-TEMPO)制备胶束。使用Bruker400MHzNMR(来自BrukerCorporationofBillerica,Massachusetts)记录¹HNMR谱并且使用20秒的循环脉冲延迟以确保精确的质子积分。对于起初的实验，d-DMSO用作可选溶剂。

1(j).溶血试验。通过用10倍体积的冷PBS洗涤三次(1500rpm10分钟)从添加有抗凝剂的新鲜收集的大鼠血液中分离大鼠红细胞(RBC)。然后将RBC用冰冷的DPBS稀释至2％w/v并立即用于溶血试验。分别用不同浓度(0-5mM)的PEG-脂肽、吐温80和TritonX-100处理一毫升稀释的RBC悬浮液，然后在孵育箱摇床上在37℃孵育2h。4℃下以1500rpm离心样品10分钟，并且将来自每个样品的100μL的上层清液转移至96孔板。通过使用微板读取器在540nm的吸收度测定血红蛋白的释放。分别用TritonX-100和DPBS处理的RBC被认为是阳性或阴性对照。将血红蛋白释放计算为(OD_样品-OD_阴性对照)/(OD_阳性对照-OD_{阴性 对照})×100％。

1(k).JP4-039的乳剂制剂和稳定性。将JP4-039(4mg)配制在由芝麻油(100mg)和大豆磷脂酰胆碱(50mg)组成；或由芝麻油(100mg/mL)、大豆磷脂酰胆碱(40mg)与共表面活性剂PEG_2,000-油酸酯(29.6mg/mL,0.0128μmole)、PEG_2,000-α-CBz-ε-油酰基赖氨酸(32.5mg/mL,0.0128μmole)、PEG_2,000-α-CBz-α-CBz-ε-油酰基赖氨酸(35.9mg/mL,0.0128μmole)或PEG_2,000-α-CBz-赖氨酰基-α-CBz-赖氨酰基-α-CBz-ε-油酰基赖氨酸(39.3mg/mL,0.0128μmole)一起组成的乳剂中。将所有组分溶于氯仿中，混匀，并然后再N₂气流下去除溶剂，然后真空干燥2小时。将油性残余物悬浮于盐水中，在N₂气流下用具有20mW的最大输出的探头超声波仪在冰浴下超声60分钟，直至粒径减小至低于150-250nm。通过激光动态光散射法(CoulterN4particlesizer)评估初始粒径。在低速离心以去除样品中的任何沉淀之后测定新鲜制备的制剂和那些在4℃储存7天的制剂的载药率。在涡流下用等体积的氯仿萃取有机组分三次。将有机相合并并在氮气流下去除溶剂。使用氯仿将剩余物重组为1ml。使用OD_448nm读取器测定药物的含量。

1(l).针对小鼠全身辐射的辐射缓减活性。用由a¹³⁷CsJ.L.ShepherdMark1辐照器(来自J.L.Shepherd&AssociatesofSanFernando,California)以剂量速率0.8Gy/min递送的9.5Gy的全身剂量辐射所有小鼠。然后将小鼠分成2组(每组10-15只小鼠)。辐射24小时后用配制在乳剂中的JP4-039或仅用对照制剂腹腔注射这些小鼠。JP4-039的剂量是20mg/kg。跟踪小鼠直至它们减少20％的体重或出现濒死，此时将它们处死。

2.紫杉醇研究

2(a).配制于两性试剂中的PTX

2(a)(i).材料：紫杉醇(98％)购自AKScientificInc.(UnionCity,California)。琥珀酸酐、三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)、9-芴甲氧羰基氯化物(Fmoc-Cl)、对甲基苯磺酸(TsOH)和Fmoc-赖氨酸(Boc)-OH均购自Sigma-Aldrich(SaintLouis,Missouri)。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二酰亚胺(DCC)购自AlfaAesar(WardHill,Massachusetts)。4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)购自Calbiochem-NovabiochemCorporation(SanDiego,California)。根据发表的文献合成并纯化FTS。

