CN116370402A - 一种药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法，创造性地引入了纳米脂质体技术、ROS响应成分合成步骤和超声控制下的原位纳米复合水凝胶形成步骤，多种步骤联合使用，得到所述的原位纳米复合水凝胶，所得的水凝胶体系的制备方法可以在不同使用环境下，经过超声刺激，获得原位纳米水凝胶，并可控地释放药物，这一制备方法极大地提高了本领域内纳米水凝胶的使用环境和应用范围，加入药物，通过多种机制的联合，实现ROS产生量和药物的持续释放，有利于特定药物的精准应用，具有极为广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明提供了一种药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法，属于生物材料制备技术领域。
背景技术
原位凝胶室温下通常以液态形式存在，在用药部位下受机体生理环境或其他刺激响应，发生相转变，由液态转变为固体凝胶态。水凝胶(如胶原蛋白，藻酸盐和壳聚糖)的水凝胶由于其3D水网络结构，优异的生物相容性大大滴和生物降解性已被广泛用于缺陷填充处理。此外，刺激响应水凝胶体系根据不同的成胶理论可分为，包括温度响应，pH响应，化学响应，光响应和酶响应水凝胶，现已被开发用于递送载体。例如：Madry等制备了基于聚环氧乙烷(PEO)-聚环氧丙烷(PPO)-PEO泊洛沙姆设计的的热敏水凝胶，实现了治疗性重组腺相关病毒(rAAV)载体的控释，并通过过表达成软骨Sox9转录因子进一步改善了全层软骨修复。Hu等人用紫外光交联制备了一种甲基丙烯酰化明胶(GelMA)/纳米粘土水凝胶，以实现细胞外囊泡的持续释放以进行软骨再生。但是以上几种响应性水凝胶均存在缺点，如温度响应水凝胶主要依赖于生物体温度(37℃)，成胶的温度范围较窄，如需更高的刺激成胶温度则需要外部条件刺激。对于pH敏感的水凝胶则受限于注射部位的pH值，其适用范围有很大限制。化学响应又可能存在毒性。光响应的水凝胶，受限于光对组织的穿透性，只能控制浅表皮的区域成胶。以上策略中在实现原位控制成胶层面仍有许多困难。
发明内容
为了解决上述技术问题，申请人想提供一种新型的原位纳米复合水凝胶的制备方法，这种方法结合了多种技术，其中包括原位纳米复合水凝胶技术、ROS相应脂质体技术，声控技术等一系列技术，目的是提供一种新型的成胶方法，且该方法的实施伴随了一种物理形态的变化，通过一种超声控制，使其迅速形成原位水凝胶，并且这种水凝胶形成的同时，还同时具有了一种缓释的功能。本专利中以KGN药物进行了系统的说明。
根据上述描述，申请人提供了一种药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法，用于活性氧响应药物可控释放的原位纳米复合水凝胶体系的制备，其中，包括以下步骤：
1)合成具有活性氧响应的脂质体前驱体DSPE-TK-mPEG；
2)将步骤1)所述DSPE-TK-mPEG与脂质体组分反应，制备具有活性氧响应的纳米脂质体LP；
3)将步骤2)中LP制备具有活性氧响应并装载脂溶性药物D制备得到的纳米脂质体LPDK；
4)将步骤3)中LPD制备具有活性氧响应并装载凝血酶T得到纳米脂质体LPDT；
5)将步骤4)LPDT加入声敏剂，使声敏剂包埋入LPDT内部；
6)将步骤5)所得含有声敏剂的LPDT与纤维蛋白原混合，得到活性氧响应药物可控释放的原位纳米复合水凝胶前驱液；
7)超声刺激下，步骤6)所得前驱液形成所述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶。
从上述步骤中，可以看出，申请人结合了活性氧ROS响应技术，脂质体包埋技术，原位凝胶技术和超声声控技术进行综合性结合。
研究思路：1、建立ROS响应敏感性成分DSPE-TK-mPEG，而后通过声敏剂与超声建立联系，而后包埋相应的药物，例如Kartogenin等，2、使用上述成分进行了纳米级脂质体的建立，目的是建立了一种受到超声控制的脂质体。3、同时，为了得到了一种受超声控制的凝胶，本制备方法将原味水凝胶的组分进行了拆分，例如凝血酶放入脂质体内，纤维蛋白原游离于脂质体之外，建立了一种脂质体隔离机制，只有接受了超声刺激后，才能打破脂质体，使原位复合纳米水凝胶形成，同时开启相关的控释给药过程，属于一种新型的制备方法和凝胶的使用方式。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述合成DSPE-TK-mPEG，采用三步走策略，分为酮缩硫TK合成步骤、TK-mPEG合成和DSPE-TK-mPEG合成三步。目的是得到ROS敏感相应的组分DSPE-TK-mPEG。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述酮缩硫醇TK合成步骤，由巯基丙酸、丙酮、三氟乙酸反应后结晶、过滤、洗涤后得到。优选巯基丙酸、丙酮、三氟乙酸用量比为5-25g:1-55mg:10-100μL。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述TK-mPEG合成步骤，将酮缩硫醇(TK)、甲氧基PEG氨基(mPEG)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和NHS进行室温搅拌反应后，透析后，过滤得到所述TK-mPEG，其用量比为25-100mg:50-350mg:100-500mg:78-430mg，透析袋截留分子量为1KWD。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述DSPE-TK-mPEG合成步骤，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，TK-mPEG，DCC和NHS加入在溶剂和催化剂作用下，透析后得到所述DSPE-TK-mPEG，其用量比为15-75mg:25-150mg:4-40mg:2-20mg透析袋截留分子量为7KWD。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，步骤2)、3)、4)和5)的顺序可以合并或调整。即凝血酶、脂溶性药物、声敏剂可以一块加入或者选择自己的顺序加入。
进一步地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，利用薄膜水化法或无水乙醇注入法得到LPD。
步骤2)利用薄膜水化法或无水乙醇注入法的操作方式属于制备脂质体的常用方式。
本文中普通脂质体组分例如磷酯类等，其使用种类和配比属于本领域公知技术。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述声敏剂选自HpD、PpIX、Ce6的一种或多种。优选PpIX。
工作机制为声敏剂在超声下产生活性氧(ROS)，ROS与DSPE-TK-mPEG中TK发生氧化还原反应刺激脂质体的破裂。
