CN107496358A - 一种脂质体增强型水凝胶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，本发明提供了一种脂质体增强型水凝胶及其应用，该增强型水凝胶主要由水凝胶材料和空白或载药脂质体共混交联制得；所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶；所述脂质体的加入量为1～150mg/mL水凝胶体系中水。本发明提供的水凝胶具有增强的力学性能，并能实现不同药物的负载和调控释放，从而实现组织修复和疾病治疗的多功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种脂质体增强型水凝胶及其应用。
背景技术
水凝胶(Hydrogel)，是将部分疏水基团和亲水残基引入水溶性高分子的网状交联结构中而形成一类具有三维网状结构的高分子材料，其中亲水残基和水分子相结合，将水分子包裹于网状结构内部，疏水残基则遇水膨胀。水凝胶具有含水量高、粘弹性好、质地柔软且生物相容性好等优点，使得其在支架涂层、细胞载体、组织工程、药物载体等生物医学方面得到广泛的应用。
作为药物载体，目前水凝胶的载药方式主要为直接共混或载体复合。其中，水凝胶直接共混载药是将药物直接混合于水凝胶中进行负载，这一制备方法较为简便，但是存在药物突释严重、疏水性药物在水凝胶内分散不均匀、蛋白类药物在交联过程中可能遭到破坏等问题。也就是说，虽然水凝胶在治疗学及组织工程等方面有着诸多的应用，但是单纯的水凝胶材料性能的单一性很难满足疾病治疗的复杂要求。
载体复合的载药方式通常指将药物负载到微球、碳纳米管等中，然后再复合到水凝胶中实现药物的负载，这种方式便于调控释放药物。其中，载药微球主要指明胶微球、白蛋白微球、淀粉微球、聚酯类微球、磁性微球等。然而，这些微球在制备过程中均运用了化学交联剂或加热；化学交联剂例如甲醛等有较强的毒副作用，而加热交联则对于蛋白、因子、抗体等药物造成构型、活性等方面的影响继而影响药效。
在碳纳米管载药水凝胶中，碳纳米管具有中空结构，以及具有良好的热力学和化学稳定性、高强度韧性等特点；碳纳米管可以直接装载药物或者表面修饰后以共价键的方式接枝药物。但是，碳纳米材料具有胚胎毒性和呼吸器官毒性，且对皮肤有一定的刺激作用。研究还发现，微球、碳纳米管等与水凝胶结合时会存在一定的界面分离作用，从而直接造成水凝胶强度下降，难以实现水凝胶性能增强和药物调控释放。
因此，构建载药水凝胶使其在维持水凝胶特性的同时，还具有对药物负载和调控释放的功能，以实现组织修复和疾病治疗的多功能，这对于拓展水凝胶在生物医学领域中的应用具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种脂质体增强型水凝胶及其应用，本发明提供的水凝胶具有增强的力学性能，并能实现不同药物的负载和调控释放。
本发明提供一种脂质体增强型水凝胶，其主要由水凝胶材料和脂质体共混交联制得；所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶；所述脂质体为空白脂质体或载药脂质体，所述脂质体的加入量为1～150mg/mL水凝胶体系中水。
本发明能显著提高水凝胶的综合力学性能，并实现不同类型药物的负载和控释，可以拓展水凝胶的应用。
本发明构建了一种载药脂质体与水凝胶相结合的载药水凝胶，或者将空白脂质体与水凝胶结合。其中，水凝胶材料可以是透明质酸及其衍生物水凝胶、纤维素及其衍生物水凝胶、壳聚糖及其衍生物水凝胶、海藻盐及其衍生物水凝胶、胶原蛋白及其衍生物水凝胶、明胶及其衍生物水凝胶等天然水凝胶；也可以是聚酯类水凝胶、聚乙烯乙酸酯水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚物等合成水凝胶；还可以是天然-合成高分子复合水凝胶，如胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶等。
在本发明中，所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶，优选为不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶。具体地，所述水凝胶材料可为GelMA；GelMA是由不饱和甲基丙烯酸及其衍生物与明胶，在光引发剂或化学引发剂存在的情况下发生聚合反应形成的水凝胶，即为不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶，其具有优良的生物学性质、可调控的物理性能，在生物医药方面应用较好。
本发明对所述水凝胶材料的来源没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以自行制备。本发明一些实施例采用明胶和甲基丙烯酸酐反应制备GelMA；具体可将明胶溶液与甲基丙烯酸酐混合，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)存在的条件下于60℃进行反应，其中，明胶与甲基丙烯酸酐的质量体积之比可为20g：15mL～20mL；反应的时间2h～5h，得到反应液。将反应液倒入截留分子量为8000～14000的透析袋中，透析过程为一周。一周后，收集透析袋内的液体，将液体预热至60℃，用孔径为0.22μm的微孔滤膜趁热对其进行过滤，再将过滤所得的液体进行冷冻干燥或其他方式干燥，得到GelMA材料。在本发明的一些实施例中，所述水凝胶材料的截留分子量为8000～14000。
本发明采用载药脂质体与水凝胶相结合制备功能化载药水凝胶，可以减小药物的突释，并且由于脂质体可以对不同类型的药物进行包载，形成均一的脂质体溶液，实现药物在水凝胶内的均匀分布，所以也使得包载有脂质体的水凝胶可以包载多种类型的药物，实现多种药物协同给药。
根据药剂学定义，脂质体是一种将药物包封于类脂质双分子层薄膜中所制成的超微球载体制剂。脂质体(liposome)的形成一般包括：当两亲性分子(例如磷脂)分散于水相介质中时，两亲性分子的疏水尾部倾向于避开水相聚集在一起，将亲水的头部暴露在水相，从而形成有着双分子层结构的封闭囊泡。在脂质体囊泡结构的内水相可以包载水溶性小分子、水溶性大分子、蛋白类药物、抗体、因子等亲水性药物，双分子膜内则可包载脂溶性药物，从而实现对于不同种类药物的包载。
在本发明中，所述脂质体为空白或载药脂质体。在本发明中，所述载药脂质体包括脂质体载体和负载在脂质体载体上的药物成分，其与水凝胶材料共混交联，得到脂质体增强型水凝胶。
本发明实施例调节脂质体双分子层组分，可以实现脂质体与水凝胶良好的结合，避免界面分离作用的产生，调节水凝胶和脂质体分子间的共价键或非共价键结合，显著增强水凝胶的综合力学性能。在本发明的实施例中，所述脂质体载体或空白脂质体主要由磷脂类材料与胆固醇(或胆固醇衍生物)构成，其中的磷脂类材料可以采用中性磷脂类材料、负电荷磷脂类材料或正电荷磷脂类材料；胆固醇材料优选为胆固醇。在本发明的实施例中，所述磷脂类材料可选自卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或鞘磷脂等中性磷脂，优选采用卵磷脂。所述磷脂类材料也可选自磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或磷脂酰丝氨酸等负电荷磷脂，还可为硬脂酰胺或油酰基脂肪胺及其衍生物等正电荷磷脂。
