CN110279654A - 缓释阿司匹林脂质体水凝胶、制备方法及其在制备治疗复发性腰椎间盘突出症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种缓释阿司匹林脂质体水凝胶、制备方法及其在制备治疗椎间盘切除术后复发性腰椎间盘突出症药物中的应用，该缓释阿司匹林脂质体水凝胶包括阿司匹林、脂质体和明胶甲基丙烯酰水凝胶；并通过对缓释阿司匹林脂质体水凝胶的结构特性及力学特点的观察及体外材料对髓核细胞的炎症影响、体内兔纤维环缺损造模试验来证实缓释阿司匹林脂质体水凝胶治疗纤维环缺损引起椎间盘退变的效果及可能机制，证实ASP‑Lip+GelMA在兔部分纤维环缺损部位的填充、维持力学稳定性和局部炎症的控制方面表现出优越的性能，预防部分椎间盘切除术后复发性腰椎间盘突出症提供了一种新的治疗前景。

Description

缓释阿司匹林脂质体水凝胶、制备方法及其在制备治疗复发 性腰椎间盘突出症药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是涉及一种缓释阿司匹林脂质体水凝胶、其制备方法及其在制备治疗复发性腰椎间盘突出症药物中的应用。

背景技术

腰椎间盘突出症是骨科尤其是脊柱外科常见的腰背痛疾病。随着椎间盘退变的加重，手术是大多数患者的最终选择。手术能明显减轻髓核突出引起的神经压迫和疼痛。然而，传统椎间盘切除术治疗腰背痛的研究表明，在不同的研究中有20%-40%复发性坐骨神经痛或椎间盘突出。Kim等研究表明，青壮年椎间盘突出症术后的再复发率为7.1%。另外，一项大数据研究表明，椎间盘再突出发生率为10%-27%，再手术发生率为5%-21%。手术不能有效地抑制术后椎间盘退变过程，研究表明，年龄、性别、术后局部机械结构的改变、手术引起的局部组织水肿、炎症反应等都会加重残余组织的退变过程。单纯椎间盘切除术不能阻止椎间盘术后炎症、腰椎退变和复发性腰椎间盘突出症（recurrent lumbar disc herniation，RLDH）的发生。因此，术后有效预防复发应给予足够的重视。

椎间盘由髓核、纤维环和终板软骨构成，其中髓核在椎间盘中有着吸收和缓冲椎体压力的生物功能，其生化成分主要是蛋白多糖、胶原、弹性蛋白和水。随着年龄的增长，椎间盘在上下椎体的综合作用下，发生退变，表现为纤维环部分或全部断裂，椎间盘纤维环、髓核组织，甚至终板向外突出，从而压迫神经根，产生相应神经症状。发生椎间盘退变时，I型胶原增多而II型胶原减少、蛋白多糖和弹性蛋白含量明显减少、纤维密度降低。突出的髓核至椎间盘外成为生物化学和免疫刺激物，释放炎性物质，刺激神经根产生相应症状的同时，亦反作用于椎间内相对未退变髓核，从而加速椎间盘的退变。髓核中的水分在出生时含量为90%，随着年龄的增大，其含量逐渐减少，至30岁时，水含量大约为70%，退变加深，水含量降低更明显，故退变椎间盘在磁共振T2像表现为低信号暗区。

研究表明，椎间盘纤维环破裂、髓核细胞缺失及炎症反应是椎间盘退变最重要的原因。髓核细胞分泌II型胶原及蛋白多糖，构成髓核重要组成。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、金属基质蛋白-3（MMP3）诱导蛋白多糖降解，减少髓核细胞含量。较少量的髓核细胞从缺损的纤维环中突出，从而加速椎间盘退变，失去椎间盘生理高度及脊柱生理曲度。现行的治疗复发性腰椎间盘突出主要为再次手术切除突出的椎间盘及椎间融合手术。但这些都属于二次手术，创伤较大。因此，首次手术中修补纤维环缺损、抑制髓核细胞炎性反应、维持椎间盘生理高度便有望成为新的治疗复发性腰椎间盘突出的重要方法。

