CN110403917A - 一种人工外泌体、其制备方法及应用 - Google Patents

一种人工外泌体、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人工外泌体，所述人工外泌体包括：由修饰或未修饰的人工脂质膜构成的外部脂质壳和DOTAP修饰的PLGA纳米球构成的聚合物核，还提供了其制备方法和应用。本发明的人工外泌体适用于实现对多组分的同时递送，这将为开发新型药物递送体系提供理论依据。本发明的方法在癌症、遗传性疾病和传染病等方面具有广泛的应用前景。

Description

一种人工外泌体、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种人工外泌体，及其制备方法和应用。
背景技术
纳米颗粒的体内应用面临诸多挑战。首先，机体复杂的环境容易对外来物产生排斥。例如，血液中存在各种基于蛋白质和细胞的成分，有可能吸附到纳米颗粒上，从而削弱了纳米颗粒的特性。纳米颗粒到达目标前，网状内皮系统的吸收是几乎所有载体必须克服的主要障碍之一。减少非特异性吸收，增加特异性靶向作用，可促进纳米颗粒在目标部位的选择性蓄积，从而提高效力。
仿生学是纳米颗粒设计的理想方法，它模拟生物特有的结构，赋予材料生物学特性，代表了一种先进的材料研究思路。目前，科研人员已成功将来自细胞膜，如癌细胞、干细胞、红细胞和血小板等，用于改造纳米颗粒并赋予它们类似细胞的功能。这些仿生策略可使纳米颗粒具有长循环、免疫逃逸或特异性靶向等性能。但天然细胞膜的应用也存在一定的局限性，如颗粒大小和均一性的控制，细胞膜上的结构修饰，封装控制和不同特性化学分子的负载，以及制备和储存的标准化方案的建立都存在较大困难。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种人工外泌体，及其制备方法和应用。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“DOPC”是指：1,2-二油酰-甘油-3-磷酸胆碱。
术语“DPPC”是指：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
术语“DSPC”是指：1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸胆碱。
术语“DOTAP”是指：(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵。
术语“PLGA”是指：聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
术语“PMSF”是指：苯甲基磺酰氟。
术语“PVA”是指：聚乙烯醇。
术语“siRNA”是指：小干扰RNA。
术语“AE”是指：即Artificial exosome，人工外泌体。
术语“POPC”是指：1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂。
术语“SMPC”是指：1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基卵磷脂。
术语“DLPC”是指：1-棕榈酰-2-月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
术语“DAPC”是指：二花生酰基磷脂酰胆碱。
术语“DMPC”是指：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种人工外泌体，所述人工外泌体包括：由修饰或未修饰的人工脂质膜构成的外部脂质壳和DOTAP修饰的PLGA纳米球构成的聚合物核。
根据本发明第一方面的人工外泌体，其中，所述人工脂质膜通过以下一种或多种成分修饰：干细胞膜蛋白、肿瘤细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、白细胞膜蛋白、T细胞膜蛋白；优选为干细胞膜蛋白。
根据本发明第一方面的人工外泌体，其中，所述人工脂质膜包括以下一种或多种成分：DPPC、DOPC、DSPC、胆固醇、POPC、SMPC、DLPC、DAPC、DMPC；
优选地，所述人工脂质膜的成分为DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇；
更优选地，人工脂质膜中DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇的摩尔比为1～10：1:1～5：1，最优选为5:1:3:1。
根据本发明第一方面的人工外泌体，其中，所述DOTAP修饰的PLGA纳米球的粒径为100～150nm；和/或
所述DOTAP修饰的PLGA纳米球中，所述DOTAP与PLGA的质量比为1:10～50，优选为1:10～30，最优选为1:25。
根据本发明第一方面的人工外泌体，其中，所述人工外泌体的外部脂质壳中包载siRNA和/或蛋白质；