2(a)(ii).PEG_5K-FTS₂和PEG_5K-Fmoc-FTS₂的合成：通过分子量为5000Da的MeO-PEG-OH的溶液缩合反应合成PEG_5K-Fmoc-FTS₂。使用DMAP(5当量)在二氯甲烷(CH₂Cl₂)中将琥珀酸酐(5当量)偶联至PEG的O端上过夜。通过添加冷醚沉淀出PEG化的分子并用醚洗涤两次。通过使用NHS(3当量)和DCC(3当量)作为偶联试剂在CH₂Cl₂中偶联Tris一天。通过添加冷醚沉淀PEG化的分子并用醚洗涤两次。使用丙酮中的TsOH作为催化剂缩丙酮化。使用Fmoc-Cl(2当量)和NEt₃(3当量)在CH₂Cl₂中偶联Fmoc基过夜。通过添加冷醚沉淀PEG化的分子并用醚洗涤两次。通过用CH₂Cl₂中的1％TsOH处理去除缩丙酮基团。使用DCC(4当量)和DMAP(0.4当量)作为偶联试剂偶联FTS(4当量)。通过添加冷醚沉淀PEG化的分子并用醚洗涤两次。将该分子冻干以生成白色粉末。

2(a)(iii).负载PTX的胶束的制备和表征:将PTX(氯仿中10mM)和PEG_5K-Fmoc-FTS₂缀合物(氯仿中10mM)以不同的载体/药物比例混合。通过氮气流去除有机溶剂以形成药物/载体混合物的薄膜。真空下干燥薄膜1小时以去除剩余溶剂。添加DPBS以水合薄膜并形成载药胶束。通过用针式过滤器(孔径：200μm)过滤去除未并入的PTX(沉淀)。不含药物的胶束和PTX溶解的PEG_5K-FTS₂胶束如上所述的类似地制备。

通过Zetasizer(DLS)(ZetasizerNanoZSinstrument,Malvern,Worcestershire,UnitedKingdom)测量胶束的粒径。胶束的浓度保持在1mg/mL。

通过高效液相(HPLC)(Alliance2695-2998系统)定量载药率。使用反相柱100RP-18(5μm)且移动相由甲醇/水(80:20v/v)组成。LICHROSPHER是购自MerckMiliporeofDarmstad,Germany的色谱吸收剂。用MeOH(胶束溶液/MeOH＝1/9，v/v)稀释负载PTX的胶束以解离载药胶束。将流速设置为0.8mL/min且用UV/vis检测器在227nm检测柱流出物。根据下面的方程式计算载药量(DLC)和载药率(DLE)：

DLC(％)＝[使用药物的重量/(聚合物+使用药物的重量)]×100％

DLE(％)＝(负载药物的重量/投入药物的重量)×100％

我们跟踪游离药物和负载PTX的胶束的大小变化。稳定性表明在跟踪期间没有明显的大小变化。

2(b).配制于亲水性试剂中的PTX

2(b)(i).材料.紫杉醇(PTX,98％)购自AKScientificInc.(UnionCity,California)。α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸、二-Boc-赖氨酸、N,N'-二环己基碳二酰亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、三氟乙酸(TFA)和三乙胺(TEA)从AcrosOrganic(Geel,BelgiumandNewJersey,USA)获得。单甲氧基PEG₅₀₀₀,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、茚三酮和其它未指明的化合物都购自Sigma-Aldrich(SaintLouis,NewJersey)。Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、100X青霉素-链霉素溶液都购自Invitrogen(ofGrandIsland,NewYour)。本研究中使用的所有溶剂都是HPLC级。

2(b)(ii).细胞培养。4T1-2是小鼠转移性乳腺癌细胞系。PC-3和DU145是两种雄性激素非依赖性人前列腺癌细胞系。将它们在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM中在具有5％CO₂的潮湿环境中在37℃培养。

2(b)(iii).PEG_5K-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂(PEG-Fmoc₂)的合成。大部分根据我们发表的方法合成PEG-Fmoc₂。简言之，将1当量的单甲氧基PEG₅₀₀₀与过量的二-Boc-赖氨酸和DCC在添加DMAP的二氯甲烷(DCM)中混合，且允许反应在室温进行48小时。将混合物过滤并在冰冷的醚中沉淀，然后用冷乙醇和醚洗涤以获得纯化的PEG₅₀₀₀-二-Boc-赖氨酸。然后在室温用DCM/TFA(1:1,v/v)处理PEG衍生物2小时,接着去除溶剂，在冷醚中沉淀，并用冷乙醇和醚洗涤。最后，将去保护的PEG₅₀₀₀-赖氨酸-NH₂与用NHS预活化的过量的α-Fmoc-ε-Boc-赖氨酸、DCC和DCM中少量DMAP在37℃混合4小时。反应在37℃进行直到茚三酮检测为阴性，表明不存在游离氨基。将反应混合物过滤并通过冰冷的醚沉淀，然后用冷乙醇和醚洗涤。将获得的材料溶于水中并通过220nm过滤器过滤，然后通过冻干得到纯化的PEG_5K-lysyl-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂粉末。