阿司匹林（aspirin, ASP）是一种经典的非甾体类消炎药，经长期的临床应用，证明其对减少炎症介质、缓解轻度或中度疼痛有着明显的作用。中国专利CN108606969A公开了阿司匹林在制备治疗椎间盘退变药物中的应用，其通过应用LPS诱导氧化应激构建椎间盘退变模型，观察阿司匹林对椎间盘退变的治疗作用，通过观察氧化应激和椎间盘退变的各项指标来评估Aspirin对于椎间盘退变的治疗作用。并且通过Western blot来证明Aspirin减少氧化应激，缓解椎间盘退变的简要机制。椎间盘髓核组织发生氧化应激引起椎间盘退变，Aspirin通过抑制髓核组织的氧化应激进而减少细胞基质和二型胶原的分解来延缓椎间盘退变，从而为椎间盘退变的防治提供了新的途径。然而，单纯的Aspirin治疗不能实现椎间盘切除术后纤维环缺损的封堵，无法预防和治疗髓核再突出引起的炎症以及椎间盘退变。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种缓释阿司匹林脂质体水凝胶、其制备方法及其在制备治疗复发性腰椎间盘突出症药物中的应用，从而为预防和治疗复发性腰椎间盘突出症提供一种新途径。

本发明采用以下技术方案：

一种缓释阿司匹林脂质体水凝胶，包括阿司匹林、脂质体（liposomes, Lip）和明胶甲基丙烯酰（methacrylate gelatin, GelMA）水凝胶，其中，所述明胶甲基丙烯酰水凝胶与所述脂质体交联，所述脂质体负载所述阿司匹林。

一种所述的缓释阿司匹林脂质体水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）阿司匹林负载的脂质体的制备

将脂质材料卵磷脂和胆固醇（4/1，w/w）混合，和阿司匹林同时溶解在氯仿中（50/1，w/w）；然后将这些复合材料的溶液转移到茄型烧瓶中，用旋转真空蒸发器以100 r/min的速度将有机溶液除去，水浴温度为30℃；在烧瓶瓶体中，经过温和的蒸发，形成了均一的蜂窝状薄膜；然后，通过旋转（100 r/min）和加热（30℃），利用预热的40℃去离子水（dd H₂O）对蜂窝状薄膜进行水合物化，即制得了初始载药脂质体，然后分别在不同直径（0.45 μm、0.22 μm）的聚碳酸酯膜上超声挤出，即制得阿司匹林载药脂质体（ASP-Lip），然后，在海藻糖的保护下，对所述阿司匹林载药脂质体进行冻干，使其粉末状；

（2）明胶甲基丙烯酰水凝胶的制备

在60℃下不断搅拌，将明胶完全溶解后，取20g明胶加入200 mL PBS缓冲液中，一滴一滴加入16 mL甲基丙烯酸酐，滴落过程持续1h；2 h后，加入800 mL预热至50℃的PBS缓冲液，连续搅拌15 min停止反应；然后将其密封在透析袋中（Mw：8000-12000），透析1w，去除未反应的甲基丙烯酸酐；1w后收集透析袋中的溶液加热至60℃，通过微孔膜过滤（孔径大小为0.22 μm）净化产品；最后将得到的净化产品在-80 ℃冷冻过夜，然后进行冻干得到明胶甲基丙烯酰水凝胶材料；

（3）缓释阿司匹林脂质体水凝胶的制备

将60mg阿司匹林载药脂质体冻干粉称重，溶解1mL去离子水中，待其完全溶解后，加1%2-羟基-4’-2-羟基乙氧基-2-甲基丙哌酮（PI）（w/w）和20%（w/w）明胶甲基丙烯酰水凝胶，制成预交联溶液（ASP-Lip+GelMA）；然后将预交联溶液分别倒入模具中，使用波长360-480 nm的紫外光照射将预交联溶液交联，光照过程持续10s。

所述的缓释阿司匹林脂质体水凝胶在制备治疗复发性腰椎间盘突出症药物中的应用。

优选的，所述复发性腰椎间盘突出症为纤维环缺损引起的椎间盘退变。

一种治疗复发性腰椎间盘突出症的药物制剂，包括治疗有效量的缓释阿司匹林脂质体水凝胶和药学上可接受的辅料。本发明所述的药学上可接受的辅料，可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。