进一步地，所述声敏剂的重量占脂质体总质量比例范围为0.1％-0.6％。声敏剂质量占比太低，脂质体断裂不充分，太高又会损伤细胞。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述脂溶性药物D选自Kartogenin或者阿霉素。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述脂溶性药物D选自Kartogenin。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述脂溶性药物D的重量占脂质体总质量比例范围为0.01％-0.8％。根据所要使用的药物的包埋率、用量计算来进行凝胶和药物制剂的用量调整。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，水凝胶的超声作用机制为：将上述具有活性氧响应的纳米级载药脂质体与纤维蛋白原按比例进行混合，在超声下，DSPE-TK-mPEG基脂质体与ROS发生氧化还原反应而被破坏，随后凝血酶从脂质体中释放出来并与纤维蛋白原通过酶促反应，实现水凝胶前驱液从液态到凝胶态的转变形成原位水凝胶。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，所述纤维蛋白原与所述脂质体中凝血酶以浓度分别为20-400mg/ml和2-1000UI/ml的体积比例1:0.5-3。具体用量依据凝胶的形成强度和载药量进行调整。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，超声功率范围为0.5-5W/cm2，超声时间为1-5分钟。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，在超声刺激下，凝血酶从脂质体中释放出来并与纤维蛋白原通过酶促反应可形成原位水凝胶，实现水凝胶前驱液从液相到固相的转变。
进一步地，在药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法中，在超声刺激下，脂溶性药物D为KargeninKGN，ROS的产生和促软骨分化药物(KGN)的可控释放能够激活Smad5/mTOR信号通路进而促进软骨再生。
申请人进一步提供了一种由上述制备方法得到的药物可控释放的原位纳米复合水凝胶。
优选地，在上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶，所述脂溶性药物D为Kargenin。
本发明进一步提供了一种上述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶在制备软骨修复药物中的应用。
以脂溶性药物Kargenin为例，本发明的制备方法的工作原理是：在超声刺激下，通过声敏剂的作用，促进二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-酮缩硫醇-甲氧基-聚乙二醇的断裂，凝血酶被释放出来，然后通过酶促反应纤维蛋白原和凝血酶原位凝胶化。此外，通过调整超声条件检测产生的活性氧(ROS)水平和释放的KGN量。
为了解决体内无法精确原位控制按需成胶这一问题，申请人提出一种超声刺激活性氧(ROS)响应的原位纳米水凝胶体系的制造方法。该方法中超声具有较深的组织穿透性，可以实现体内的响应刺激。为实现原位成胶的理论，本文使用基于酮缩硫醇(TK)的脂质体加载生物活性药物KGN，生物酶凝血酶和声敏剂(PpIX)。在超声刺激下，基于TK的脂质体由于活性氧(ROS)的产生而被部分破坏，凝血酶被释放出来，然后通过酶促反应纤维蛋白原和凝血酶原位凝胶化。此外，通过调整超声条件检测产生的活性氧(ROS)水平和释放的KGN量。在细胞水平实验中，纤维蛋白原和liposome@PpIX-KGN-凝血酶(纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶)的原位纳米复合水凝胶经受超声刺激，通过Smad5/mTOR信号通路表现出良好的生物相容性和BMSC的软骨分化。总体而言，该原位纳米复合水凝胶在大鼠软骨缺损模型中，通过结合持续KGN释放与增强活性氧(ROS)产量相结合的组合策略，有效改善了组织再生，这为响应性原位水凝胶在再生领域铺平了道路。
本发明还具体提供了一种具体的药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法，由以下步骤组成:
1)合成DSPE-TK-mPEG，采用巯基丙酸、丙酮、三氟乙酸反应后结晶、过滤、洗涤后得到酮缩硫醇(TK)，即将酮缩硫醇(TK)、甲氧基PEG氨基(m-PEG)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)进行搅拌反应后，透析后，过滤得到TK-m-PEG，加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，在溶剂和催化剂作用下得到DSPE-TK-mPEG；
2)将磷酯类和DSPE-TK-mPEG进行溶剂溶解，然后，将声敏剂和脂溶性药物D分别溶于溶剂中，二种溶液进行混合后，旋转蒸发得到磷脂膜，得到含有声敏剂-脂溶性药物-DSPE-TK-mPEG的磷脂膜，加水溶解，进行薄膜水化，得到混合溶液，加入凝血酶，冰浴下进行搅拌，膜挤压法，控制尺寸，得到纳米级脂质体；
3)将上述纳米级脂质体与纤维蛋白原进行混合，在超声下实现水凝胶前驱液从液态到固态的转变并得到含有药物的所述可控释放的原位纳米复合水凝胶。
在上述方法参数中，溶剂和催化剂为本领域人公知的技术。
本系统充分利用了DSPE-TK-mPEG与ROS的响应机制，使用过程中，将上述ROS响应原位纳米水凝胶送入相关的部位，通过局部超声处理，使得脂质体中声敏剂发生反应，产生ROS后，DSPE-TK-mPEG进行断裂，从而脂质体破坏，促进凝血酶和脂溶性药物的释放，而凝血酶与纤维蛋白原进行反应得到水溶性凝胶，继续控制药物的缓慢释放。而多次的超声反应能够促使脂质体多次缓慢破裂，同样可以控制给药的速度，因此本给药系统含有双重的药物缓释递送基质，同时，在评估相关治疗效果时发现，当药物为KGN时，能够同时激活ROS所引起的mTOR信号通路，释放的KGN激活SMAD5信号通路，两者协同促进软骨再生，因此通过ROS应答的脂质体系统和原位凝胶形成系统，共同完成药物缓释和组织再生的功能，受到超声控制，控制脂质体破裂和药物的释放速度，能够更好地进行局部给药，多次给药，减少患者的给药痛苦，提高依从性和药效，成为本领域组织再生和给药的一个新的方向和产品类型，适合工业生产。
在本发明中，所述制备方法具有以下优点：
1、综合多项技术，提供了一种同时具有缓释和超声控制的缓释系统。
2、与常规原位凝胶、温敏凝胶等不同、本发明可以通过超声进行控制，通过声控，操纵原位复合水凝胶体内的流动和形成，加入纳米脂质体技术，降低所形成水凝胶的降解率，本身就是本领域的重大技术突破，这为原位水凝胶的使用开拓了新的方向。