优选地，所述蛋白质选自以下一种或多种：OCT4、BSA、TBX5、Hand2、Mef2c、gata4；和/或
所述siRNA选自以下一种或多种：siTrim28、siSmad3、siTGF-β；
更优选地，所述蛋白质为OCT4和/或所述siRNA为siTrim28。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的人工外泌体的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
(1)通过溶剂蒸发法和水包油包水乳液法制备纳米球；
(2)通过薄层蒸发法将步骤(1)制得的纳米球包裹入人工脂质膜中，得到所述人工外泌体。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中纳米球的制备包括以下步骤：
(A)将PLGA和DOTAP溶于二氯甲烷中制得油相溶液；
(B)制备待包载物质的水相溶液滴加入步骤(A)所得油相溶液中，超声乳化；
(C)将步骤(B)所得乳液滴加入PVA水溶液中，超声得到双乳液；
(D)将步骤(C)所得双乳液加入PVA水溶液中，搅拌；和
(E)蒸发步骤(D)所得溶液中的二氯甲烷，高速离心获得所述纳米球；
优选地，所述步骤(C)中PVA溶液的浓度为5％～10％W/V，优选为7％W/V；和/或
所述步骤(D)中PVA溶液的浓度为0.5％～5％W/V，优选为1％W/V。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)包括以下步骤：
(a)将脂质成分溶解于氯仿甲醇混合液中；
(b)将步骤(a)所得溶液旋转蒸发形成薄膜；和
(c)将步骤(1)制得的纳米球加入步骤(b)所得的薄膜中，加热涡旋，通过醋酸纤维素膜挤出，得到所述人工外泌体。
本发明的第三方面提供了一种药物递送系统，所述药物递送系统包括根据第一方面所述的人工外泌体。
本发明的第四方面第一方面所述的人工外泌体或按照第二方面所述的方法制备的人工外泌体在制备用于治疗癌症、遗传性疾病和/或传染病的药物中的应用。
人工合成磷脂材料能较大程度地弥补天然细胞膜不足。采用细胞膜蛋白修饰人工脂质体结构，既可充分利用人工脂质体在标准化制备和药物递送中的优势，又可利用细胞膜特异性识别的特性，用于负载siRNA和蛋白。这一结构，类似于外泌体，本发明人称之为人工外泌体。这一结构包含聚合物核以携带疏水性药物和试剂，以及外部脂质壳以延长循环半衰期。通过用阳离子脂质赋形剂(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)纳米球，可实现对蛋白和siRNA的高效递送，并从溶酶体逃逸。细胞膜蛋白修饰的人工脂质(DPPC、DOPC、DSPC和胆固醇)可有效增加纳米颗粒的循环性能、避免免疫系统的俘获和促进细胞摄取。本发明人期望人工外泌体能发挥更重要的作用，实现对多组分的同时递送，这将为开发新型药物递送体系提供理论依据。
本发明的目的在于本发明人提供一种方法将细胞膜蛋白修饰脂质体后包裹PLGA/DOTAP纳米球共传递蛋白和核酸，以实现纳米颗粒的生物功能和多组分共传递治疗，从而到达更有效的药物治疗效果。
为达到目的，本发明采用以下技术方案：
本发明中以OCT4蛋白和siTrim28为例，进行说明。通过阳离子脂质赋形剂DOTAP修饰PLGA，形成PLGA/DOTAP复合物，可高效负载目标蛋白和siRNA，并实现高效的蛋白递送和基因沉默。本发明人使用DOTAP与PLGA，形成PLGA/DOTAP复合物，并采用水/油/水体系，将蛋白和siRNA高效负载。干细胞膜蛋白修饰的脂质(DPPC、DOPC、DSPC和胆固醇)可增加纳米颗粒的稳定性和靶向性，从而提高细胞的选择性递送，如图1所示。
在一个实施例中，本发明中聚合物核DOTAP与PLGA的比例固定。
在一个实施例中，本发明中脂质体的成分为DPPC，DOPC，DSPC和胆固醇，且其比例固定。
本发明的人工外泌体可以具有但不限于以下有益效果：
本发明适用于实现对多组分的同时递送，这将为开发新型药物递送体系提供理论依据。本发明的方法在癌症、遗传性疾病和传染病等方面具有广泛的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了人工外泌体共递送蛋白和siRNA的流程。
图2示出了本发明人工外泌体的制备流程图。
图3示出了实施例2和实施例3的产品的物理特性表征结果，其中，
图3A示出了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28的粒径、PDI；图3B示出了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28的Zeta电位。
图4示出了实施例3中PLGA和蛋白膜修饰脂质体包裹PLGA纳米颗粒的电镜图；其中图4A为DOTAP修饰的PLGA球的电镜图，图4B为人工外泌体的电镜图。
图5示出了试验例1中细胞摄入结果，其中图5A示出了激光共聚焦分析不同时间里，细胞对AE/OCT4/siTrim28的摄入情况变化；图5B示出了成像流式测定细胞与AE/OCT4/siTrim28共孵育6h后的摄入情况，图5C示出了成像流式定量分析细胞与AE/OCT4/siTrim28共孵育6h后的摄入情况。