2(b)(iv).混合PTX/PEG-Fmoc₂的胶束的制备和生物物理表征。利用薄膜水合法制备混合PTX/PEG-Fmoc₂的纳米胶束。PEG-Fmoc₂和PTX以指定摩尔比在玻璃管中在氯仿中充分混合。通过用温和氮气流去除有机溶剂生成载体/药物混合物薄膜。通过真空2小时进一步去除痕量的溶剂。然后将膜水合并通过涡流悬浮于DPBS中以获得混合PTX/PEG-Fmoc₂的纳米胶束的透明溶液。通过200nmPVDF针式过滤器过滤去除任何非包封的药物。

由通过MalvernZetaNanosizer的动态光散射(DLS)检查混合PTX/PEG-Fmoc₂的纳米胶束的粒径分布,并且在负染法后通过透射电子显微镜(TEM)观察形态。如之前所报道地使用芘作为荧光探针进行CMC测量。为了量化胶束中的PTX，将PTX用甲醇萃取，并用具有配有UV检测器的RP-18柱(250mm×4.6mm)的WatersAlliance2695-2998高效液相色谱(HPLC)系统在227nm在室温下检测。甲醇/水(80:20,v/v)的混合物用作流动相，流速为0.8mL/分钟。载药量(DLC)和载药率(DLE)按如上所述计算。

2(b)(v).冻干/重组对于粒径的影响。如上所述制备1mLDPBS中的PTX/PEG-Fmoc₂并且将PTX的浓度保持在1mg/mL。将透明溶液冷冻并冻干过夜以获得白色粉末。然后用1mL蒸馏水重组粉末以获得透明溶液。使用Zetasizer经由DLS记录冻干/重组前后的负载PTX的胶束的粒径。

2(b)(vi).荧光淬灭。不同药物/载体摩尔比的混合PTX/PEG-Fmoc₂的胶束如上所述在DPBS中制备，且使用Chol/PEG-Fmoc₂和TAXOL作为对照。在所有组中，将PEG-Fmoc₂的浓度固定在0.44μM用于比较。将样品置于96孔板内，并使用SynergyH1Hybrid多模式酶标仪在激发波长270nm和发射波长300-460nm处检查荧光强度。

2(b)(vii).体外药物释放动力学。制备2mL在DPBS(PH＝7.4)(1mgPTX/mL)中的混合PTX/PEG-Fmoc₂的胶束并且放进透析袋(MWCO12kDa,SpectrumLaboratories)中，在37℃在轻微晃动下在含有具有0.5％(w/v)吐温80的200mLDPBS的罐中孵育。在预定的时间点(0、1、2、4、8、24、48和72小时)，按如上所述通过HPLC测量保留在透析袋中的PTX的浓度。用DPBS稀释TAXOL制剂(CremophorEL/乙醇中6mgPTX/mL,1:1,v/v)至最终PTX的浓度为1mg/mL且用作对照。

2(b)(viii).体外细胞毒性。使用小鼠转移性乳腺癌细胞系4T1.2和两种人前列腺癌细胞系PC-3和DU145来评价PTX/PEG-Fmoc₂的体外细胞毒性。将细胞以每孔1000(4T1.2)、2000(DU145)和3000(PC-3)个细胞接种在96孔板上。24小时后，用PTX/PEG-Fmoc₂或TAXOL以PTX浓度在6.25至200ng/mL的范围内处理细胞。72小时后，将3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT,5mg/mL)添加至每个孔。孵育4小时后，将介质移除并将150μLDMSO添加至每个孔以增溶甲瓒晶体。使用酶标仪用参照波长630nm在550nm处测量每个孔的吸收度，并且基于下面的公式计算细胞活力。包含作为对照的未处理细胞。

％细胞毒性＝[1-(OD_处理-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)]×100％

2(b)(ix).动物。雌性BALB/c小鼠(6至8周)购自CharlesRiver(Davis,CA)并根据AAALAC指南安置在无菌条件下。所有与动物有关的实验完全遵守机构指南进行并获得匹兹堡大学的动物使用与保护管理咨询委员会的批准。

2(b)(x).最大耐受量(MTD)研究。将BALB/c小鼠随机分成七组(n＝4)并且静脉施用PTX/PEG-Fmoc₂(30、50、75、100和120mgPTX/kg)或TAXOL(15、20和25mgPTX/kg)。然后小鼠存活10天并且体重发生变化。以不会导致动物死亡或一般外观不发生明显变化或在整个实验期间体重减轻不大于15％的PTX剂量测定MTD。