3、可以提供一种ROS和脂溶性药物双管齐下的系统，同时在体内启动两项机制，达到协同效应，更好地发挥药效机制，特别是KGN在软骨修复过程中的发现，这也是我们开发此项机制时，发现的预想不到的技术效果。
附图说明
图1为活性氧(ROS)响应脂质体制备所需前躯体的合成和表征；(a-c)TK、TK-mPEG和DSPE-TK-mPEG的合成和1HNMR特征峰；(d)H2O2条件下TK断裂后1HNMR特征峰。
图2为ROS响应脂质体的制备流程；
图3为活性氧(ROS)响应药物控释原位纳米复合水凝胶的制备，凝胶化前后的宏观图；
图4为在不同超声次数下KGN药物释放曲线；
图5为活性氧(ROS)响应药物控释原位纳米复合水凝胶的生物相容性。(a)在不同超声持续时间下的细胞毒性，(b)BMSC在原位纳米复合水凝胶中的增殖情况，(c)活/死细胞染色图，(d)BMSC活性半定量分析，(e)DCFH-DA探针测定活性氧(ROS)生成和NAC清除活性氧(ROS)情况，(f)生成活性氧(ROS)半定量分析。
图6为培养7天后成软骨基因表达情况；
图7为培养14天后成软骨基因表达情况；
图8为培养14d后的成软骨蛋白表达情况；
图9活性氧(ROS)响应药物控释原位纳米复合水凝胶通过激活mTOR和Smad5信号传导促进软骨分化。(a、c)mTOR和磷酸化p-mTOR蛋白表达情况，(b、d)Smad5和磷酸化p-Smad5蛋白表达情况，(e)促软骨分化信号通路示意图。
具体实施方式
下面实例用于进一步说明本发明但不限于本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。以下大鼠、小鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
通过以下实验来进一步阐述本发明所述中药组合物的有益效果。
实施例1
(1)活性氧(ROS)响应的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-酮缩硫醇-甲氧基-聚乙二醇(DSPE-TK-mPEG)前驱物的合成
①合成酮缩硫醇(TK)：将巯基丙酸(11.44g，108.02mmol)，丙酮(2.90g，49.1mmol)和过量的三氟乙酸(TFA)在室温下反应6小时。然后将反应产物置于冰浴中冷却，直至结晶完成。将溶液过滤，并用预冷的正己烷和去离子水分别交替洗涤3遍，并在真空冷冻干燥箱中干燥得到白色产品。
②合成DSPE-TK-mPEG：将酮缩硫醇(TK)(75.6mg，0.3mmol)、甲氧基PEG氨基(150mg，0.03mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)(230mg，1.2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(138mg，1.2mmol)完全溶解在pH6.8磷酸盐缓冲溶液中并在室温中搅拌3天。为去除未参与反应杂质，使用透析袋(截留分子量[MWCO]＝1KDa)室温下用去离子水透析3天来纯化反应混合物。将混合物通过0.8-μm过滤器过滤后进行冷冻干燥得到TK-mPEG。随后，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)(12mg，0.016mmol)溶解在2ml氯仿中并在60℃下搅拌1小时。TK-mPEG(54mg，0.024mmol)和DCC(9.9mg，0.048mmol)分别溶解在2ml氯仿中，NHS(5.5mg，0.048mmol)溶解在1ml甲醇中。然后，将DCC和NHS逐滴加入到TK-mPEG溶液中。随后，将完全溶解并活化后的DSPE滴加到上述混合物中并在室温下反应3天。使用氮气蒸发反应溶剂，并用5mlTris-HCl缓冲液(pH7.4)分散残留物，并加入20ml甲醇和去离子水(1:1v/v)混合物室温反应24小时。然后使用透析袋(MWCO＝1kDa)透析24h，再用截留分子量为7KDa的透析袋透析24h，所得溶液用0.8-μm过滤器过滤后冻干两天。
(2)活性氧(ROS)响应纳米脂质体的制备
①脂质体原料的表征：将上述合成的TK、TK-mPEG和DSPE-TK-mPEG的化合物溶解于氘代氯仿(5mg/ml)，利用质子(1H)核磁共振(NMR)验证其化学结构。利用H2O2作为氧化剂来模拟活性氧(ROS)，将TK(5mg/ml)和过氧化氢(100mM)以1:1(v/v)的比例在黑暗环境下共孵育2小时。然后，对产品进行冻干并溶解于氘代水中，通过核磁共振检测其反应产物的化学结构。
②脂质体@PpIX-KGN-凝血酶(脂质体@PPIX-KGN-凝血酶)的制备：采用薄膜水化和挤出法制备脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米颗粒。将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和DSPE-TK-mPEG以95:5的摩尔比溶于氯仿(6ml)中。然后，将声敏剂(PpIX)和kartogenin(KGN)分别溶于(二甲基甲酰胺)DMF和二甲基亚砜DMSO中，并以总脂质体质量的0.4％添加到上述溶液中。将该溶液在50℃下用旋转蒸发器蒸发30分钟，得到磷脂膜。然后，向烧瓶中加入6ml超纯水，使薄膜充分溶解。溶解后，在65℃下进行水化处理1小时。将混合溶液冷却至25℃后，滴加1000UI凝血酶，在冰浴中大力搅拌30分钟。最后，将得到的溶液用聚碳酸酯膜(200nm)挤压30次，调整尺寸。然后，通过透析膜(MWCO＝100kDa)在4℃黑暗环境下透析24h(每6h换一次预冷的DI水)，以去除游离的HSPC、DSPE-TK-PEG、PpIX和KGN。将得到的纳米颗粒在-80℃下保存。此外，通过相同的合成步骤合成了未修饰KGN的脂质体@PpIX-凝血酶(LPT)和未修饰凝血酶的脂质体@PpIX-KGN(LPK)和脂质体@PpIX(LP)，用于进一步研究。
上述的制备方法制备见图1。
(1)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶成胶试验
在100mg的纤维蛋白原加入1mlDPBS中，在37℃恒温水浴锅中溶解2h，直至完全溶解。采用BCA法定量脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米粒中的凝血酶浓度(100UI/ml)。纤维蛋白水凝胶前体的纤维蛋白原与脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米颗粒以1:1的体积比完全混合。然后，用功率为1W/cm2的超声仪对混合溶液进行超声处理3分钟，诱导形成原位水凝胶。见图2。
(2)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的药物控释试验