图6示出了试验例2中溶酶体逃逸共聚焦观察结果。
图7示出了试验例3中体外表达情况检测结果，其中图7A示出了WB分析不同的组分处理后，Trim28的蛋白表达情况；图7B示出了图7A中WB的灰度值分析，图7C示出了RT-PCR分析不同的组分处理后，Trim28的mRNA水平。
图8示出了试验例4中给药后不同代数的衰老检测结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂与材料：
无核酶水、PMSF购自碧云天、醋酸纤维素膜、PLGA购自Sigma-Aldrich、OCT4蛋白购自上海吉荧生物技术有限公司、siTrim28购自Takara、DOTAP、DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇购自Avanti Polar Lipids、氯仿、甲醇、二氯甲烷、聚乙烯醇购自广州化学试剂厂；
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，购自碧云天。
仪器：
马尔文粒径仪，购自英国马尔文仪器有限公司、型号NS-90纳米粒度仪；
透射电镜，购自日本电子JEOL、型号JEM-1400PLUS；
流式细胞仪，购自MECK、型号ImageStreamX Mark；
共聚焦显微镜，购自卡尔·蔡司股份公司、型号LSM880。
实施例1
本实施例用于说明膜蛋白的提取。
本实验使用的是碧云天的细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
1)准备试剂：室温溶解并混匀膜蛋白抽提试剂A和B，溶解后立即置于冰上，取适量的膜蛋白抽提试剂A和B备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。(注：PMSF一定要在抽提试剂A加入到样品中前2-3min内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效)；
2)将细胞培养在15cm2的培养瓶中，养到80-90％的密度，约有2-5×107个细胞，移去培养基，用预冷的PBS洗三次，用细胞刮子使细胞脱落，并用移液器将细胞吹打下来，加入1mL的PBS，转移到1.5mL EP管中，4℃，1200rpm，离心5min；再去除上清，用少量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，进行计数，在4℃，600g，离心5min，弃上清，再4℃，600g，离心5min离心一次，尽可能吸尽残留液体。
3)加入1mL临用前添加了PMSF的试剂A，轻轻充分悬浮细胞，冰浴放置15min；
4)采用反复冻融法来破碎细胞，即放入液氮1h，再拿出来室温自然解冻，重复三次，取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度，如果细胞破碎的程度不足70％，可增加冻融的次数；去除细胞核和为破碎的细胞。4℃，700g，离心10min，将上清移至离心的EP管中，保留沉淀。
5)将沉淀进行4℃，14000g，离心1min，尽最大努力吸尽上清，再加入膜蛋白抽提试剂B 300uL，用最高速2000rpm剧烈涡旋10s，再冰浴10min，重复涡旋3次，充分抽提膜蛋白，在4℃，14000g，离心5min，收集上清，即细胞膜蛋白溶液，再用BCA法测量蛋白浓度，标记好时间和浓度放到-80℃保存备用。
实施例2
本实施例用于说明本发明PLGA/DOTAP纳米颗粒制备，示出了PLGA中将药物OCT4蛋白和siTrim28负载过程。
通过溶剂蒸发法和水包油包水乳液法制备。
1)DOTAP与PLGA的质量比为1：25，将PLGA颗粒(100mg)和DOTAP粉末(4mg)溶于1mL二氯甲烷中，油相(O)；
2)再将OCT4蛋白(0.1mg)和siTrim28(0.1mg)溶于300uL的无核酶水中，水相(W)；
3)将步骤2)制备的水相逐滴加入到步骤1)制备的油相，同时超声45s，功率60％，2s on 1s off，在冰上操作；
4)乳化后，再将步骤3)所得乳液逐滴加入到7％(W/V)聚乙烯醇(PVA)水溶液中(3mL)，同时超声1min，功率60％，2s on 1s off，在冰上操作；
5)将步骤4)得到的双乳液，加入到1％(W/V)PVA水溶液中(30mL)中，在磁力搅拌3h，800rpm，4℃；
6)待二氯甲烷完全蒸发(室温，3h，800rpm)；然后高速离心(80 000rpm，30min，4℃)，获得PLGA球；
7)再用无核酶水洗涤三次，最后用1mL无核酶水或PBS重悬，或是采用冻干获得，保存于-20℃备用。
实施例3
本实施例用于说明本发明膜蛋白修饰脂质体包裹PLGA纳米颗粒的制备。
采用使用薄层蒸发(TLE)方法。