本发明可通过空白脂质体分别将不同药物负载，得到多种载药脂质体，然后直接分散到水凝胶中，进而实现水凝胶不同药物的装载和调控释放。在本发明的实施例中，负载在脂质体载体上的药物成分可为亲水性药物如盐酸吉西他滨、亲脂性药物、基因类药物或蛋白类药物。具体地，所述药物成分优选为盐酸吉西他滨、紫杉醇或凝血酶。在本发明的优选实施例中，所述载药脂质体的包封率在20％以上，优选22％～95％，如26％、65％、93％等。在本发明的优选实施例中，所述载药脂质体的平均粒径为100～300nm，优选为150nm～260nm；其为装载药物成分的脂质体纳米颗粒，分散性良好。
本发明对所述载药脂质体的来源没有特殊限制，可以采用市售产品，也可以自行制备。本发明脂质体可以包载不同类型的药物，例如水溶性、脂溶性、活性大分子类药物，进而使得脂质体增强型水凝胶可以灵活负载这些不同类型的药物，利于协同给药的治疗等应用。本发明实施例可根据药物的不同类型，采用不同的方法制备载药脂质体。在本发明的一些实施例中，考虑到盐酸吉西他滨为亲水性小分子药物，可采用逆向蒸发法制备盐酸吉西他滨脂质体。在本发明的另一些实施例中，可采用薄膜分散法制备紫杉醇脂质体。在本发明的另一些实施例中，可采用逆向蒸发法制备凝血酶脂质体。具体的制备例子如下：
按照质量分数，称取1％～95％中性磷脂材料(或负电荷磷脂材料或正电荷磷脂材料)和0％～50％胆固醇，溶于氯仿等有机溶剂中，形成浓度为0.1～1000mg/mL的脂质溶液。将该溶液转移至茄型瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀脂质薄膜。将亲水性药物配制成浓度为0.001～100mg/mL的药物溶液，用该药物溶液水化脂质薄膜，水化结束后，得到载药脂质体粗乳，通过超声、过膜对脂质体进行整形，得到载药脂质体产物。或者，
按照质量分数，称取1％～95％负电荷磷脂材料(或中性磷脂材料或正电荷磷脂材料)、0％～50％胆固醇和1％～30％亲脂性药物，溶于氯仿等有机溶剂中，形成浓度为0.1～1000mg/mL的脂质溶液。将该溶液转移至茄型瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀脂质薄膜。向茄型瓶中加入水化介质水化(水化介质可选用PBS、去离子水、柠檬酸钠缓冲溶液等)，加入水化介质使得到的水化产物浓度为0.1～300mg/mL。水化结束后，得到载药脂质体粗乳，通过超声、过膜对脂质体进行整形，得到载药脂质体产物。或者，
按照质量分数，称取1％～95％正电荷磷脂材料(或中性磷脂材料或负电荷磷脂材料)和0％～50％胆固醇，溶于氯仿等有机溶剂中，形成浓度为0.1～1000mg/mL的脂质溶液。将该溶液转移至茄型瓶中，旋转蒸发除去有机溶剂，得到均匀脂质薄膜。向该茄型瓶中加入无水乙醚使得脂质材料重新溶解，得到脂质材料浓度为0.1～1000mg/mL。称取蛋白类药物，配制蛋白类药物至浓度为0.001～100mg/mL(介质可选用PBS、去离子水、柠檬酸钠缓冲溶液等)，将该蛋白药物溶液加至溶有脂质材料的无水乙醚中，水浴超声3～30min，得到均匀乳液。旋转蒸发除掉有机溶液后得到胶状产物，加入水化介质水化该胶状产物(介质可选用PBS、去离子水、柠檬酸钠缓冲溶液等)，得到浓度为0.1～30mg/mL的脂质体粗乳。通过超声、过膜对脂质体进行整形，得到载药脂质体产物。
分别得到水凝胶材料和载药脂质体后，本发明实施例将两者共混交联，构建载药脂质体的力学增强型水凝胶。本发明实施例所述脂质体增强型水凝胶优选按照以下步骤制得：水凝胶材料和空白或载药脂质体混合后，在光交联剂存在的条件下，通过紫外光照射进行交联，得到脂质体增强型水凝胶。
在本发明中，所述载药脂质体的加入量为1～150mg/mL水凝胶体系中水，优选为1～120mg/mL，更优选为1mg/mL～60mg/mL，进一步优选为5～60mg/mL，如10mg/mL、15mg/mL、30mg/mL等。例如，每1mL去离子水加入1mg所述载药脂质体，去离子水还可以替换为PBS、柠檬酸钠缓冲溶液等液体。在本发明中，所述空白脂质体的加入量等内容与载药脂质体基本一致。本发明加入适量的脂质体，这样可以保持水凝胶的柔韧性，同时也具有良好的强度。在本发明的实施例中，所述光交联剂优选为光交联剂PI(即2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮)；所述光交联剂的加入量可为水凝胶体系中水质量的0.5～2％(w/w)。例如，每1mL去离子水加入10mg所述光交联剂，去离子水还可以替换为PBS、柠檬酸钠缓冲溶液等液体。本发明优选通过300W紫外灯光照射进行交联，交联的时间可为10～20min，优选为15min～18min。
在本发明的实施例中，所述脂质体增强型水凝胶的平均孔径可为2～10μm，优选为5μm～8μm。所述脂质体增强型水凝胶可简写为Lip-Gel或Lip@Gel，其形貌结构为：脂质体颗粒复合在水凝胶表面及其网络结构中，脂质体的磷脂双分子层和水凝胶分子链缠绕交联，以共价键和/或非共价键结合，从而显著增强水凝胶的压缩、拉伸、扭转、弹性等综合力学性能。
并且，本发明提供一种复合脂质体增强型水凝胶，其主要由水凝胶材料和负载不同类型药物成分的载药脂质体共混交联制得；所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶；所述载药脂质体的加入量总和为1～150mg/mL水凝胶体系中水。
在本发明中，所述复合脂质体增强型水凝胶负载有不同类型的药物成分，具有增强的综合力学性能，并可实现不同类型药物的调控释放。本发明对负载的不同类型或种类的药物比例没有特殊限制，可直接将多种载药脂质体与水凝胶材料进行简易的混合，交联即得。所述复合脂质体增强型水凝胶的组分、形貌结构、来源、制备等内容，与前文单一的脂质体增强型水凝胶的内容近似，在此不再一一赘述。
另外，本发明还提供如上文所述的脂质体增强型水凝胶在制备组织修复和/或疾病治疗药剂中的应用。在本发明的一些实施例中，可通过水凝胶注射方式实现抑制肿瘤生长，也可用于骨修复等。本发明所述的脂质体增强水凝胶可根据疾病及其康复需求按时段给药，不仅为联合用药奠定了基础，而且也为植入性材料功能化奠定了基础，对水凝胶在生物医学领域的拓展应用具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1所得载药脂质体的形态学检测结果图；
图2为实施例2所得载药脂质体的形态学检测结果图；
图3为实施例3所得载药脂质体的形态学检测结果图；
图4为实施例1所得载药脂质体的粒径分布图；
图5为实施例2所得载药脂质体的粒径分布图；
图6为实施例3所得载药脂质体的粒径分布图；
图7为实施例1所得载药脂质体的电位图；
图8为实施例2所得载药脂质体的电位图；
图9为实施例3所得载药脂质体的电位图；
图10为实施例1所得载药脂质体的体外释放结果图；
图11为实施例2所得载药脂质体的体外释放结果图；
图12为实施例3所得载药脂质体的体外释放结果图；
图13为实施例7所得脂质体增强型水凝胶的形态学检测结果图；
图14为实施例8所得脂质体增强型水凝胶的形态学检测结果图；
图15为实施例9所得脂质体增强型水凝胶的形态学检测结果图；
图16为图13中B部分100个孔洞的直径结果图；
图17为图14中F部分100个孔洞的直径结果图；
图18为图15中J部分100个孔洞的直径结果图；
图19为实施例制得的空白脂质体冻干粉不同加入量所引起的水凝胶外观上的变化图；
图20为实施例制得的空白脂质体冻干粉不同加入量所引起的水凝胶流变学的变化结果图；
图21实施例制得的不同空白脂质体水凝胶周期性循环压缩实验的结果(定形变为2.1mm)；
图22为图21的力值-时间结果；
图23为不同加入量空白脂质体水凝胶压力-压缩率的实验结果；
图24为不同加入量空白脂质体水凝胶压缩率的实验结果；
图25为不同加入量空白脂质体水凝胶压缩强度的实验结果；