为了评估纤维蛋白基智能水凝胶中KGN的释放行为，本文以纤维蛋白为基础的智能水凝胶(脂质体@PPIX-KGN-凝血酶)，100mg/ml纤维蛋白原与100UI/ml凝血酶按1:1(v:v)混合，超声后形成水凝胶。然后，将该纤维蛋白水凝胶系统放入透析袋(MWCO＝3500Da)中，测试水凝胶的KGN释放行为。在0、1、3、5和11天，对样品进行功率为1W/cm2和占空比为50％的超声处理(3分钟)该水凝胶体系。这些样品浸润到50ml离心管中并在恒温摇床(37℃)中以100rpm的速度转动以模仿人体运动。在所需的时间点从离心管中收集200微升的溶液，然后，将相同体积的去离子水添加到介质中。采用高效液相色谱法测定各时间点的KGN浓度。见图3。
(5)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的理化性能表征
①扫描电镜表征：在占空比为50％和功率1W/cm2的情况下超声3分钟，形成的纤维蛋白和凝血酶基的纤维蛋白水凝胶+超声、纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声、纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声水凝胶体系。并用冷冻干燥机对以上类型的水凝胶进行冻干干燥。然后，用高真空离子溅射涂布机在样品表面涂上导电金涂层。采用场发射扫描电子显微镜(SEM，JMF-7500F，日本)观察纤维蛋白水凝胶+超声、纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声、纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声水凝胶支架的表面形貌。
②机械性能：水凝胶机械性能在组织修复中起着维持形态和必要的力学支撑等作用。该纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声原位水凝胶在不同超声时间下形成直径5mm、厚度约3mm的圆柱形水凝胶。并在采用AntonPaar多功能压痕测试仪(PhysicaMCR301，MCR500)对纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声纳米颗粒原位水凝胶的力学性能进行测试。
③溶胀和降解特性：采用重量法评价纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声原位纳米水凝胶的溶胀率和降解率。将干燥样品(W0)以加入DPBS(5ml)，并置于转速为100rpm的恒温摇床(Bluepard，超声，37℃)中，溶胀96小时。在所需的时间点，去除水分后称量膨胀水凝胶(Ws)。利用方程Es＝[(Ws-W0)/W0×100％](n＝4)来估计膨胀率。此外，用同样的方法，在感兴趣的时间点对原位纳米水凝胶的降解速率进行评估。
结果与讨论
(1)活性氧(ROS)响应脂质体前驱物的化学结构式鉴定
为验证具有活性氧(ROS)敏感的TK的成功合成，将合成的TK溶解于氘代氯仿(CDCl3)中并通过1HNMR(AVANCE，500HMZ)鉴定。分析谱图可得：1H-NMR:2.85(t，4H)，2.58(t，4H)，1.58(s，6H)，其化学位移与积分面积均与TK的特征峰相对应，证明了TK的成功制备(图1a)。
此外，TK作为中间连接器嵌入到mPEG和DSPE中。在催化剂1-C3一二甲氨基丙基)-3一乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-经基唬泊酞亚胺(NHS)的作用下偶联TK的羧基和PEG的氨基，TK-mPEG的化学结构在CDCl3中通过1HNMR进行鉴定(图1b)。结果表明，在1.52ppm处的特征峰是-CH3基团(TK化学结构中的“d”)，特征峰(-CH2)位于2.729ppm处(TK化学结构中的“c”)，mPEG的骨架峰(-CH2-CH2-)位于3.506ppm处(TK-mPEG化学结构中的“a”)，这表明TK在mPEG上成功偶联。
通过DCC/NHS在TK-mPEG和DSPE之间耦合合成DSPE-TK-mPEG。DSPE-TK-mPEG在CDCl3中通过1HNMR得到证实(图1c)。特征峰(-C-O-)位于2.386ppm处，同时也有TK和mPEG特征峰，这表明通过两步酞胺与缩合反应TK-mPEG和DSPE成共耦连，DSPE-TK-mPEG被成功制备。
为了评估TK对活性氧(ROS)的敏感性，将TK与100μMH2O2避光孵育24小时后冻干。将上述产物溶解于氘代水(D2O)中，利用1HNMR评估活性氧(ROS)对TK的切割行为(图1d)。结果显示，在2ppm处发现TK裂解后产物中的硫醇官能团的特征峰。这表明TK具有活性氧(ROS)响应性，可以实现TK的控制断裂。
(2)活性氧(ROS)响应纳米脂质体的制备及表征
脂质体纳米粒作为生物活性递送载体，已广泛应用于可控递送系统和组织再生中。其中包裹药物和凝血酶的响应性纳米脂质体的成功制备是本课题最为关键的一步。因此，本文通过多种表征策略，综合评估脂质体@PpIX-KGN-凝血酶纳米载体是否成功制备。在这项工作中，通过薄膜水合方法制备了一种基于活性氧(ROS)响应脂质体，制备流程如图2。
①UV-vis吸收光谱：为了评估脂质体@PpIX-KGN-凝血酶纳米载体的成功制备，使用紫外分光光度计(UV-vis)在240-600nm处对其进行定性分析。在脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水溶液中分别在274nm和410nm处检测到KGN和PpIX的吸收峰。这表明促软骨再生药物KGN和声敏剂PpIX被成功装载进脂质体内部。
(3)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的形成
原位纳米复合水凝胶的制备是本课题核心点，该原位水凝胶是通过超声刺激响应而形成的。将纤维蛋白原以100mg/ml的浓度溶解于在37℃生理盐水并在37℃水浴1小时以完全溶解制备前驱液。此外，脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米载体中的凝血酶浓度通过BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime)定量，并将其调节至100UI/ml。然后，将纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶的两个前体按照1:1(V/V)进行充分混合，利用注射器提供相同体积的前驱液。在超声波刺激下，声敏剂(PpIX)产生活性氧(ROS，1O)。活性氧(ROS)触发并诱导脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米载体磷脂双层中的TK(DSPE-TK-mPEG)断裂，进而致使脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米载体破裂。凝血酶和KGN从脂质体@PPIX-KGN-凝血酶载体中释放出来。如上所述，纤维蛋白原和凝血酶接触形成纤维蛋白原/脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米颗粒水凝胶。在暴露于超声之前，脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶的前驱液呈液体。然而，前驱液在超声处理3分钟(1W/cm2)后迅速发生液固相变(图3)，这表明凝血酶从脂质体中释放并诱导原位水凝胶化。