1)将1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二油酰-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和胆固醇(Cholesterol)，按照5：1：3：1摩尔比分别溶解在分析纯氯仿：无水甲醇混合液(3：1V/V)中；
2)然后通过旋转蒸发器蒸发步骤1)所得溶液的溶剂形成薄膜。分别在实施例2已形成PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28纳米颗粒悬液中加入不同比例实施例1分离的膜蛋白(蛋白质：脂质质量比＝1：100、1：200、1：300、1：400、1：500)，涡旋混匀，再一并加入到圆底烧瓶使膜水合以组装成纳米颗粒；
3)通过在45℃加热三个循环并涡旋，每次3min；
4)然后将脂质悬浮液在45℃下通过200nm孔径的醋酸纤维素膜挤出10次，将获取的颗粒溶液储存在4℃备用。获取的颗粒为AE/OCT4/siTrim28。
5)PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28的物理特性表征结果如图3所示，其中，图3A示出了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28的粒径、PDI；图3B示出了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28的Zeta电位。
在粒径分布图中，PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28纳米球平均粒径为125.41nm、PDI为0.145，在包裹了仿生膜后，其粒径为156.13nm，说明在包裹后其粒径增加了15-50nm左右，PDI为0.184，说明本发明人合成的纳米球分散性良好。从Zeta电位结果可以看到，PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28球的电位值(23.433±1.250m V)，而包裹仿生磷脂膜后，其电位值(-18.23±0.57m V)，进一步证明了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28成功被包裹。图4示出了PLGA/DOTAP/OCT4/siTrim28和AE/OCT4/siTrim28纳米颗粒的电镜图。
试验例1
本试验例用于说明本发明细胞摄入效果。
将实施例3制备的人工外泌体与脐带间充质干细胞在37℃，5％CO2湿润的气氛中孵育。图5示出了流式检测在共培养6h后细胞摄入率，当负载体系与人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HucMSC)细胞共培养6h后，FITC-OCT4的Ch_02通道的阳性率达95.1％，Cy3-siRNA的Ch_03通道的阳性率达95％，两种药物的双阳性也达到了92.3％。共聚焦检测不同时间点细胞摄入情况，将标记好药物的负载体系与HucMSC细胞在血清存在下分别孵育1h、3h、6h和12h，来确定共孵育(给药)时间，随着共培养时间增加至6h，如图所示各组荧光强度明显增加。这取决于负载体系随着时间推移逐渐在细胞内积累，更多的siRNA和蛋白会释放到细胞内。
试验例2
本试验例用于说明本发明溶酶体逃逸的共聚焦观察结果。
图6示出了在HucMSC细胞中溶酶体逃逸结果；分别在37℃，5％CO2湿润的气氛中孵育1和3h后，红色(Cy3-siRNA)、绿色(FITC-OCT4)和蓝色(LysoTracker)荧光共定位于HucMSC细胞中，表明OCT4蛋白/siTrim28位于溶酶体中。孵育6h后，红色荧光(Cy5-siRNA)、绿色荧光(FITC-OCT4)和蓝色荧光(LysoTracker)分离，表明OCT4蛋白/siTrim28从溶酶体逃逸到细胞质中。
试验例3
本试验例用于说明本发明体外表达情况检测结果。
对照组采用PBS缓冲液，AE，AE/OCT4、AE/siTrim28、AE/OCT4/siTrim28制备方法与实施例2和实施例3相同，与前述实施例的差别仅在于改变了包裹药物的种类。
Liposomes/OCT4/siTrim28的制备方法如下：
将1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二油酰-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和胆固醇(Cholesterol)，按照5：1：3：1摩尔比分别溶解在分析纯氯仿：无水甲醇混合液(3：1V/V)中；
然后通过旋转蒸发器蒸发步骤1)所得溶液的溶剂形成薄膜。加入含OCT4蛋白(0.1mg)和siRNA(0.1mg)的300uL无核酶水，再加入到圆底烧瓶使膜水合以组装成纳米颗粒；
通过在45℃加热三个循环并涡旋，每次3min；
然后将脂质悬浮液在45℃下通过200nm孔径的醋酸纤维素膜挤出10次，将获取的颗粒溶液储存在4℃备用。