2(b)(xi).荧光光学成像。使用Cy5.5(一种近红外荧光染料)标记的PTX进行近红外荧光(NIRF)成像以研究混合PTX/PEG-Fmoc₂的纳米胶束的体内生物分布。将200μL的混合PTX-Cy5.5/PEG-Fmoc₂的纳米胶束(0.4PTX-Cy5.5mg/mL)静脉注射入携带CL1异种移植物的SCID小鼠。在预定时间，将小鼠麻醉并用CarestreamMolecularImaging'sIn-VivoImagingFXPro，使用在630nm激发且在700nm发射的30秒曝光时间扫描。在成像研究结束时，将所有小鼠处死并将主要器官和肿瘤切除用于离体成像。

2(b)(xii).体内疗效。通过在雌性BALB/c小鼠的右翼皮下接种2×10⁵个4T1.2细胞建立同源小鼠乳腺癌模型(4T1.2)，并且当肿瘤大小达到～50mm³时开始处理。将小鼠随机地分成五组(n＝5)并且分别接受静脉注射盐水、TAXOL(10mgPTX/kg)和PTX/PEG-Fmoc₂(10、20和40mgPTX/kg)。通过卡尺测量肿瘤的体积并且基于公式计算：(L×W²)/2,其中L是最长和W是最短的肿瘤直径(mm)。数据表示为相对肿瘤体积(RTV，给定时间点的肿瘤体积除以第一次处理之前的肿瘤体积)。当肿瘤发展为溃疡的时候处死小鼠。还在整个处理过程中监测所有小鼠的体重变化以评价制剂的潜在毒性。在实验完成时切下肿瘤并测量肿瘤的重量。肿瘤生长抑制率(IR)计算为：1-(PTX处理组的平均肿瘤重量/盐水处理组的平均肿瘤重量)×100％。

2(b)(xii).统计分析。使用双尾学生t-检验在两组之间进行统计分析，且p<0.05被认为是统计学上显著的。进行单向方差分析以获得多组之间的显著性，然后如果p<0.05进行双尾学生t检验。

3.多柔比星研究

3(a).材料：用于研究的多柔比星或DOX(>99％)和Fmoc-FTS系统购自(Woburn,Massachusetts)的LC实验室。L-α-磷脂酰胆碱(大豆PC)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和DSPE-PEG(2000)-OCH₃购自(Alabaster,Alabama)的PolarLipids,Inc。胆固醇(Chol)购自(SaintLouis,Missouri)的Sigma-Aldrich。

通过脂质薄膜水合然后探针超声制备脂质体。未改性的脂质体由SPC:Chol:DSPE-PEG2000以7:3:0.5的摩尔比组成。将脂质组分的氯仿溶液混合并在温和N₂蒸汽下以及随后真空下蒸发至少4小时。用硫酸铵(123mM)在4℃下水合干燥的脂质膜过夜。简短的涡流之后，在3瓦下将悬浮液用探针超声1小时。将含有硫酸铵的脂质体通过用盐水预平衡的柱子。然后将脂质体悬浮液与DOX盐水溶液混合。使用凝胶色谱以去除未包封的DOX产生最终的脂质体/DOX。将DOX盐水溶液与三乙胺(2当量)在氯仿(CHCl₃)/甲醇(MeOH)(1:1,v/v)混合物中搅拌以从DOX·HCl去除HCl。不含药物的胶束和DOX增溶的胶束类似于负载PTX的胶束制备。

用于研究维生素E和Fmoc的DOX购自(UnionCity,California)的AKScientificInc。甲氧基-PEG_5,000-OH、琥珀酸酐、Boc-赖氨酸-(Boc)-OH和Fmoc-赖氨酸-(Boc)-OH均购自Sigma-Aldrich(SaintLouis,Missouri)。D-α-生育酚(维生素E)购自(Portland,Oregon)的TokyoChemicalIndustry。DCC购自AlfaAesar(MA,USA).DMAP购自(SanDiego,California).的Calbiochem-NovabiochemCorporation。本研究中使用的所有溶剂是HPLC级。