图26为不同加入量空白脂质体水凝胶压缩模量的实验结果；
图27为加入量为60mg时三种载药脂质体水凝胶应力-应变的实验结果；
图28为加入量为60mg时三种载药脂质体水凝胶压缩率的实验结果；
图29为加入量为60mg时三种载药脂质体水凝胶压缩强度的实验结果；
图30为加入量为60mg时三种载药脂质体水凝胶压缩模量的实验结果；
图31为不同加入量空白脂质体水凝胶应力-拉伸率的实验结果；
图32为不同加入量空白脂质体水凝胶拉伸率的实验结果；
图33为不同加入量空白脂质体水凝胶拉伸强度的实验结果；
图34为不同加入量空白脂质体水凝胶拉伸模量的实验结果；
图35为不同加入量空白脂质体水凝胶的膨胀率；
图36为不同加入量空白脂质体水凝胶的降解率；
图37为20％GelMA所制得的不同水凝胶(GEM@Gel、GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel)的体外释放结果；
图38为10％GelMA所制得的不同水凝胶(GEM@Gel、GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel)的体外释放结果；
图39为PTX-Gel与PTX-Lip60@Gel的体外释放结果；
图40为THR-Gel与THR-Lip60@Gel的体外释放结果；
图41为GEM&PTX&THR-Lip@Gel的体外释放结果；
图42为GEM-Lip@Gel的体外细胞毒性试验结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的脂质体增强型水凝胶及其应用进行具体地描述。以下实施例中，所涉及的实验材料如下：
卵磷脂(CAS:8002-43-5，购自上海麦克林生化科技有限公司)；胆固醇(CAS:57-88-5，购自上海麦克林生化科技有限公司)；紫杉醇(批号：DH20130201，购自武汉大华伟业医药化工有限公司)；盐酸吉西他滨(CAS:122111-03-9，购自美仑生物)；凝血酶(批号:20151101，购自浙江杭康药业有限公司)；三氯甲烷(批号:20160523，购自上海凌峰化学试剂有限公司)；二氯甲烷(批号:20160331购自国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醚(批号:20161103，购自国药集团化学试剂有限公司)0.22μm、0.45μm针式过滤器(购自芯硅谷)；明胶(批号:180LB8，购自罗赛洛(大安)明胶有限公司)；甲基丙烯酸酐(CAS:760-93-0，购自阿拉丁试剂)；透析袋(截留分子量8000-14000、截留分子量3500，购自上海源叶生物科技有限公司)；超滤离心管(截留分子量3000、截留分子量100000，购自Millipore)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天)；甲醇、乙酸铵、冰乙酸(批号:20160701，购自国药集团化学试剂有限公司)；2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(CAS:106797-53-9，购自百灵威科技有限公司)。
实施例1、载药脂质体制备
考虑到盐酸吉西他滨为亲水性小分子药物，采取逆向蒸发法制备盐酸吉西他滨脂质体。称取200mg卵磷脂和50mg胆固醇，溶于3mL无水乙醚中。待充分溶解后，将该乙醚溶液转移至250mL茄型瓶中。称取50mg盐酸吉西他滨溶于2mL去离子水中，配制成浓度为25mg/mL的盐酸吉西他滨水溶液。在500rpm/min的搅拌条件下，向上述茄型瓶内逐滴加入盐酸吉西他滨水溶液共计1mL，滴加结束后水浴超声3min，得到稳定的乳液。将得到的乳液于10℃水浴减压蒸发除去有机溶剂，得到胶状产物。向所述茄型瓶中加入4mL预热至50℃的去离子水，水化1h后进行超声处理，超声时间为3min、功率为10％，工作2s停1s。超声结束后依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜，得到盐酸吉西他滨脂质体溶液，加入适量海藻糖作为冻干保护剂进行冻干，冻干保护剂用量为每1mL脂质体溶液加5mg～30mg，冻干工艺具体内容：于-80℃冰箱预冻过夜，压力为5.4Pa(以下实施例中的冻干工艺与此相同)，得到盐酸吉西他滨脂质体冻干粉(Gemcitabine-Lips，简称GEM-Lip冻干粉)。
实施例2、载药脂质体制备
采取薄膜分散法制备紫杉醇脂质体，具体如下：称取80mg卵磷脂、20mg胆固醇和6mg紫杉醇加入茄型瓶，再加入适量氯仿(溶解后脂质材料浓度为2～5mg/mL)充分溶解。将该氯仿溶液置于40℃水浴，减压旋转蒸发除去有机溶剂，在所述茄型瓶的内壁形成蜂窝状薄膜。向该茄型瓶中加入20mL预热至60℃的去离子水，然后于60℃水浴磁力搅拌1.5h，转速为200rpm/min。将所得产物进行超声处理，超声时间为3min，超声功率为40％，工作2s停1s。超声结束后依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜，得到紫杉醇脂质体溶液，加入适量海藻糖作为冻干保护剂进行冻干，得到紫杉醇脂质体冻干粉(Paclitaxel-Lips，简称PTX-Lip冻干粉)。
实施例3、载药脂质体制备
采用逆向蒸发法制备凝血酶脂质体，具体如下：称取200mg卵磷脂和50mg胆固醇，溶于3mL无水乙醚中。待充分溶解后，将该乙醚溶液转移至250mL茄型瓶中。将凝血酶冻干粉配制成浓度为1000D/mL的凝血酶溶液，在500rpm/min的搅拌条件下，向上述茄型瓶内逐滴加入凝血酶溶液共计1mL，滴加结束后水浴超声3min，得到稳定的乳液。将得到的乳液在10℃水浴减压蒸发的条件下，除去有机溶剂，得到胶状产物。向所述茄型瓶中加入4mL预热至37℃的去离子水，水化1h后进行超声处理，超声时间为3min、功率为10％，工作2s停1s。超声结束后依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜，得到凝血酶脂质体溶液，加入适量海藻糖作为冻干保护剂进行冻干，得到凝血酶脂质体冻干粉(Thrombin-Lips，简称THR-Lip冻干粉)。
实施例4、载药脂质体粒径及形貌
1粒径分布及电位：分别取适量实施例1～3中的盐酸吉西他滨脂质体溶液、紫杉醇脂质体溶液、凝血酶脂质体溶液，稀释至合适浓度，通过动态光散射粒度分散仪(DLS，Zetasizer，Malvern，Nano-ZS90)对其粒径分布以及电位进行测量。
2形态表征：将数个铜网放在覆有滤纸的表面皿中，分别滴加20μL实施例1～3中的盐酸吉西他滨脂质体溶液、紫杉醇脂质体溶液、凝血酶脂质体溶液于铜网上。5min后吸去多余液体，分别向各个铜网上滴加20μL 2wt％磷钨酸溶液，5min后吸去磷钨酸溶液。当铜网上的溶剂挥发完以后，采用透射电子显微镜(FEI Tecnai G-20)观察载药脂质体形貌。
利用扫描式电子显微镜(SU5000)对冷冻干燥后脂质体冻干粉的表面情况进行评价，分别取少量实施例1～3中的盐酸吉西他滨脂质体冻干粉、紫杉醇脂质体冻干粉、凝血酶脂质体冻干粉固定在导电铜板上，采用离子溅射仪上喷金，然后通过扫描电镜观察并采集图像。
为了对GEM-Lip，PTX-Lip以及THR-Lip这三种脂质体进行表征，本申请运用SEM、TEM、DLS等检测手段对其粒径分布、电位及形态学进行了检测。三种不同脂质体的形态学检测结果分别如图1～3所示，图1～3中，A、G、M部分为三种脂质体的结构示意，其中盐酸吉西他滨脂质体与凝血酶脂质体都是将药物包载在内水相中，紫杉醇脂质体是将药物包载在磷脂双分子层中。B、H、N部分为三种脂质体的扫描电镜结果，由该结果可以看出这三种脂质体均外观圆整，粒径大小符合粒径分布统计结果。C、I、O部分为三种脂质体的透射电镜结果，其中颜色较浅部分为磷脂双分子层，颜色较深部分为内水相，由该结果可以看出三种脂质体均有明显的双分子层结构。