(4)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的溶胀和降解特性
此外，生物材料的降解特性在实际应用中也起着至关重要的作用，不仅为组织再生提供空间也可以调节组织和细胞微环境。为了模拟关节微环境，本文将制备的三种类型的水凝胶，置入含有5mlDPBS的离心管中，并放置在37℃恒温摇床上，转速为100rpm。在孵育到预定的时间点后，取出水凝胶并进行冷冻干燥，监测纤维蛋白水凝胶，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶水凝胶的剩余重量。结果表明纯纤维蛋白水凝胶降解速率最快，在14天后已经降至为原始质量的28％。纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶水凝胶在DPBS中放置28天后剩余质量分别是其原始质量数的43.44％和42.47％。结果表明，纳米颗粒原位水凝胶在降解时间上纯纤维蛋白水凝胶表现出优异的降解特性，这可能是因为纳米颗粒增强了纤维蛋白原和凝血酶的交联能力，在一定程度上延缓了水凝胶的降解，这将更有利于药物在水凝胶中的持续释放。
(5)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的机械性能
为检测超声活性氧(ROS)响应原位水凝胶的机械性能，本文利用超声仪对前驱液进行1-5分钟的超声处理。原位形成水凝胶后，通过纳米压痕仪测量脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶的机械性能。实验结果发现，水凝胶的压缩模量随超声持续时间的延长而逐渐增大。然而，当超声时间超过3分钟时，压缩模量仅略有增加，可能是因前驱液水凝胶化使得凝血酶无法完全参与交联。此外，与纯纤维蛋白水凝胶相比，超声处理3min后纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶的压缩模量提高了47.89％。这表明，脂质体的存在可有效提高水凝胶的机械应力。
(6)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的药物释放行为分析
药物的包封率与释放特性在药物输送系统(DDS)中起着关键作用。脂溶性KGN和PpIX易于装载到脂质体的磷脂双层中，并实现较高的包封率。经高效液相色谱法测定，脂质体@PPIX-KGN-凝血酶中KGN和PpIX的包封率分别为84.2％和86.7％。此外，PpIX在LPT中的包封率为89.3％。负载在脂质体@PPIX-KGN-凝血酶和LPT中的KGN和PpIX表现出相似的包封率，这可能是由于较低的药物脂质体比(0.4％)没有达到脂质体的最高装载值。为了研究超声诱导KGN的释放性能，在有无持续性超声(第0，1，3，5和11天)处理纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声水凝胶(KGN，95.2μg/ml)后(1W/cm2，3分钟)评估KGN释放速率。将纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶放入透析袋(10000-14000DW)并置于装有7.5mlDPBS的离心管中，在恒温摇床(37℃，以120rpm震荡，在不同时间点选取200ul进行检测。结果表明，KGN的释放效率随着超声处理次数的增加而逐渐提高。然而，当超声频率超过3次时，释放率达到阈值(86％)(图4)。为了进一步研究KGN释放的规律性，在超声处理后检测纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶(100μg)的累积KGN释放。结果表明，超声处理后KGN逐渐释放，12天后达到释放的阈值。重要的是，超声3次后的释放率(85.66％)远高于仅超声一次(42.33％)，这可能是因为通过长期超声从脂质体@PPIX-KGN-凝血酶释放了更多的KGN。为实现良好的治疗效果，在长期体外细胞培养和体内治疗时按照以上时间结点采用多次超声策略。
实施例2
(1)细胞的来源和培养方法
本章节中涉及的所有BMSC均来自从SD大鼠的股骨髓。大鼠注射戊巴比妥钠麻醉后处死，将其浸泡于75％无水乙醇中灭菌。取出股骨，利用2％双抗冲洗股骨髓腔，过滤后将从股骨髓腔收集的提取物在含有α-MEM，1％PS和10％FBS的完整培养基中培养。原代BMSC在第3-4代纯化以进行后续研究。
(2)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的3D细胞培养
为体外评估水凝胶体系的生物学特性，将传到3代的BMSCs以每个水凝胶支架1×105个细胞接种到3D原位水凝胶中。具体来说，将BMSC重悬于100mg/ml纤维蛋白原溶液中，并将密度调节至2×107个细胞/ml。将各种类型的NPs(100UI/ml，凝血酶)和纤维蛋白原以1:1(20μl)的比例加入圆柱形模具(Ф4mm×2mm)中。将水凝胶前驱体溶液以1W/cm2的功率和50％占空比超声处理3分钟，在黑暗中形成水凝胶。此外，智能原位水凝胶的分组如下：(1)纤维蛋白水凝胶(FT)；(2)纤维蛋白水凝胶+超声(FT+US)，(3)纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声(FLPT+US)，以及(4)纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声(FLPKT+US)。凝胶化后，用完整的培养基培养细胞支架构建体进行进一步研究。将纤维蛋白原前体通过紫外光处理灭菌一小时，随后在体外和体内使用。
附图中5、6、7、9中(FT)、(FT+US)、(FLPT+US)、(FLPKT+US)的柱状图的顺序都是从左向右排布。
(3)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的细胞生物学相容性实验
本文通过CCK-8试剂盒检测加载在纤维蛋白基水凝胶中的细胞的活力。将以上细胞水凝胶结构体放在96孔板中用150μL完全培养基孵育24小时后，用含有10％CCK-8试剂的新鲜培养基替换培养基。在细胞培养箱中孵育1.5小时后，利用多功能酶标仪在450nm处分析上清液的吸光度并计算细胞活性。为了评估水凝胶内部BMSC的增殖，使用与上述相同的测量方法将细胞在水凝胶中培养1、3和7天。
(4)AM/PI染色