3(b).负载DOX的PEG_5K-Fmoc-FTS₂的体内肿瘤治疗研究:使用同源鼠乳腺癌模型(4T1.2)来检查DOX的不同制剂的疗效。将200μLPBS中的1x10⁵个4T1.2细胞皮下注射接种在雌性BALB/c小鼠的右翼。当小鼠中的肿瘤达到～50mm³的肿瘤体积时开始处理，且这天被指定为第一天。在第一天，将这些小鼠随机分成八组(n＝5)且分别在第1、4和7天静脉施用PBS(对照)、DOX(5mgDOX/kg)、脂质体/DOX(5mgDOX/kg)、负载DOX的PEG_5K-Fmoc-FTS₂胶束(5、10mgDOX/kg)和负载DOX的PEG_5K-FTS₂(5mgDOX/kg)。使用数字卡尺一周三次测量肿瘤大小并通过公式计算：(L×W²)/2,其中L是最长的,W是最短的肿瘤直径(mm)。为了在组之间比较，在每个测量时间点计算相对肿瘤体积(RTV)(其中RTV等于给定时间点的肿瘤体积除以第一次处理之前的肿瘤体积)。当肿瘤达到2000mm³时将小鼠处死。每三天测量来自不同组的所有小鼠的体重。

3(c).PEG_5K-VE₂(PEG-VE₂)的合成.首先，使用DCC(4当量)和DMAP(0.1当量)作为偶联试剂在DCM中将(Boc)赖氨酸(Boc)-OH(4当量)偶联至PEG_5K的端–OH上过夜。将PEG-赖氨酸-二Boc酯沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。然后通过用DCM中50％的三氟乙酸处理去除Boc基团。将生成的(PEG_5K-赖氨酸酯)沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。然后将维生素E琥珀酸酯(6当量)偶联至赖氨酸的氨基，生成PEG_5K-VE₂。将终产物进一步沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。将终产物冻干以生成白色粉末。合成路线如图10A所示。

3(d).PEG_5K-Fmoc-VE₂(PEG-FVE₂)的合成:通过由分子量为5000Da的MeO-PEG-OH的溶液相缩合反应合成PEG-FVE₂。使用DCC(4当量)和DMAP(0.2当量)作为偶联试剂在DCM中将Fmoc-赖氨酸-(Boc)-OH(4当量)偶联至PEG的端-OH上过夜。将Fmoc-赖氨酸-(Boc)PEG酯沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。然后，通过用DCM中50％三氟乙酸处理去除Boc基团，并且将Fmoc-赖氨酰基PEG酯沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。使用DCC(2当量)和DMAP(0.1当量)作为偶联试剂在DCM中将Boc-赖氨酸-(Boc)-OH(2当量)偶联至Fmoc-赖氨酰基PEG酯的端-NH2上过夜。将二-BocPEG酯沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。然后，通过用DCM中50％的三氟乙酸处理去除Boc基团，并且将二-NH2PEG酯沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。将生成的白色粉末沉淀物在真空下干燥。在DCC(4当量)和DMAP(0.2当量)的帮助下将维生素E琥珀酸酯(4当量)偶联至赖氨酸的去保护氨基上。将生成的PEG-FVE2沉淀并分别用冷乙醇和醚洗涤三次。随后将终产物用水透析并冻干以生成白色粉末。合成路线如图10B所示。

3(e).负载DOX的PEG-VE₂和PEG-FVE₂胶束的制备和生化表征：首先，用CHCl₃/MeOH(1:1.v:v)中的3摩尔当量的三乙胺中和DOX·HCl以从母化合物中去除HCl。将DOX(CHCl₃/MeOH中10mM)以不同的载体/药物摩尔比添加至PEG-FVE₂(氯仿中10mM)。通过氮气流首先将有机相去除以形成药物/载体混合物的干薄膜。将干膜在高真空下进一步干燥2小时以去除任何痕量的残留溶剂。然后不再使用超声处理将混合物的膜在盐水中重组。类似地制备负载DOX的PEG-VE₂。用动态光散射(DLS)评价配制了药物的胶束的平均直径。用带有检测器的HPLC在227nm处检查胶束中负载的DOX的浓度。按上面所述计算载药量(DLC)和载药率(DLE)。

3(f).体外释放动力学。通过采用含有0.5％(w/v)吐温80作为释放介质的DPBS(PH＝7.4)的透析技术进行DOX的体外释放动力学。采用游离DOX作为对照。将2mL负载DOX的PEG-VE₂或PEG-FVE₂纳米制剂(1mgDOX/mL)密封在透析管(MWCO＝12KDa,SpectrumLaboratories)中。将透析管浸在覆盖有封口膜的烧杯中的500mL释放介质中。将烧杯保存在孵育箱摇床中(100rpm和37℃)。在不同的时间点，用带有检测器的HPLC在227nm处测量保留在透析管中的DOX的浓度。数值以一式三份样品的平均值记录。