图4～6分别为三种脂质体的粒径分布结果，由图4～6可以看出，盐酸吉西他滨脂质体、紫杉醇脂质体、凝血酶脂质体的平均粒径分别为156.5±4.3nm、146.7±3.9nm、249.8±2.6nm。这三种脂质体的粒径分布为均一单峰，说明其分散性良好。
图7～9为三种脂质体的电位分布结果，由图7～9可以看出，盐酸吉西他滨脂质体、紫杉醇脂质体和凝血酶脂质体的平均电位分别为-4.98±0.68mV、0.481±0.43mV和-12.5±1.49mV。这些平均电位的差异，可能是因为药物本身带负电，而由于脂质体包封率的不同导致了游离的药物含量的不同，所以也就导致了平均电位的差异。
实施例5、载药脂质体包封率及体外释放
实施例1制得的盐酸吉西他滨脂质体包封率及体外释放考察具体如下：采取超滤离心法对盐酸吉西他滨脂质体中未包封的药物进行分离，并通过HPLC对其进行检测，以此来确定盐酸吉西他滨脂质体的包封率。取1mL盐酸吉西他滨脂质体置于超滤离心管上层(截留分子量为3000)，离心5min转速5000rpm/min，离心结束后向上层加入1mL去离子水，再次离心5min转速5000rpm/min，反复3次。取下层液体，通过岛津LC-2010A高效液相色谱仪对其进行检测。取5mL盐酸吉西他滨脂质体溶液置于截留分子量为3500的透析袋中，用棉线将两端系紧，剪去多余棉线以及透析袋。将透析袋浸没于35mL PBS中，于37℃恒温摇床中对其进行体外释放考察，摇床转速为100rpm/min。在预定时间点0.5h、2h、4h、6h、12h、24h从释放介质中取出1mL样品，并向其中补充1mL PBS，通过HPLC对样品进行检测。HPLC条件为，流动相：0.05mol/L醋酸铵缓冲液：甲醇(90:10)，流速1mL/min，检测波长268nm，柱温30℃。
采取超滤离心法对实施例2制得的紫杉醇脂质体中未包封的药物进行分离，并通过HPLC对其进行检测，以此来确定紫杉醇滨脂质体的包封率。取1mL紫杉醇脂质体置于超滤离心管上层(截留分子量为3000)，离心5min转速5000rpm/min，离心结束后向上层加入1mL去离子水，再次离心5min转速500rpm/min，反复3次。取下层液体，通过HPLC对其进行检测。取1mL紫杉醇脂质体置于截留分子量为3500的透析袋中，用棉线将两端系紧，剪去多余棉线以及透析袋。将透析袋浸没于3mL PBS中，于37℃恒温摇床中对其进行体外释放考察，摇床转速为100rpm/min，在预定时间点更换全部释放介质。用1mL二氯甲烷对3mL释放介质进行萃取，静置分层后弃去上清，除去二氯甲烷，用流动相重新溶解后通过HPLC测定其含量。HPLC条件为：甲醇：水(70:30)，流速1mL/min，检测波长227nm，柱温30℃。
采取超滤离心法对实施例3制得的凝血酶脂质体中未包封的药物进行分离，并通过BCA对其进行检测，以此来确定紫杉醇滨脂质体的包封率。取1mL凝血酶脂质体置于超滤离心管上层(截留分子量为100000)，离心5min转速5000rpm/min，离心结束后向上层加入1mL去离子水，再次离心5min转速500rpm/min，反复3次。取下层液体，通过BCA对其进行检测。取5mL凝血酶脂质体溶液置于截留分子量为100000的透析袋中，两端夹紧。将透析袋浸没于50mL释放介质中，于37℃恒温摇床中对其进行体外释放考察，摇床转速为100rpm/min，在预定时间点从释放介质中取出0.3mL样品，并向其中补充0.3mL PBS，通过BCA对样品进行检测。
为了进一步地对这三种不同脂质体进行表征，本申请通过超滤离心法对未包封药物进行了分离，并通过高效液相以及BCA的方法对包封率进行了检测。测量结果为：盐酸吉西他滨脂质体包封率为60.3±2.8％，紫杉醇脂质体包封率为90.6±1.2％，凝血酶脂质体包封率为28.3±4.9％。
盐酸吉西他滨和凝血酶均为水溶性药物，由于磷脂膜的流动性等原因而导致内水相所包封的药物较易泄露，所以两者的包封率均较低。相比盐酸吉西他滨脂质体的包封率而言，凝血酶脂质体的包封率更低一些，这可能是因为凝血酶为生物大分子，相较于水溶性小分子而言有着更大的空间位阻，因此更加难以包载进脂质体的内水相。紫杉醇为脂溶性药物，脂质体将其包载于磷脂双分子层之间，双分子层的内侧及外层均为水相，由于药物本身的疏水性，也就使得药物与双分子层可以紧密结合，从而获得了较高的包封率。
这三种脂质体的体外释放结果如图10～12所示，图10为盐酸吉西他滨脂质体的体外释放结果，可以看出药物在最初的4小时的突释效果十分明显，0～4小时的累计释放率高达85％，在4～24小时的累计释放率约为15％，24～48小时基本无药物释放，药物的持续体外释放时间约为24小时。这可能是盐酸吉西他滨为水溶性小分子，较易随着磷脂双分子层的运动而泄露，从而导致盐酸吉西他滨的泄露速率较快，使得突释明显且总体释放时间较短。
图11为紫杉醇脂质体的体外释放结果，最初4小时的药物累计释放率约为11％，无明显药物突释；在48小时内药物的累计释放率约为46％。48小时药物累计释放率仅为46％，可能是因为紫杉醇为脂溶性药物，被包载进磷脂双分子层内，药物与磷脂双分子层的亲和性远远大于其与水的亲和性，即便脂质体破裂药物仍然包载于脂质材料中，难以释放入介质。
图12为凝血酶脂质体的体外释放结果，在最初0.5小时内的累计释放约为37％，在0.5～24小时的累计释放率约为37％，在24～48小时的累计释放率约为4％。其在最初0.5小时内的突释现象可能是因为凝血酶脂质体的包封率较低仅为28.3％，大量药物未被包封进脂质体，游离在脂质双分子层之外，进行体外释放实验时很快地透过透析袋进入释放介质中。0.5～24小时这一阶段的释放较为稳定，推测应以被包封进脂质体内水相的凝血酶药物的释放为主。
综合图10～12可以看出，这三种脂质体有着不同的释放特性，为将三种脂质体共载于GelMA等水凝胶内实现三种药物的分阶段释放提供了基础。
实施例6、GelMA的制备
称取20g明胶，加入到2L锥形瓶中并加入200mL PBS。将该锥形瓶置于60℃水浴中，搅拌至明胶完全溶解。待明胶完全溶解后，向该锥形瓶内逐滴加入甲基丙烯酸酐共计16mL，整个滴加过程持续1h。滴加结束2h后，将预热至50℃的800mL PBS加入到上述锥形瓶中，再持续搅拌15min。15min后将锥形瓶内的液体倒入透析袋中(截留分子量为8000-14000)，透析过程一周。一周后收集透析袋内的液体，将液体预热至60℃，用孔径为0.22μm的微孔滤膜趁热对其进行过滤。将过滤后所得的液体于-80℃预冻过夜，进行冷冻干燥，得到GelMA材料。
实施例7、GEM-Lip@Gel的制备
称取实施例1中的GEM-Lip冻干粉30mg、60mg、120mg，并将其分别溶于1mL去离子水中，待充分溶解后分别加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向每份溶液中分别加入200mg实施例6制得的GelMA，配制成GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel溶液(GelMA浓度为20％：20％为质量分数，即1mL去离子水溶解200mg GelMA，则GelMA浓度为20％)，作为实验组。精密称取3mg盐酸吉西他滨药物粉末(约相当于60mg盐酸吉西他滨脂质体冻干粉中所含盐酸吉西他滨药物的量)将其溶解于1mL去离子水中，待充分溶解后加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制GEM-Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为对照组。将实验组和对照组配制好的溶液分别置于模具中，在300W紫外光照下进行交联，交联时间为18min。最后经冷冻干燥，得到各自的冻干粉产物。