优选的，所述缓释阿司匹林脂质体水凝胶的含量质量计为1-99%。

更优选的，所述缓释阿司匹林脂质体水凝胶的含量质量计为10-90%。

优选的，所述药物制剂为注射剂。

本发明将通过对复合水凝胶的结构特性及力学特点的观察及体外材料对髓核细胞的炎症影响、体内兔纤维环缺损造模试验来证实缓释阿司匹林脂质体水凝胶治疗纤维环缺损引起椎间盘退变的效果及可能机制。

体外部分：采用SD大鼠髓核细胞与水凝胶材料共培养的方式，通过CCK-8、ELISA检测、RT-PCR、Western-Blot、细胞免疫荧光、活死染色检测水凝胶材料对髓核细胞的影响及水凝胶材料对髓核细胞炎症因子的影响。

体内部分：采用新西兰大白兔L2-3、L3-4、L4-5、L5-6椎间盘制造椎间盘缺损模型进行对比实验，L2-3为正常对照组，L3-4为缺损组，L4-5为缓释阿司匹林脂质体水凝胶组，L5-6为阿司匹林水凝胶组。术后进行力学实验，在术后1 w、2 w进行X-Ray及MRI检查。术后2w取组织标本，脱钙后行苏木素-伊红染（H&E 染色）、番红O-快绿染色和IL-1β、IL-6、TNF-α、Collagen-II、MMP3免疫组化染色。评估各个组的髓核炎症及退变情况。

本发明公开了以下技术效果：

本发明体外结果表明，100h内ASP+GelMA 膨胀率达到617.93±78.55%，但ASP-Lip+GelMA基本保持24h时的膨胀率388.45±80.43%（P<0.05）。ASP+GelMA完全降解的时间比ASP-Lip+GelMA提前（21 d: 28 d）（P <0.05）。ASP-Lip+GelMA的缓释作用明显高于ASP+GelMA。ASP-Lip+GelMA组（60.53±1.49%）的压缩率高于ASP+GelMA组（52.16±1.84%）（P<0.05），在相同的压缩率下，ASP-Lip+GelMA的阻力为48.29±2.69 N，显著高于ASP+GelMA组17.39±2.91 N（P<0.05）。在压缩模量方面，ASP-Lip+GelMA的压缩模量为30.52±1.47kPa，高于ASP+GelMA组19.91±1.16 kPa（P<0.05）。ASP-Lip+GelMA可以在阻力、压缩模量、压缩率方面显著维持力学稳定性。水凝胶材料本身对髓核细胞无负面影响，ASP-Lip+GelMA可明显抑制炎症反应，减少II型胶原及蛋白多糖的丢失。ASP-Lip+GelMA可抑制HMGB1在胞质的表达，核内表达则明显增加。

本发明体内结果表明，ASP-Lip+GelMA在体内阻力、压缩模量、压缩率方面显著优于ASP+GelMA。缺损组的DHI%在第1w有明显的下降，从100%下降至78.10±2.21%（P<0.05），并且在术后2w还有继续下降（P<0.05）。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组在术后1w DHI%分别从100%降至80.10±3.01% 和89.30±2.25%（P<0.05），术后1 w、2 w，ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组椎间隙高度下降幅度均小于缺损组。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组可以更好的减少椎间盘内II型胶原、蛋白多糖及水分的流失（P <0.05）。苏木素-伊红染色、番红O-快绿染色表明注射阿司匹林水凝胶、阿司匹林脂质体水凝胶的椎间盘与缺损组椎间盘相比，其可以封堵缺损的纤维环，减少髓核组织的流失，保持髓核组织的正常形态及有序排列。在组化染色中，ASP-Lip+GelMA可以显著降低IL-1、IL-6、TNF-α、MMP3表达水平，减少髓核组织II型胶原蛋白的缺失。

本发明证实ASP-Lip+GelMA在兔部分纤维环缺损部位的填充、维持力学稳定性和局部炎症的控制方面表现出优越的性能。这种复合水凝胶材料为开发可填充材料，预防部分椎间盘切除术后复发性腰椎间盘突出症提供了一种新的治疗前景。