通过活/死细胞染色试剂盒可视化观察装载在纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声纳米原位水凝胶中BMSC的活性。在3D培养1，3和7天后利用碘化丙啶(PI，4μM)和钙黄绿素-AM(2μM)避光孵育30分钟对BMSC(1×105)进行死活标记。然后，用DPBS冲洗样品三次，并用CLSM(FV30-ILSW，奥林巴斯，日本)以494nm发射和528nm激发分析BMSC的3D增殖状态。
(5)细胞内活性氧(ROS)检测
为体外检测细胞内活性氧(ROS)，通过活性氧(ROS)探针2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，日本同仁)在纤维蛋白水凝胶，纤维蛋白水凝胶+超声，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声水凝胶中体外测试BMSC内活性氧(ROS)。将水凝胶前体与BMSC(5×105)混合并预加载DCFH-DA探针(10mM)。超声后4小时，通过CLSM分析细胞内荧光强度并拍照。此外，培养基中加入活性氧(ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC，50mM)抑制活性氧(ROS)产生，作为的对照组(见5e-f)。
(6)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的体外促软骨分化实验
①定量实时聚合酶链式反应分析：在智能原位水凝胶中3D培养BMSC后，通过qRT-PCR分析不同时间点的基因表达水平。将BMSC(5×107)重悬于1ml纤维蛋白原前体(100mg/ml)中，并加入等体积的脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米颗粒溶液(凝血酶，100UI/ml)。然后，用超声处理100μl水凝胶前体3分钟以进行凝胶化。在6孔板中孵育24小时后，将培养基替换为含有高糖DMEM，10％FBS，1％PS，50μg/ml抗坏血酸，100mM地塞米松和1％ITS预混料的软骨诱导培养基7和14天。纤维蛋白水凝胶+超声、纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声水凝胶组在第0、3、5和11天进行超声处理。将培养的水凝胶结构体在液氮中冷冻并用匀浆仪处理30秒，然后加入RNAiso试剂盒提取mRNA(TaKaRa，日本)。逆转录试剂盒(TaKaRa，日本)用于逆转录(RT)以获得cDNA。qRT-PCR由TBGreenqPCR(TaKaRa，日本)在检测系统上进行。qRT-PCR循环条件为95℃持续3min，然后95℃循环3s，60℃循环30s，持续42次循环。
(7)动物体内水凝胶促软骨修复效果评价
①宏观观察：在4周和8周时获得SD大鼠股骨髁的关节软骨治疗以进行肉眼观察。此外，各组还按照O'Driscoll评分系统对软骨的治疗效果进行了形态学评估。
②原子力显微镜(AFM)分析：为了评估表面粗糙度对软骨缺损再生的影响，使用AFM评估大鼠的软骨再生区域。通过NanoscopeVMultimode8扫描探针对所有样品(n＝4)进行AFM。所有实验均由相同的AFM探针在25℃和相对湿度(25％)下进行。
③组织学和免疫组织化学分析：收集SD大鼠的股骨用4％福尔马林固定2天后，将SD大鼠的股骨髁在脱钙溶液中脱钙4周。在分级乙醇脱水后，将股骨石蜡包埋在合适的位置，并由切片机切成10毫米的切片。不同组的股骨切片用翻红固绿和苏木精-伊红(H&E)染色。然后，通过缺损区域的免疫组化染色分析胶原I和胶原II的表达。用DAB溶液进行染色，并用苏木精复染。染色图像是通过倒置显微镜获得的。此外，在8周时，通过病理染色(H&E)检查主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)的细胞状态，以评估药物制剂的长期安全性。
(8)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的生物相容性
水凝胶的生物相容性在组织工程中在维持细胞活力、增殖和分化起着至关重要的作用。在这项工作中，通过CCK-8测定评估纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米复合水凝胶中细胞的活力。将BMSCs接种在各种水凝胶中24小时，有或没有暴露于超声处理(3分钟)。纤维蛋白水凝胶组和纤维蛋白水凝胶+超声组的细胞活力无差异，表明超声应用3min对细胞没有影响。
纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声原位纳米复合水凝胶相对于纯纤维蛋白水凝胶没有表现出明显的毒性，表明具有优异的生物相容性。结果表明，与脂质体(TK)氧化还原反应后剩余量的活性氧(ROS)(由超声生成，3min)对BMSCs没有额外的毒副作用。为了进一步探索水凝胶中细胞活力与超声持续时间的内在关系，将四种类型的水凝胶暴露于不同持续时间(1-5分钟)的超声下。在所有组中，暴露于超声时，三分钟内的细胞活力没有统计学上的显着差异。然而，当超声持续时间超过四分钟时，观察到轻度毒性。此外，细胞活力随着超声持续时间的增加而逐渐下降，这表明随着超声时间的增加，活性氧(ROS)的增加会损伤细胞(图5a)。
采用CCK-8方法定量分析上述4组3D水凝胶在1、3和7天时BMSC的增殖速率。OD值表示每组水凝胶中的细胞数量。结果得出，OD值随培养时间逐渐增加，表明水凝胶中BMSC的数量逐渐增加。此外，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组的OD值高于纤维蛋白水凝胶组，表明纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组更有利于细胞增殖(5b)。通过活/死测定法可视化分析(图5c)，活呈现绿色荧光染色，死细胞呈红色。结果表明在纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声原位水凝胶中1至7天几乎看不到红色荧光，表明具有出色的生物相容性。此外，利用ImageJ对活/死染色进行半定量分析，结果表明，超过90％的BMSC在纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声原位水凝胶中(图5d)。因此，证明了原位纳米复合水凝胶具有良好的生物相容性。此外，原位纳米复合水凝胶促进了包封BMSCs的迁移和增殖。
(9)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶的体外促软骨分化能力
本文通过阿尔新兰染色、qRT-PCR和蛋白质印迹(WB)进一步分析了原位纳米复合水凝胶对大鼠BMSCs向软骨分化的影响。