另外，制备GelMA浓度为10％的，GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel以及GEM-Gel，具体制作步骤同上。
实施例8、PTX-Lip@Gel的制备
称取实施例2中的PTX-Lip冻干粉60mg，并将其溶解于1mL去离子水中，待充分溶解后加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制成PTX-Lip@Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为实验组。称取1mg紫杉醇药物粉末(约相当于60mg紫杉醇脂质体冻干粉中所含紫杉醇药物的量)，将其分散于1mL去离子水中，再加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制成PTX-Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为对照组。将实验组和对照组配制好的溶液分别置于模具中，在300W紫外灯下进行光照交联，交联时间为18min。最后经冷冻干燥，得到各自的冻干粉产物。
实施例9、THR-Lip@Gel的制备
称取实施例3中的凝血酶脂质体冻干粉60mg，并将其溶解于1mL去离子水中，待充分溶解后分别加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制成THR-Lip@Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为实验组。配制浓度为100D/mL的凝血酶溶液(约相当于60mg凝血酶脂质体冻干粉中所含凝血酶药物的量)，从中取1mL加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制成THR-Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为对照组。将实验组和对照组配制好的溶液分别置于模具中，在300W紫外灯下进行光照交联，交联时间为18min。最后经冷冻干燥，得到各自的冻干粉产物。
实施例10、GEM&PTX&THR-Lip@Gel的制备
分别称取实施例1～3中的GEM-Lip冻干粉60mg、PTX-Lip冻干粉60mg、THR-Lip冻干粉60mg，并将其溶解于3mL去离子水中，待充分溶解后分别加入30mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入600mg实施例6制得的GelMA，配制成GEM&PTX&Thr-Lip@Gel溶液，将配制好的溶液置于模具中，在300W紫外灯下进行光照交联，交联时间为18min。最后经冷冻干燥，得到冻干粉产物。
实施例11、空白脂质体水凝胶制备
空白脂质体的制备：采取乙醇注入法制备空白脂质体。称取200mg卵磷脂和50mg胆固醇，溶于3mL无水乙醇中。另量取10mL～50mL去离子水，将溶有脂质材料的无水乙醇溶液在水浴26℃～60℃磁力搅拌100rpm～800prm的条件下，逐滴加入去离子水中。待醇味挥尽时，得到空白脂质体粗乳。对其进行超声处理，超声时间为3min、功率为10％，工作2s停1s。超声结束后依次通过0.45μm、0.22μm微孔滤膜，得到空白脂质体溶液，加入适量海藻糖作为冻干保护剂进行冻干，冻干保护剂用量为每1mL脂质体溶液加5mg～30mg，冻干工艺具体内容：于-80℃冰箱预冻过夜，压力为5.4Pa，得到空白脂质体冻干粉(liposome，简称Lip冻干粉)。
称取空白脂质体冻干粉30mg、60mg、120mg，并将其分别溶于1mL去离子水中，待充分溶解后分别加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向每份溶液中分别加入200mg实施例6制得的GelMA，配成Lip30@Gel、Lip60@Gel、Lip120@Gel溶液(GelMA浓度为20％)，作为实验组。移取1mL去离子水，加入10mg光交联剂PI，当PI充分溶解后向溶液中加入200mg实施例6制得的GelMA，配制GelMA溶液(GelMA浓度为20％)，作为对照组。
实施例12、Lip-Gel的形态学考察
利用扫描电子显微镜对冷冻干燥后脂质体水凝胶的表面情况进行评价，分别切取实施例7～9中的GEM-Lip@Gel、PTX-Lip@Gel、THR-Lip@Gel的薄片固定在导电铜板上，采用离子溅射仪上喷金，然后通过扫描电镜观察并采集图像。
通过SEM等对GEM-Lip@Gel，PTX-Lip@Gel、THR-Lip@Gel这三种脂质体水凝胶进行观察，验证载药脂质体的成功装载。结果如图13～15所示，图13～15中，A、E、I部分分别为这三种脂质体复合进GelMA水凝胶网络结构的示意。B、F、J部分分别为GEM-Lip@Gel水凝胶、PTX-Lip@Gel水凝胶、THR-Lip@Gel水凝胶的SEM宏观结果，C、G、K部分分别为B、F、J部分中方框区域放大后的TEM结果。
由图13～15中B、F、J部分可以看出，这三种复合有不同脂质体的GelMA水凝胶有着相似的形态学特征，孔洞均较为圆整、壁薄、大小较为均一。由图13～15中C、G、K部分可以看出均有球形颗粒，经粒径测量发现，GEM-Lip@Gel、PTX-Lip@Gel、THR-Lip@Gel中颗粒粒径分别为131.3nm、140.6nm和139.6nm，这些颗粒外观较为圆整，且粒径大小符合脂质体的粒径大小，因此推断其为与GelMA复合成胶的脂质体。脂质体在GelMA溶液中均匀分布，经过紫外光照后，与GelMA一同构成水凝胶骨架，因此可以在复合了脂质体的GelMA水凝胶孔洞表面看到突出的脂质体颗粒。
在图13～15的B、F、J部分中各自随机选取100个孔洞测量其直径，所得结果如图16～18所示，图16～18分别为在图13～15的B、F、J部分中各自随机选取100个孔洞测量其直径所得结果。其中，GEM-Lip@Gel、PTX-Lip@Gel、THR-Lip@Gel的平均孔径分别约为5.52μm、5.53μm、5.58μm，可见不同脂质体的加入对于水凝胶的孔径大小及其分布并未造成明显影响。
实施例13、Lip-Gel的力学性能考察
通过衡翼力学测试仪对实施例制得的Lip-Gel各组以及GelMA进行压缩、拉伸、周期性循环实验的考察，通过流变仪对上述Lip-Gel各组以及GelMA进行动态频率扫描的考察。为了考察脂质体的加入对于水凝胶力学性能的影响，本申请通过万能力学测试仪以及流变仪对不同水凝胶进行了流变学、周期性循环压缩实验、拉伸以及压缩的系列考察，结果如图19～34所示。
图19为实施例制得的空白脂质体冻干粉不同加入量所引起的水凝胶外观上的变化图，由图19可见，随着空白脂质体冻干粉加入量从0mg增加至120mg，水凝胶的外观由透明转变为乳白色随后乳白色加深，这可能是因为脂质体的引入为水凝胶带来了脂质体特有的乳光，随着脂质体加入量的增加使得乳光的程度也有所增加，从而对于水凝胶的外观造成了影响。
图20为实施例制得的空白脂质体冻干粉不同加入量所引起的水凝胶流变学的变化结果图，可以看出Lip-Gel各组的储能模量较GelMA有了明显的提高，由GelMA的1600kPa提升至Lip30@Gel的2000kPa、Lip60@Gel的2500kPa、Lip120@Gel的1800kPa。