3(g).体内抗肿瘤治疗研究：使用同源鼠乳腺癌模型(4T1.2)评价不同DOX制剂的疗效。简而言之，在雌性BALB/c小鼠的右翼皮下接种200L盐水中的2x10⁵个4T1.2细胞。当小鼠内的肿瘤达到大约50-100mm³的体积时，将小鼠随机分成五组，每组5只小鼠，且将该天指定为第一天。从第一天起，分别以三天的间隔在第1、4、7天向小鼠静脉施用游离DOX(10mg/kg)、DOXIL(10mg/kg)、负载DOX的PEG-VE₂(10mg/kg)和负载DOX的PEG-FVE₂(10和20mg/kg)三次。使用数字卡尺在第1、4、7、10、12、15、18、21、25天测量肿瘤的大小并根据下面的公式计算：(L×W²)/2,其中L和W分别是每个肿瘤的长度和宽度。为了更好的在组之间进行比较，在每个测量时间点计算相对肿瘤体积(RTV)(其中RTV＝在给定时间点的肿瘤体积/第一次处理之前的肿瘤体积)。当肿瘤达到2000mm³或发展成严重的溃疡，无论哪个先到达，都将小鼠处死，并且将肿瘤称重。

目前，前面的说明书和附图陈述了多个代表性实施方式。在不背离本文的范围根据前面的教导各种改良、增加和替换设计当然对本领域的技术人员会是显而易见的，这被后面的权利要求而不是前面的说明书指出。落在权利要求的等价的含义和范围内的所有的改变和变化被包含在其范围内。

Claims (74)

1.制备化合物的制剂的方法，其包括：

确定包含至少一个与所述化合物相互作用的基团的化合物相互作用性试剂，

通过将包含与所述化合物相互作用的所述至少一个基团的至少一个化合物相互作用性结构域与至少一个亲水性结构域缀合制备载体试剂，和

将所述化合物与所述载体试剂结合以制备所述制剂。

2.根据权利要求2所述的方法，其中制备所述载体试剂进一步包括将所述至少一个化合物相互作用性结构域与至少一个疏水性结构域缀合，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

3.根据权利要求2所述的方法，其中至少一个疏水性结构域包含至少一种脂质。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性多聚物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述亲水性低聚物或所述亲水性多聚物是聚环氧烷烃、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或多肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚环氧烷烃是聚乙二醇。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一个离子基。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一个羧酸基、至少一个氨基、至少一个糖基、或至少一个多糖基。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一个氨基酸基团或至少一个肽基团。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一种以下基团：芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹诺酮基、异喹诺酮基、或者作为选自如下分子的残基的基团：所述化合物、所述化合物的一部分、(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘、1,1’-二-2-萘酚(BINOL)、喜树碱、喜树碱类似物、培美曲塞、多西他赛、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、长春花碱、长春地辛、依托泊苷、羟基喜树碱、伊立替康、米托蒽醌、它莫西芬、维甲酸、维生素A、维生素E、维生素K、维生素D、姜黄素、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替你、索拉菲尼，和硼替佐米，或其衍生物。

11.根据权利要求1至9的任一项所述的方法，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一个芴甲氧羰基或其衍生物。

12.根据权利要求1至11的任一项所述的方法，其中所述制剂形成复合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述复合物是胶束、乳剂、霜剂、脂质体、球粒、固体脂质纳米颗粒、水凝胶或立方相脂质体凝胶。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中与所述化合物相互作用的所述至少一个基团对所述化合物具有亲和力。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述氨基酸基团或所述肽基团包含对所述化合物具有亲和力的至少一个侧基。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与所述化合物相互作用的所述至少一个基团通过π-π堆积、疏水性相互作用或氢键与所述化合物相互作用。

17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述至少一种疏水性结构域包含至少一种脂质、至少一种生育酚、至少一种疏水性低聚物或至少一种疏水性多聚物。

18.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述至少一个疏水性结构域包含聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽、或其衍生物的至少一种。

19.根据权利要求2至18任一项所述的方法，其中所述至少一个疏水性结构域包含法呢基硫代水杨酸酯基。

20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述载体系统提供至少10％的载药量。

21.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述载体系统提供至少20％的载药量。

22.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述载体系统提供一种30％的载药量。

23.根据权利要求1至22任一项所述的方法，其中所述化合物是JP4-039、紫杉醇、FK506、环孢菌素A、原卟啉、GW4064、孟加拉玫瑰红、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素、吲哚美辛、它莫西芬或多柔比星。