①阿尔新蓝染色：软骨的ECM包括蛋白聚糖和胶原蛋白II，可以通过阿尔新染色检测。阿尔新蓝染色显示，当BMSC与各组水凝胶共培养7天后，纤维蛋白水凝胶，纤维蛋白水凝胶+超声，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组中的蛋白聚糖表达(蓝色)逐渐增加。结果表明，纤维蛋白水凝胶脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组具有显著的诱导软骨分化能力。此外，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声组的蛋白聚糖表达(蓝色)与纤维蛋白水凝胶组有相当大的差异，表明适量的活性氧(ROS)可以促进软骨再生。
②qRT-PCR相关软骨基因的表达：为了进一步分析BMSCs的软骨分化，通过实时PCR测量软骨特异性标志物(如Sox9，ACAN和ColII)的表达。纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组在不同时间点均表现出比其他组高的软骨相关基因表达。与纤维蛋白水凝胶组相比，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组中的Sox9，ACAN和ColII基因水平在第7天分别增加了7.31，8.11和10.49倍。与第7天相比，第14天增加的表达水平分别达到1.98倍，2.29倍和2.83倍。此外，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声组在第7天和第14天也表现出与纤维蛋白水凝胶组显着提高的软骨相关基因表达量，这表明活性氧(ROS)可能提高软骨再生能力(图6-7)。
③WB相关软骨蛋白的表达:通过WB测量软骨特异性标志物(如Sox9，ACAN和ColII)的表达。与实时荧光定量PCR结果一致，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组也显示ACAN，Sox9和colII的蛋白表达增加(图8)。
(10)活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶促软骨再生的机制分析
①原位纳米复合水凝胶调制活性氧(ROS)的产生激活mTOR信号通路:mTOR信号传导是活性氧(ROS)生成中的重要信号通路。为了进一步研究通过活性氧(ROS)对mTOR信号通路的调控，分析了不同组中的p-mTOR(磷酸化)表达水平。如图9a、9c所示，超声诱导活性氧(ROS)的产生，WB结果显示，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声组和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组的p-mTOR水平分别提高和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组的mTOR磷酸化水平显着降低了84.6％和103.5％。与NAC(一种活性氧(ROS)清除剂)培养后，与NAC(一种活性氧(ROS)清除剂)培养后，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声和纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组的mTOR磷酸化水平显着降低。
②活性氧(ROS)响应原位纳米复合水凝胶激活Smad5信号通路：Kartogenin(KGN)是Smad4/Smad5信号通路的激活剂。从脂质体中释放出来，促进软骨分化。BMSCs在水凝胶中培养14天后，分析其磷酸化Smad5的水平，并在纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声组中增加179.12％(图9b，d)。由超声和KGN激活的mTOR/Smad5信号通路示意图如图9e所示。
结论:
从细胞层面对纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶的生物活性及相容性进行评估，表明了纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶在具有较高生物安全性。以大鼠来源的BMSCs为本实验细胞工具，开展纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶的迁移分化实验，其实验结果表明纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶组具有促进细胞迁移和提高BMSC向软骨分化的作用。纤维蛋白水凝胶-脂质体
@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶能够通过调节mTOR和SMAD5信号通路促进软骨再生。最后，在软骨缺损大鼠模型中，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶组能够显著地提高软骨修复。
(1)三步法合成了DSPE-TK-mPEG，并通过核磁氢谱鉴定了材料的成功制备。TK与H2O2在37℃避光共培养后，检测到在2ppm处发现TK裂解后产物中的硫醇官能团的特征峰。表明合成的脂质体前驱体具有良好的活性氧(ROS)响应性，进行后续的响应性纳米脂质体的合成。
(2)并通过薄膜水化法和挤出法成功制备了装载凝血酶，小分子药物KGN和声敏剂(PpIX)纳米脂质体。脂溶性药物KGN和声敏剂(PpIX)在脂质体双分子层中具有较高的载药率。利用TEM、UV-vis和DLS等对PLKT纳米粒子进行表征。
(3)纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶前驱液以1:1(V/V)在不同的超声时间下形成原位水凝胶。在此基础上，分析响应性纳米水凝的溶胀和降解性能。表明该响应性原位纳米水凝胶可有效提高水凝胶内部的交联强度，延长水凝胶的降解时间。
(4)并对其药物释放和机械性能等分析，优化出了合理的超声时间。结果表明，随着超声时间的增加机械性能逐渐增加，3分钟后可得到的机械应力阈值。考察了不同超声时间对纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶水凝胶药物释放行为的影响。超声三次循环每次3分钟可以得到满意的药物释放效果，在超声的刺激下，药物的释放行为受到超声的精准调控，具有智能超声响应释放药物的能力。
(5)首先评估了纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶的细胞毒性。通过CCK-8法检测了不同超声时间的纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶对大鼠来源的间充质细胞的潜在毒性。结果表明，超声时间在3分钟内纤维蛋白水凝胶-脂质体