图21和图22为实施例制得的不同空白脂质体水凝胶周期性循环压缩实验的结果，图21为在定形变为2.1mm时，对不同水凝胶进行800s的循环压缩所得的力值-变形结果，图22为力值-时间结果。结合图21、22可以看出，在定形变为2.1mm时，随着循环次数的增加，GelMA的力值-变形中力值从4.5N渐渐降至3.4N，从而造成了力值-变形不能沿着同一轨迹，力值-时间结果中也展现出力值随着循环次数的增加由4.5N逐渐降至3.4N，这可能是因为在循环压缩中，GelMA分子之间的三维水凝胶网格在外力作用下被渐渐破坏，在宏观上的表现则为胶体的碎裂以及受力下降。Lip-Gel各组的力值-变形均沿着同一轨迹，Lip30-Gel、Lip60-Gel、Lip120-Gel各组的力值-时间结果中，力值分别稳定在8.2N、9.3N、5.6N处，不会随着循环次数的增加而改变。可以判断在循环压缩实验中Lip-Gel各组可以保持水凝胶的完整性不出现碎裂，且有着较好的回弹性。
图23～26和图27～30为不同水凝胶的压缩实验结果，图23～26为空白脂质体冻干粉不同加入量所引起的水凝胶压缩性能方面差异的实验结果；图27～30为三种载药脂质体冻干粉加入量为60mg时水凝胶压缩性能方面的实验结果。由图23、24可以看出，随着脂质体的加入使得GelMA的可压缩能力有了极大的提升，Lip-Gel各组的最大压缩百分率在60％左右，较GelMA的压缩率在50％左右有着显著差异。图26为压缩模量的结果，模量分别为GelMA13665Pa，Lip30-Gel 19320Pa，Lip60-Gel 24230Pa，Lip120-Gel 17918.4Pa。综合上述，相较于GelMA来说，Lip-Gel各组的压缩性能得到了提升。
图27为应力-应变实验结果，图28为压缩百分率的量化结果，图29为压缩强度的量化结果，图30为压缩模量结果；由图27～30可以看出，Lip60-Gel与GEM-Lip60@Gel、PTX-Lip60@Gel、THR-Lip60@Gel各组之间在压缩百分率、压缩强度以及压缩模量方面没有明显差异。说明不同药物装载后的脂质体复合到水凝胶中，不影响空白脂质体增强水凝胶的力学性能。
图31～34为不同水凝胶的拉伸实验结果。由图31、32可以看出，随着脂质体的加入使得GelMA的可拉伸能力有了极大的提升，Lip-Gel各组的最大拉伸百分率在25％左右，较GelMA的拉伸率在8％左右有着显著差异。由图31、33可以看出，随着脂质体的加入使得GelMA的强度有了极大提升，Lip-Gel各组的拉伸强度较GelMA均有显著性差异，Lip-Gel各组中Lip60-Gel有着较Lip30-Gel以及Lip120-Gel有着更强的拉伸强度。图33为弹性模量的结果，GelMA 15244Pa，Lip30-Gel 20306Pa，Lip60-Gel 28806Pa，Lip120-Gel 18444Pa。因此，相较于GelMA来讲Lip-Gel各组有着显著提升的拉伸性能，在Lip-Gel各组中，Lip60-Gel有着最优异的力学性能。
在成胶过程中GelMA溶液中复合脂质体，通过紫外光照交联，使得GelMA分子之间形成相互交联的水凝胶网格，而脂质体在这些网格中间由于氢键、静电作用等非共价键作用力与GelMA分子之间再形成微交联，从而提高了GelMA的交联程度，使得Lip-Gel的力学性能有了极大地提升。当有外力作用于Lip-Gel时，微交联结构可以很好地分担外力，从而减轻骨架的受力，极大程度的维持胶体的形态，提高胶体的形变率，使得胶体在破碎之前可承受更大的外力，以及更大的形变量。相较于Lip120-Gel与Lip30-Gel，Lip60-Gel有着更优异的性能，主要是因为Lip30-Gel由于脂质体的加入量较少，与GelMA分子之间形成微交联的程度较低，从而力学性能较Lip60-Gel更弱一些。而Lip120-Gel加入脂质体的量过多，使得脂质体之间融合或形成疏水键，从而降低其与GelMA分子之间形成微交联的程度。综上可得，脂质体可以在GelMA分子之间进一步形成微交联，从而提高Lip-Gel的力学性能，使其在兼具柔韧性的同时也具有良好的强度，并且不同种类药物的引入并不会对整个增强体系的力学性能造成影响，这使得Lip-Gel可作为植入体的理想材料。
实施例14、Lip-Gel的吸水性及降解性
将制备而得的Lip-Gel各组以及GelMA冷冻干燥后，得到其冻干样品。对各组的冻干样品进行称重，称重后将各组样品置于适量PBS中，于预设时间点0.5h、2h、4h、6h、8h、24h、48h，将样品从PBS中取出，擦干其表面进行称重，每次称重结束后都将样品重新放回PBS中，根据其重量变化绘制吸水性曲线。
将制备而得的Lip-Gel各组以及GelMA进行称重，称重后将各组样品放入适量PBS中，于预设时间点，将样品从PBS中取出，擦干其表面进行称重，每次称重结束后都将样品重新放回PBS中，根据其重量变化绘制降解曲线。
为了对Lip-Gel的性能进行进一步地表征，本申请通过称重的方法对不同水凝胶的吸水性及降解性进行了考察，结果如图35～36所示。图35为不同水凝胶的膨胀率，在24小时，水凝胶的膨胀率基本稳定，吸水达到饱和，此时GelMA、Lip30-Gel、Lip60-Gel、Lip120-Gel水凝胶吸水后的质量分别膨胀为原始重量的545％、479％、427％、344％。图36为不同水凝胶的降解率，在预定时间点对各组水凝胶进行称重计算得到降解率，在第90天时GelMA水凝胶的降解率为73.8％，随着空白脂质体冻干粉的增加，Lip-Gel各组的降解率较GelMA发生了降低，Lip30-Gel、Lip60-Gel、水凝胶的质量分别降解为原始质量的82.8％、85.3％，而Lip120-Gel的降解率并未进一步降低。
结合图35、36分析得，随着空白脂质体冻干粉的增加，脂质体与水凝胶网络之间相互缠绕，Lip-Gel相较于GelMA有了更高的交联度，从而使得水分难以进入水凝胶内部，导致Lip-Gel各组水凝胶膨胀率的降低。由于交联作用的增强，使得水分较难进入水凝胶内部，减少了液体对于水凝胶骨架的溶蚀作用，这也就使得Lip-Gel各组较GelMA水凝胶有着较慢的降解速率，但是当过多空白脂质体冻干粉被引入水凝胶骨架中，而长时间的浸泡使得脂质体破裂，这也就有可能在水凝胶的骨架中形成微小的孔隙，从而增加了浸入水凝胶骨架的液体量，使得液体对于水凝胶的溶蚀作用加强，所以也就使得Lip120-Gel虽然有着较高的交联度但是其降解速率并未进一步降低。综上，Lip60-Gel有着较低的膨胀率，使其在接触液体之后发生的形变较GelMA更低，且其降解速率较GelMA也更低，这为其作为植入材料奠定了良好的基础。
实施例15、Lip-Gel的体外释放考察
将制备而得的GEM-Lip@Gel各组作为实验组，GEM-Gel作为对照组，浸没于15mLPBS中，于37℃转速为100rpm/min的恒温摇床中进行体外释放实验。在预定时间点0.5h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、96h，更换全部的释放介质，通过HPLC对样品进行检测。将制备而得的PTX-Lip@Gel作为实验组，PTX-Gel作为对照组，浸没于3mL PBS中，于37℃转速为100rpm/min的恒温摇床中进行体外释放实验。在预定时间点，更换全部释放介质。用1mL二氯甲烷对3mL释放介质进行萃取，静置分层后弃去上清，除去二氯甲烷，用流动相重新溶解后通过HPLC测定其含量。将制备而得的THR-Lip@Gel作为实验组，THR-Gel作为对照组，浸没于3mLPBS中，于4℃进行体外释放。在预定时间点从中取出300μL作为样品，再向其中补充300μL新鲜介质，通过BCA对蛋白浓度进行测定。将制备而得GEM&PTX&THR-Lip@Gel浸没于3mL PBS中，于4℃进行体外释放考察，并通过HPLC以及BCA对释放结果进行考察。