图7示出了用PBS组、AE、AE/OCT4组、AE/siTrim28、AE/OCT4/siTrim28和Liposomes/OCT4/siTrim28在37℃，5％CO2湿润的气氛中转染6h，重复三次的Trim28的WB和RT-PCR结果；(N＝3,***P<0.01)。
试验例4
本试验例用于说明本发明体外表达情况检测结果。
β-半乳糖苷酶染色实验过程：
1.将培养细胞的6孔板中生长培养基去除。
2.用1X PBS 2ml洗一次。
3.将1mL 1X固定液加入每个35毫米孔。让细胞在室温下固定10-15min。
4.用1X PBS 2mL洗两次。
5.向每个孔中加入1mlβ-半乳糖苷酶染色溶液(用石蜡密封六孔板以防止蒸发。
6.在干燥培养箱(无CO2)中于37℃孵育培养板至少一夜，观察拍照。
图8示出了给药后不同代数的衰老检测结果。可以看到，细胞在给药培养到16代，通过β-半乳糖苷酶染色，发现阳性率低于15％，表明细胞的衰老的有减缓的效果，对于维持细胞的干性也有一定作用。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种人工外泌体，其特征在于，所述人工外泌体包括：由修饰或未修饰的人工脂质膜构成的外部脂质壳和DOTAP修饰的PLGA纳米球构成的聚合物核。
2.根据权利要求1所述的人工外泌体，其特征在于，所述人工脂质膜通过以下一种或多种成分修饰：干细胞膜蛋白、肿瘤细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、白细胞膜蛋白、T细胞膜蛋白；优选为干细胞膜蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的人工外泌体，其特征在于，所述人工脂质膜包括以下一种或多种成分：DPPC、DOPC、DSPC、胆固醇、POPC、SMPC、DLPC、DAPC、DMPC；
优选地，所述人工脂质膜的成分为DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇；
更优选地，人工脂质膜中DPPC、DSPC、DOPC、胆固醇的摩尔比为1～10：1:1～5：1，最优选为5:1:3:1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人工外泌体，其特征在于，所述DOTAP修饰的PLGA纳米球的粒径为100～150nm；和/或
所述DOTAP修饰的PLGA纳米球中，所述DOTAP与PLGA的质量比为1:10～50，优选为1:10～30，最优选为1:25。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人工外泌体，其特征在于，所述人工外泌体的外部脂质壳中包载siRNA和/或蛋白质；
优选地，所述蛋白质选自以下一种或多种：OCT4、BSA、TBX5、Hand2、Mef2c、gata4；和/或
所述siRNA选自以下一种或多种：siTrim28、siSmad3、siTGF-β；
更优选地，所述蛋白质为OCT4和/或所述siRNA为siTrim28。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的人工外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)通过溶剂蒸发法和水包油包水乳液法制备纳米球；
(2)通过薄层蒸发法将步骤(1)制得的纳米球包裹入人工脂质膜中，得到所述人工外泌体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中纳米球的制备包括以下步骤：
(A)将PLGA和DOTAP溶于二氯甲烷中制得油相溶液；
(B)制备待包载物质的水相溶液滴加入步骤(A)所得油相溶液中，超声乳化；
(C)将步骤(B)所得乳液滴加入PVA水溶液中，超声得到双乳液；
(D)将步骤(C)所得双乳液加入PVA水溶液中，搅拌；和
(E)蒸发步骤(D)所得溶液中的二氯甲烷，高速离心获得所述纳米球；
优选地，所述步骤(C)中PVA溶液的浓度为5％～10％W/V，优选为7％W/V；和/或
所述步骤(D)中PVA溶液的浓度为0.5％～5％W/V，优选为1％W/V。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括以下步骤：
(a)将脂质成分溶解于氯仿甲醇混合液中；
(b)将步骤(a)所得溶液旋转蒸发形成薄膜；和
(c)将步骤(1)制得的纳米球加入步骤(b)所得的薄膜中，加热涡旋，通过醋酸纤维素膜挤出，得到所述人工外泌体。
9.一种药物递送系统，其特征在于，所述药物递送系统包括根据权利要求1至5中任一项所述的人工外泌体。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的人工外泌体或按照权利要求6至8中任一项方法制备的人工外泌体在制备用于治疗癌症、遗传性疾病和/或传染病的药物中的应用。
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