24.根据权利要求1至22任一项所述的方法，其中所述化合物是紫杉醇，所述亲水性结构域包含聚乙二醇和所述相互作用性结构域包含至少一个法呢基硫代水杨酸酯基或其衍生物。

25.根据权利要求1至24任一项所述的方法，其中所述载体的所述至少一个化合物相互作用性结构域共价连接至所述至少一个亲水结构域。

26.根据权利要求2至24任一项所述的方法，其中载体试剂的所述至少一个化合物相互作用性结构域共价连接至所述至少一个亲水性结构域并且共价连接至所述至少一个疏水性结构域。

27.用于将化合物递送至患者的制剂，包含：

所述化合物和载体试剂，所述载体试剂包含至少一个亲水性结构域，所述亲水性结构域与至少一个化合物相互作用性结构域缀合，所述化合物相互作用性结构域包含至少一个与所述化合物相互作用的基团。

28.根据权利要求27所述的制剂，其中所述载体试剂进一步包含至少一个疏水性结构域，所述疏水性结构域与所述至少一种化合物相互作用性结构域缀合，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

29.制备用于将化合物递送至患者的制剂的方法，包括：

提供包含至少一个亲水性结构域的载体试剂，所述亲水性结构域与至少一个化合物相互作用性结构域缀合，所述化合物相互作用性结构域包含至少一个与所述化合物相互作用的基团；和

将所述化合物与所述载体试剂结合。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体试剂进一步包含至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

31.用于与化合物一起使用的载体试剂，包含至少一个与至少一个化合物相互作用性结构域缀合的亲水性结构域，所述化合物相互作用性结构域包含至少一个与所述化合物相互作用的基团。

32.根据权利要求31所述的载体试剂，进一步包含与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的至少一个疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

33.根据权利要求31所述的载体试剂，其中所述至少一个疏水性结构域包含至少一种脂质。

34.根据权利要求31或32所述的载体试剂，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性多聚物。

35.根据权利要求34所述的载体试剂，其中所述亲水性低聚物或所述亲水性多聚物是聚环氧烷烃、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或多肽。

36.根据权利要求35所述的载体试剂，其中所述聚环氧烷烃是聚乙二醇。

37.根据权利要求31或32所述的载体试剂，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一个离子基。

38.根据权利要求31或32所述的载体试剂，其中所述至少一个亲水性结构域包含至少一个羧酸基、至少一个氨基、至少一个糖基、或至少一个多糖基。

39.根据权利要求31或32所述的载体试剂，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一个氨基酸基团或至少一个肽基团。

40.根据权利要求31至39中任一项所述的载体试剂，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一种如下基团：芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹诺酮基、异喹诺酮基、或者作为选自以下分子的残基的基团：所述化合物、所述化合物的一部分、(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘、1,1’-二-2-萘酚(BINOL)、喜树碱、喜树碱类似物、培美曲塞、多西他赛、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、长春花碱、长春地辛、依托泊苷、羟基喜树碱、伊立替康、米托蒽醌、它莫西芬、维甲酸、维生素A、维生素E、维生素K、维生素D、姜黄素、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、索拉菲尼，和硼替佐米，或其衍生物。

41.根据权利要求31至39的任一项所述的载体试剂，其中所述化合物相互作用性结构域包含至少一个芴甲氧羰基或其衍生物。

42.根据权利要求31至41的任一项所述的载体试剂，其中所述制剂形成复合物。

43.根据权利要求42所述的载体试剂，其中所述复合物是胶束、乳剂、霜剂、脂质体、球粒、固体脂质纳米颗粒、水凝胶或立方相脂质体凝胶。

44.根据权利要求31或32所述的载体试剂，其中与所述化合物相互作用的所述至少一个基团对所述化合物具有亲和力。

45.根据权利要求39所述的载体试剂，其中所述氨基酸基团或所述肽基团包含对所述化合物具有亲和力的至少一个侧基。

46.根据权利要求31至45中任一项所述的载体试剂，其中与所述化合物相互作用的所述至少一个基团通过π-π堆积、疏水性相互作用或氢键与所述化合物相互作用。

47.根据权利要求32至46中任一项所述的载体试剂，其中所述至少一个疏水性结构域包含至少一种脂质、至少一种生育酚、至少一种疏水性低聚物或至少一种疏水性多聚物。

48.根据权利要求32至46中任一项所述的载体试剂，其中所述至少一个疏水性结构域包含聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽、或其衍生物的至少一种。