为了探究Lip-Gel的体外释放性能，通过模拟体外释放环境结合透析的方法对不同Lip-Gel的体外释放进行模拟，并通过高效液相和BCA试剂盒的方法对其体外释放结果进行检测，结果如图37～41所示。在图37中，A部分为20％GelMA所制备而得的不同水凝胶(GEM@Gel、GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel)的体外释放结果。B部分为GEM@Gel释药示意、C部分为GEM-Lip@Gel释药示意。由图37中B、C可以看出，GEM@Gel中药物随着水凝胶网络的破裂而释放出来，GEM-Lip@Gel各组中药物先从脂质体中释放到水凝胶网络中，再从水凝胶网络中释放入释放介质。
根据其释放性质，将其体外释放过程划分为三个阶段，在阶段一(0h～4h)时，GEM@Gel的累积释放百分率为79.6％，GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel的累计释放百分率分别为40.2％、35.9％、47.9％，此阶段GEM@Gel的累积释放百分率远高于GEM-Lip@Gel各组。在阶段二(4h～24h)时，GEM@Gel的累积释放百分率为19.2％，GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel和GEM-Lip120@Gel的累计释放百分率分别为35.4％、37.1％、46.9％，此阶段GEM@Gel的累积释放百分率低于GEM-Lip@Gel各组。在阶段三(24h～96h)时，GEM@Gel的累积释放百分率为0.02％，GEM-Lip30@Gel、GEM-Lip60@Gel、GEM-Lip120@Gel的累计释放百分率分别为9.65％、22.22％、5.82％，此阶段GEM-Lip@Gel各组的累计释放率远高于GEM@Gel。由于所载药物为水溶性小分子，所以GEM@Gel的药物累计释放时间较短约为12小时，相较于GEM@Gel，GEM-Lip@Gel各组的药物累计释放时间较长约为48小时，这是因为药物被包载于脂质体中，而脂质体均匀的分散在水凝胶骨架中，随着脂质体的泄露以及水凝胶骨架的溶蚀作用，药物经过双重屏障被释放出来，所以延长了释药时间，且减弱了突释效果。并且根据累计释放曲线观察，不同吉西他滨脂质体冻干粉的加入量并不会显著影响药物的释放特性。
图38为10％GelMA所制备而得的不同水凝胶的体外释放结果，B部分为GEM@Gel释药示意、C部分为GEM-Lip@Gel释药示意。由图38中B、C可以看出，相较于20％GelMA所制备而得的不同水凝胶，10％GelMA所制备而得的不同水凝胶所具有的水凝胶网络更为稀疏，但释放机制并没有明显不同。根据其释放性质，将其体外释放过程划分为三个阶段。在阶段一(0h～4h)时，GEM@Gel的累积释放百分率为94.9％，GEM30-Lip@Gel、GEM60-Lip@Gel、GEM120-Lip@Gel的累计释放百分率分别为48.8％、43.9％、55.7％，此阶段GEM@Gel的累积释放百分率远高于GEM-Lip@Gel各组。在阶段二(4h～24h)时，GEM@Gel的累积释放百分率为5.1％，GEM30-Lip@Gel、GEM60-Lip@Gel、GEM120-Lip@Gel的累计释放百分率分别为49.4％、48.9％、39.1％，此阶段GEM-Lip@Gel各组的累计释放率远高于GEM@Gel。在阶段三(24h～48h)时，各组均基本无药物释放。在该GelMA浓度下，GEM@Gel的药物累计释放时间约为4小时，GEM-Lip@Gel各组的药物累计释放时间约为24小时，相较于20％GelMA浓度下各组的释放时间有着明显的缩短。这可能是因为当GelMA浓度较高时，水凝胶网络之间的连接比较紧密，从而可以减缓药物的释放速率。GEM-Lip@Gel各组仍然比GEM@Gel的释放时间更长，突释效果更弱，原因如上所述。
如图39所示，A部分为PTX-Gel与PTX-Lip60@Gel的体外释放结果，B部分为PTX@Gel释药示意、C部分为PTX-Lip60@Gel释药示意。由图39中B、C可以看出，在PTX-Gel中，药物在水凝胶网络中分散不均，随着水凝胶网络的破裂药物不能很好的分散进入释放介质，而在PTX-Lip60@Gel药物随脂质体均匀的分散于水凝胶网络中，随着水凝胶网络的破裂以及脂质体的破裂，药物可以很好地分散进入释放介质。
前24小时PTX-Gel的累积释放百分率为14.6％，PTX-Lip60@Gel为18.0％；1d～15d，PTX-Gel的累积释放百分率为15.8％，PTX-Lip60@Gel为16.66％；15d～35d，PTX-Gel的累积释放百分率为4.7％，PTX-Lip60@Gel为9.66％，35d内PTX-Gel累计释放35.1％，PTX-Lip60@Gel累计释放44.3％。PTX是一种脂溶性药物，在水中会自发团聚，因此，Gel中直接混合的PTX，在水凝胶中分布不均匀且易团聚，从而难以释放出来。而PTX-Lip60@Gel是将PTX-Lip均匀分散在GelMA中构成的，由于Lip和GelMA具有良好的相容性，从而提高了PTX-Lip的分散性，解决了PTX的团聚难题，PTX随着脂质体的泄露以及水凝胶骨架的降解而释放出来，提高了药物的释放和利用度。
如图40所示，A部分为THR-Gel与THR-Lip60@Gel的体外释放结果，B部分为THR@Gel释药示意、C部分为THR-Lip60@Gel释药示意。由图40中B、C可以看出，在THR@Gel中，THR均匀分散于水凝家网络中，且随着水凝胶网络的破裂进入释放介质中，在THR-Lip60@Gel中，THR随着水凝胶的破裂释放进入水凝胶网络，并且随着网络结构的破裂释放进入介质中。
在最初的24小时，THR-Gel的累计释放率为62.2％，THR-Lip60@Gel为37.8％；1d～7d THR-Gel的累计释放率为30.2％，THR-Lip60@Gel为38.8％；7d～15d THR-Gel的累计释放率为1.4％，THR-Lip60@Gel为15.4％，THR-Gel持续释放约7d，THR-Lip60@Gel持续释放约11天。可以看出将凝血酶与GelMA简单共混制得的THR-Gel在最初24h有着明显的突释，而将凝血酶制备成脂质体后与GelMA混合制得的THR-Lip@Gel则大幅度的降低了最初24h的突释，减缓了药物释放的速率，使得药物在体外的释放时间得以延长。
为了进一步探究Lip-Gel载药体系，本申请将三种不同脂质体同时复合进GelMA水凝胶，构建了同时负载有三种不同性质药物的Lip-Gel，并通过高效液相色谱和BCA试剂盒的方法对其体外释放结果进行检测，结果如图41所示，B、C部分为GEM&PTX&THR-Lip@Gel释药示意。由图41中B、C可以看出，三种不同脂质体均匀分散在水凝胶网络中，药物随着脂质体的破裂释放进水凝胶网络中，并随着网络的破裂释放入介质。由图41可以看出，GEM-Lip@Gel体外释放时间最短，约为2d、Thr-Lip@Gel体外释放时间次之，约为11天，PTX-Lip@Gel体外释放时间最长，约为35天。