本发明采用的脂质体在结构上疏水的尾部避开水相而亲水的头部朝向水相，形成一个封闭的囊泡结构，可包载水溶性、脂溶性药物，具有很好的控制释放能力，广泛应用于医药领域。水凝胶在结构上具有网状交联结构，并且具有生物相容性，还能保持一定的生物形状，故其能应用于填补缺损的纤维环，补充缺失的蛋白多糖及II型胶原，从而一定程度地增加椎间盘对椎体压力的缓冲，减缓椎间盘退变。此两种材料均具有生物降解性。本发明通过明胶甲基丙烯酰与载药脂质体的交联作用，包裹阿司匹林，填放于纤维环缺损的椎间盘中，从而达到阿司匹林的缓释作用，减少炎症反应，修补缺损的纤维环，延缓椎间盘退变。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为阿司匹林脂质体的粒径分布、电位、形态图，其中，A: DLS测量的ASP-Lip平均粒径分布；B: DLS测量的ASP-Lip电位；C：透射电镜下ASP-Lip的粒径；

图2为高效液相层析法测得ASP-Lip中ASP释放率曲线图，n=5；

图3为ASP-Lip和GelMA水凝胶的交联结构特点图，其中，A:ASP-Lip和GelMA水凝胶的相互交织示意图；B:图中选取的孔隙测量计算出的孔隙直径分布图；C:扫描电镜下ASP-Lip+GelMA交联结构；D:选取C图中矩形区域进行高倍镜下观察并测定菱形标记颗粒的直径；n=5；

图4为ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA的膨胀率和降解率结果图，其中，A: ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA的膨胀率；B: ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA的降解率；n=5；

图5为水凝胶预交联混液交联过程示意图，其中，A：预交联混液；B：交联后的水凝胶；

图6为万能力学试验机对ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA压缩实验结果图，其中，A：万能力学实验仪器上测得的参数；B：ASP-Lip+GelMA组和ASP+GelMA组压缩率；C：ASP-Lip+GelMA组和ASP+GelMA组阻力；D：ASP-Lip+GelMA组和ASP+GelMA组压缩模量。（ASP-Lip+GelMA组与ASP+GelMA组相比，* P<0.05， n=5）；

图7为ASP-Lip+GelMA和ASP-GelMA中ASP的释放率曲线图，n=5；

图8为正常对照组、缺损组、ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组压缩实验结果图，其中，A：压缩率比较；B：阻力比较；C：压缩模量比较；D：压缩率比较；（缺损组与正常组比，#P<0.05；ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05，n=5）；

图9为X-Pay检查结果示意图，其中，A: X-Ray检查图像；B: 四组DHI%量化图；（缺损组与正常组比，# P<0.05。ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05，n=19）；

图10为MRI检查结果，其中，A: MRI检查图像；B: 四组MRIThompson 评分量化图；（缺损组与正常组比，# P<0.05。ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05，n=19）；

图11为组织学检查中术后2 w 四组 H&E染色结果图；（缺损组与正常组比，# P<0.05，ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05， n=7）（Scar bar =800 μm）；

图12为组织学检查中术后2 w 四组番红O-快绿染色结果图；（缺损组与正常组比，# P<0.05，ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05，n=7）。（Scar bar =800 μm）

图13为术后2 w 对髓核组织进行免疫组化染色结果图，其中，A: IL-1β染色及其量化评分；B: IL-6染色及其量化评分；C: TNF-α染色及其量化评分；D：Collagen-II染色及其量化评分；E: MMP-3染色及其量化评分化染色图；（缺损组与正常组比，# P<0.05，ASP-Lip+GelMA组和ASP-GelMA组与缺损组比，* P<0.05，n=7）（Scar bar =50 μm）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1.阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）的制备与研究

1.1 阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）的制备

采用薄膜分散法制备阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）。将脂质材料卵磷脂和胆固醇（4/1，w/w）混合，和阿司匹林同时溶解在氯仿中（50/1，w/w）。然后将这些复合材料的溶液转移到茄型烧瓶中，用旋转真空蒸发器以100 r/min的速度将有机溶液除去，水浴温度为30℃。在烧瓶瓶体中，经过温和的蒸发，形成了均一的蜂窝状薄膜。此外，通过旋转（100 r/min）和加热（30 ℃），利用预热的40 ℃去离子水（dd H₂O）对这些薄膜进行水合物化。制备了初始载药脂质体，然后分别在不同直径（0.45 μm、0.22 μm）的聚碳酸酯膜上超声挤出，制备阿司匹林载药脂质体（ASP-Lip）。在海藻糖的保护下，对这些脂质体进行冻干，使其粉末状。