@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶无显著毒性，因此，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶的超声时间控制在3分钟，功率为1W/cm2。
(6)通过CCK-8和Annexin-V-FITC/PI双染实验，评估了不同组水凝胶在1，3和7天的BMSC的活性和增殖效果。实验结果表明，不同组水凝胶均具有良好的细胞活性且纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米水凝胶组更有利于BMSCs增殖。
(7)利用DCFH-DA荧光探针检测不同水凝胶内细胞内活性氧(ROS)的荧光强度，评估超声3分钟后细胞内活性氧(ROS)的产生量。结果表明，在纯水凝胶组及其超声组并无明显活性氧(ROS)荧光产生；两种超声响应纳米水凝胶均出现显著的荧光，且两者并无显著性差异；当加入活性氧(ROS)抑制剂后，荧光强度均明显下降。
(8)本文利用QRT-PCT，WB，阿尔新蓝染色等实验方法，验证体外BMSCs向软骨细胞分化的能力。结果表明，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声软骨细胞分化能力高于纤维蛋白水凝胶，纤维蛋白水凝胶+超声，纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声组。表明纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶+超声具有良好的软骨细胞分化能力，用于把软骨再生潜力。且纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-凝血酶+超声组分化能力也略高于对照组，表明适量活性氧(ROS)可促进软骨再生。
(9)为进一步解释，本文设计的材料对软骨修复的深层次解读，通过WB实验，在细胞层面验证了mTOR和SMAD5信号通路，证明了纤维蛋白水凝胶-脂质体@PPIX-KGN-凝血酶纳米凝胶产生的活性氧(ROS)可以激活mTOR信号通路，释放的KGN激活SMAD5信号通路，两者协同促进软骨再生。
Claims (13)
1.一种药物可控释放的原位纳米复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成具有活性氧响应的脂质体前驱体DSPE-TK-mPEG；
2)将步骤1)所述DSPE-TK-mPEG与脂质体组分反应，制备具有活性氧响应的纳米脂质体LP；
3)将步骤2)中LP装载脂溶性药物D制备得到纳米脂质体LPD；
4)将步骤3)中LPK装载凝血酶得到纳米脂质体LPDT；
5)将步骤4)LPKT加入声敏剂，使声敏剂包埋入LPDT内部；
6)将步骤5)所得含有声敏剂的LPDT与纤维蛋白原混合，得到活性氧响应药物可控释放的原位纳米复合水凝胶前驱液；
7)超声刺激下，步骤6)所得前驱液形成所述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶。
2.一种根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述合成DSPE-TK-mPEG，采用三步走策略，分为酮缩硫醇TK合成步骤、TK-mPEG合成和DSPE-TK-mPEG合成三步。
3.一种根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酮缩硫醇TK合成步骤，由巯基丙酸、丙酮、三氟乙酸反应后结晶、过滤、洗涤后得到。
4.一种根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述TK-mPEG合成步骤，将酮缩硫醇TK、甲氧基PEG氨基m-PEG、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC进行室温搅拌反应后，透析后，过滤得到所述TK-mPEG。
5.一种根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述DSPE-TK-mPEG合成步骤，将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺DSPE，TK-mPEG，DCC和NHS作用下，透析后得到所述DSPE-TK-mPEG。
6.一种根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)、3)、4)和5)的顺序可以合并或调整。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述声敏剂选自HpD、PpIX、Ce6的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，脂溶性药物D选自Kartogenin或者阿霉素。
9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述纤维蛋白原与脂质体中凝血酶以浓度分别为20-400mg/ml和2-1000UI/ml的体积比例1:0.5-3进行配比。
10.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于超声功率范围为0.5-5W/cm2，超声时间为1-5分钟。
11.权利要求1所述制备方法得到的药物可控释放的原位纳米复合水凝胶。
12.根据权利要求11所述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶，其特征在于，所述脂溶性药物D为Kargenin。
13.一种权利要求11所述药物可控释放的原位纳米复合水凝胶在制备软骨修复药物中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116983427A (zh) * | 2023-07-05 | 2023-11-03 | 东华大学 | 一种多功能声激活型半导体聚合物纳米免疫药物及制备方法及应用 |
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2023
- 2023-03-10 CN CN202310225653.9A patent/CN116370402A/zh active Pending
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| CN116983427B (zh) * | 2023-07-05 | 2024-06-04 | 东华大学 | 一种多功能声激活型半导体聚合物纳米免疫药物及制备方法及应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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