49.根据权利要求31至48任一项所述的载体试剂，其中所述至少一个疏水性结构域包含法呢基硫代水杨酸酯基。

50.根据权利要求31至49任一项所述的载体试剂，其中所述载体系统提供至少10％的载药量。

51.根据权利要求31至49任一项所述的载体试剂，其中所述载体系统提供至少20％的载药量。

52.根据权利要求31至49任一项所述的载体试剂，其中所述载体系统提供一种30％的载药量。

53.根据权利要求31至52任一项所述的载体试剂，其中所述化合物是JP4-039、紫杉醇、FK506、环孢菌素A、原卟啉、GW4064、孟加拉玫瑰红、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素、吲哚美辛、它莫西芬或多柔比星。

54.根据权利要求31至52任一项所述的载体试剂，其中所述化合物是紫杉醇，所述亲水性结构域包含聚乙二醇和所述相互作用性结构域包含至少一个法呢基硫代水杨酸酯基或其衍生物。

55.根据权利要求31至54任一项所述的载体试剂，其中所述载体的所述至少一个化合物相互作用性结构域共价连接至所述至少一个亲水结构域。

56.根据权利要求32至54任一项所述的载体试剂，其中载体试剂的所述至少一个化合物相互作用性结构域共价连接至所述至少一个亲水性结构域并且共价连接至所述至少一个疏水性结构域。

57.用化合物治疗患者的方法，包括：向患者递送制剂，其中所述制剂包含所述化合物和载体试剂，所述载体试剂包含至少一个化合物相互作用性结构域，所述化合物相互作用性结构域包含至少一个与所述化合物相互作用的至少一个基团，所述至少一种化合物相互作用基团与至少一个亲水性结构域缀合。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述载体试剂进一步包含至少一个与所述至少一个化合物相互作用性结构域缀合的疏水性结构域，使得所述至少一个化合物相互作用性结构域位于所述至少一个亲水性结构域和所述至少一个疏水性结构域之间。

59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述制剂通过权利要求1至26任一项所述的方法形成。

60.物质的组合物，包含至少一种连接至至少一个基团的亲水性多聚物，所述基团选自芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基、喹诺酮基、异喹诺酮基、或者作为选自以下分子的残基的基团：(9H-芴-9-基)甲胺、(9H-芴-9-基)甲醇、9H-芴-9-胺、萘、1,1’-二-2-萘酚(BINOL)、喜树碱、喜树碱类似物、培美曲塞、多西他赛、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、长春花碱、长春地辛、依托泊苷、羟基喜树碱、伊立替康、米托蒽醌、它莫西芬、维甲酸、维生素A、维生素E、维生素K、维生素D、姜黄素、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、索拉菲尼，和硼替佐米，或其衍生物。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述亲水性多聚物是聚环氧烷烃、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉或多肽。

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述亲水性多聚物是聚环氧烷烃。

63.根据权利要求61所述的组合物，其中所述亲水性多聚物是聚乙二醇。

64.根据权利要求60至63任一项所述的组合物，其中所述至少一个基团是芴甲氧羰基、苄氧羰基、异丁氧基氨基甲酸酯基、萘基乙酰基、咔唑基。

65.根据权利要求60至64所述的组合物，其中所述至少一个基团是芴甲氧羰基。

66.根据权利要求60至65中任一项所述的组合物，其中所述至少一个基团通过至少一个氨基酸基团或至少一个肽基团连接至所述至少一种亲水性多聚物。

67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述化合物是聚乙二醇-赖氨酰基-(α-Fmoc-ε-t-Boc-赖氨酸)₂。

68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述聚乙二醇具有至少1KDa的分子量。

69.根据权利要求68所述的组合物，其中所述聚乙二醇具有大约1KDa至10KDa范围内的分子量。

70.根据权利要求60至69任一项所述的组合物，进一步包含至少一个疏水基，其中所述至少一个基团位于所述疏水性基团和所述至少一种亲水性多聚物之间。

71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述至少一个疏水性基团包含脂质、聚甲基丙烯酰基、聚乙烯、聚苯乙烯、聚异丁烷、聚酯、多肽、或其衍生物的至少一种。

72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述至少一个疏水性基团包含至少一个脂基。

73.根据权利要求72所述的组合物，其中所述至少一个疏水性基团包含至少一个油酰基。

74.根据权利要求60-73中任一项所述的组合物，其中所述组合物形成胶束、乳剂、霜剂、脂质体、球粒、固体脂质纳米颗粒、水凝胶或立方相脂质体凝胶。