1.2 阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）特点的考察

1.2.1 阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）的形态考察

为了探索ASP-Lip的理化特性，采用动态光散射粒度分散仪（DLS）对ASP-Lip的平均粒径、粒径分布和电位进行了评估。将20μL的ASP-Lip滴在铜网表面，2 min后去除多余液体，用20 μL 2%磷钨酸对ASP-Lip染色2 min，去除磷钨酸，待其挥发干后，用透射电镜（Transmission Electron Microscope, TEM）观察ASP-Lip的形态并采集图像。

1.2.2 阿司匹林负载的脂质体（ASP-Lip）的包封及释放考察

采用离心超滤法分离未包封阿司匹林，采用高效液相层析法（high performanceliquid chromatography, HPLC）测定未包封阿司匹林浓度，从而评估阿司匹林的包封效果。包封率=（ASP-Lip中ASP含药总量）/（使用ASP的初始量）×100%。将1 mL ASP-Lip加入到超滤离心管上层（Mw：3000），以5000 r/min的速度离心5 min。离心过程结束后，向上层加入1mL去离子水，再次离心。采用高效液相层析法对底层液体进行采集、检测，以评估未包封阿司匹林浓度。HPLC条件为：流动相由甲基氰化物和水组成（250 : 750）。流速为1.0 mL/min，检测波长设为207 nm。

为进一步研究ASP-Lip体外药物的释放，将ASP-Lip密封于透析袋（Mw：3500）中，浸泡于50 mL 37 ℃ 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）中，置于100 r/min的摇床上摇动。取不同时间点的样品，取1 mL样品，并向其中加入1 mL PBS，用上文提及的高效液相层析法测定了阿司匹林的浓度。释放率=（测得的ASP含药总量）/（样品中ASP含药总量）×100%。

2.缓释阿司匹林脂质体水凝胶及阿司匹林水凝胶的制备及考察

2.1 明胶-甲基丙烯酰(GelMA)的制备

在60℃下不断搅拌，将明胶完全溶解后，取20 g明胶加入200 mL PBS中，一滴一滴加入16 mL甲基丙烯酸酐，滴落过程持续1 h。2 h后，加入800 mL预热至50 ℃的PBS，连续搅拌15min停止反应。然后将产品密封在透析袋中（Mw：8000-12000），透析1 w，去除未反应的甲基丙烯酸酐。1 w后收集透析袋中的溶液加热至60 ℃，通过微孔膜过滤（孔径大小为0.22 μm）净化产品。最后将得到的液体在-80 ℃冷冻过夜，然后进行冻干得到凝胶材料。

2.2 ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA的制备

将60 mg ASP-Lip冻干粉称重，溶解1 mL 去离子水中，待其完全溶解后，加1% 2-羟基-4’-2-羟基乙氧基-2-甲基丙哌酮（PI）（w/w）和20%（w/w）GelMA，制成预交联溶液（ASP-Lip+GelMA）。同时，称取与ASP-Lip+GelMA中等量的ASP，溶解于1 mL去离子水中，完全溶解后加入上述量的PI和GelMA，制备ASP-GelMA的预交联溶液。然后将这些溶液分别倒入模具中。使用波长360-480 nm的紫外光照射将这些溶液交联，光照过程持续10 s。

2.3 水凝胶特点的研究

2.3.1 脂质体水凝胶的交联结构考察

使用扫描电子显微镜对水凝胶的交联情况进行评估。冷冻干燥后，切下一片ASP-Lip+GelMA固定在试件平台上。采用离子溅射仪对样品进行喷金处理，然后用扫描电镜（Scanning Electron Microscope, SEM）观察并采集图像，并用纳米测量仪测量相关数据并记录。随机选取水凝胶中的部分区域，高倍镜下进一步分析脂质体与水凝胶的结合情况，并用纳米测量仪测量相关数据并记录。