该体外释放结果与三种复合脂质体的GelMA水凝胶单独释放没有明显差异，证明将三种不同脂质体复合于同一个GelMA水凝胶内进行体外释放，不会影响各自的药物释放特性。该水凝胶复合载药体系可以实现不同性质药物的分期释放，水溶性小分子药物的前期释放、生物大分子的中期释放以及脂溶性药物的长效释放，若将其用于骨修复可将模型药物更换成水溶性小分子去铁胺的前期释放促进成血管化、生物活性因子BMP-2的前中期促成骨作用，以及地塞米松的长期促成骨作用。该载药模型可满足不同类型药物的分期释放，可根据疾病康复需求按时段给药，为联合用药奠定了基础、也为植入性材料功能化奠定了基础。
实施例16
1细胞活力检测：收集GEM-GelMA，GEM-Lip30@Gel，GEM-Lip60@Gel，GEM-Lip120@Gel 0～4h、4～24h、24～96h的浸出液，检测其对MG63细胞活力的影响。使用各组的浸出液在96孔板上培养MG63细胞(10000细胞/孔)。在培养的第1天使用CCK-8检测细胞的活力。具体过程为：去除培养液，用PBS清洗2次，接着向每个样本中加入100μL培养基和10μL CCK-8试剂，放入37℃培养箱2小时。最后用酶标仪在450nm波长下读出吸光度的数值。
2活死细胞染色：收集GEM-GelMA，GEM-Lip30@Gel，GEM-Lip60@Gel，GEM-Lip120@Gel 0～4h、4～24h、24～96h的浸出液，使用各组的浸出液在96孔板上培养MG63细胞(10000细胞/孔)。培养一天后，去除培养基，用PBS溶液清洗纤维支架3次，然后将配制好的活死染色溶液(将5μL钙黄绿素和20μL溴乙非啶豪莫二聚体，加入到10mL PBS中)加入到样品中，每个样品200μL，室温孵育30min，去除染色溶液，PBS清洗3次，拍照。
3体外细胞毒性试验结果：为了进一步探究Lip-Gel体系，本申请以GEM-GelMA与GEM-Lip@Gel各组为代表，通过体外细胞毒性实验来检测其对MG63细胞的体外抑制情况，其检测结果如图42所示。
在图42中，Stage1时，相较于GelMA组，含药各组均有明显的细胞毒性，但各组之间无显著差异。在Stage2时，GEM-GelMA与GEM-Lip@Gel各组有显著性差异。在Stage3时，GEM-GelMA与GEM-Lip@Gel各组之间有显著性差异，且GEM-Lip@Gel组间也存在显著性差异。
主要原因如下，在Stage1中，虽然GEM-Lip@Gel各组中GEM的含量不同且释放速率较GEM-GelMA慢，但是含药各组的药物浓度均高于有效药物浓度，所以没有各组之间没有显著性差异。由于药物的缓释作用，在Stage2时GEM-Lip@Gel各组的细胞抑制作用相较于Stage1时没有明显差异，且由于此时各组的药物浓度依旧较高，所以组间无显著性差异。而缓释作用不明显的GEM-GelMA在Stage2时细胞抑制作用相较于Stage1有明显减弱，所以GEM-Lip@Gel各组相较于GEM-GelMA有着明显差异。在Stage3时，由于该阶段GEM-GelMA中的药物已经基本释放完全，所以其对于细胞的抑制作用远不及还在释放药物的GEM-Lip@Gel各组，而在GEM-Lip@Gel各组中，由于此时大部分药物已经释放，GEM60-Lip@Gel的释放要略慢于其他各组，所以其细胞抑制效果也更加明显，这与体外释放结果相呼应。
缩写中文释义：
GEM-Lip@Gel吉西他滨脂质体复合GelMA水凝胶；
PTX-Lip@Gel紫杉醇脂质体复合GelMA水凝胶；
THR-Lip@Gel凝血酶脂质体复合GelMA水凝胶；
Lip30-Gel复合有30mg空白脂质体的GelMA水凝胶；
Lip60-Gel复合有60mg空白脂质体的GelMA水凝胶；
Lip120-Gel复合有120mg空白脂质体的GelMA水凝胶；
GEM-Lip60@Gel复合有60mg吉西他滨脂质体的GelMA水凝胶；
PTX-Lip60@Gel复合有60mg紫杉醇脂质体的GelMA水凝胶；
THR-Lip60@Gel复合有60mg凝血酶脂质体的GelMA水凝胶；以上GelMA浓度均为20％。
GEM-Lip30@20％Gel复合30mg吉西他滨脂质体的20％GelMA水凝胶；
GEM-Lip60@20％Gel复合60mg吉西他滨脂质体的20％GelMA水凝胶；
GEM-Lip120@20％Gel复合120mg吉西他滨脂质体的20％GelMA水凝胶；
GEM-Lip30@10％Gel复合30mg吉西他滨脂质体的10％GelMA水凝胶；
GEM-Lip60@10％Gel复合60mg吉西他滨脂质体的10％GelMA水凝胶；
GEM-Lip120@10％Gel复合120mg吉西他滨脂质体的10％GelMA水凝胶；此处强调GelMA浓度，是因为不同GelMA对于药物释放速率有所影响。
GEM-GelMA含有吉西他滨药物的GelMA水凝胶；PTX-GelMA含有紫杉醇药物的GelMA水凝胶；THR-GelMA含有凝血酶药物的GelMA水凝胶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。
Claims (10)
1.一种脂质体增强型水凝胶，其特征在于，主要由水凝胶材料和脂质体共混交联制得；
所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶；
所述脂质体为空白脂质体或载药脂质体，所述脂质体的加入量为1～150mg/mL水凝胶体系中水。
2.根据权利要求1所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述载药脂质体包括脂质体载体和负载在脂质体载体上的药物成分；所述脂质体载体主要由磷脂类材料与胆固醇构成。
3.根据权利要求2所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述磷脂类材料选自卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、硬脂酰胺或油酰基脂肪胺。
4.根据权利要求2所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述药物成分为亲水性药物、亲脂性药物、基因类药物或蛋白类药物。
5.根据权利要求4所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述药物成分为盐酸吉西他滨、紫杉醇或凝血酶。
6.根据权利要求4所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述载药脂质体的包封率在20％以上；所述载药脂质体的平均粒径为100～300nm。
7.根据权利要求1所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述脂质体增强型水凝胶按照以下步骤制得：水凝胶材料和脂质体混合后，在光交联剂存在的条件下，通过紫外光照射进行交联，得到脂质体增强型水凝胶。
8.根据权利要求7所述的脂质体增强型水凝胶，其特征在于，所述光交联剂的加入量为水凝胶体系中水质量的0.5～2wt％；通过300W紫外灯光照射交联，时间为10～20min。
9.一种复合脂质体增强型水凝胶，其特征在于，主要由水凝胶材料和负载不同类型药物成分的载药脂质体共混交联制得；
所述水凝胶材料选自透明质酸水凝胶、纤维素水凝胶、海藻酸盐水凝胶、胶原蛋白水凝胶、聚酯类水凝胶、聚乙烯醇水凝胶、胶原蛋白接枝聚丙烯酸酯水凝胶，透明质酸接枝异丙基丙烯酰胺水凝胶或不饱和甲基丙烯酸酯修饰的明胶；所述载药脂质体的加入量总和为1～150mg/mL水凝胶体系中水。
10.如权利要求1～9中任一项所述的脂质体增强型水凝胶在制备组织修复和/或疾病治疗药剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20171222 |