2.3.2 水凝胶的压缩、膨胀、降解考察

在压缩试验中，分别用万能力学试验机考察了ASP-Lip+GelMA和ASP-GelMA的力学性能。为了评估水凝胶的膨胀能力，首先取适量水凝胶进行冷冻干燥，得到冻干样品。然后对这些水凝胶进行称重，取其重量为原始重量W0。然后将这些水凝胶浸入PBS中，在不同的时间点对水凝胶进行称重，并将其量记为Wt，然后根据以下公式，绘制曲线图来描述水凝胶的膨胀率。

。

此外，对水凝胶的降解能力进行考察。水凝胶在37 ℃ PBS中浸泡24 h，达到平衡膨胀状态，称重记录其原始质量W0。降解试验采用含有II型胶原酶PBS溶液（2 U/mL），37 ℃微摇。在设定的时间点，剩余的质量定期记录为Wt，然后根据以下公式，绘制曲线图来描述水凝胶的降解率。

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2.3.3 水凝胶的ASP释放考察

分别考察ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA两组中ASP的释放能力。将ASP-Lip密封于透析袋（Mw：3500）中，浸泡于50 mL 37 ℃ PBS中，置于100 r/min的摇床上摇动。在不同时间点，取1 mL样品，并向其中加入1 mL PBS，用上文提及的高效液相层析法测定阿司匹林的浓度。释放率=（测得的ASP含药总量）/（样品中ASP含药总量）×100%。

3.统计学分析

结果数据采用SPSS 25.0统计软件分析，多组比较选用单因素方差分析（One-wayANOVA 检验），两两比较在总体方差齐的条件下，选用LSD及Dunnett-t法进行分析。P <0.05表示数据差异有统计学意义。

结果：

1.ASP-Lip的形态及体外释放特点：

作为复合水凝胶体系的基础，对ASP-Lip进行了较为全面的研究。利用透射电子显微镜、动态光散射粒度分散仪对这些阿司匹林脂质体的粒径分布、电位、形态和体外释药行为进行了考察。如图1A所示，ASP-Lip平均粒径分布均匀，平均粒径为141.8±1.9 nm。ASP-Lip的电位如图1 B所示，在ASP-Lip检测结果中可以发现其平均电位为11.2±2.3 mV，部分原因是ASP是一种带明显正电荷的药物。利用透射电镜进一步研究了ASP-Lip的结构，如图1 C所示。可见，ASP-Lip呈圆形外观，具有双分子层结构，且图中ASP-Lip粒径大小与DLS数据相符。

为进一步研究ASP-Lip，离心超滤法分离未包封ASP，并用HPLC测定其浓度。测得的ASP-Lip包封率为86.3±2.9%。图2描述了ASP-Lip中ASP的释放结果，在前6 h，ASP表现出初始的爆发性释放（72.9±2.8%）。经过一段时间后，可以观察到持续缓慢的释放，在体外几乎达到100%的累积释放。

2.水凝胶的交联结构特点

ASP-Lip和GelMA水凝胶的相互交织由以下示意图3A所示，一些诸如氮等元素在水凝胶网络结构中可能与脂质体表面的一些元素，如磷和氧气等产生氢键，这能使脂质体和水凝胶之间形成形成微交联。这些氢键提高了合成水凝胶的力学性能。

利用扫描电子显微镜观察水凝胶的形态（图3 C）。可见脂质体水凝胶在电镜下孔径圆滑、壁薄、孔洞大小均匀。随机选中区域放大（图3 D），可以看到水凝胶表面存在圆形颗粒，纳米测量仪测定了这些颗粒的直径大小约为126.3 nm，与上述ASP-Lip粒径相似。由此可推断这些粒子即是ASP-Lip。阿司匹林成功包封。随机选取图4A中的100个孔来计算孔隙的平均直径。结果如图3 B所示，大部分孔隙均匀分布，平均直径约为21.45 μm。

3.水凝胶的降解和膨胀率

如图4 A所示，本发明研究了ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA的膨胀率。在前24 h，这两种水凝胶均吸收了大量的水分，ASP+GelMA的膨胀率为538.52±19.43%，而ASP-Lip+Gel的膨胀率388.45±80.43%。在24 h至100 h内，ASP+GelMA仍然在100 h内保持吸水性，平均在100h时达到617.93±78.55%，但ASP-Lip+GelMA将保持之前膨胀率到测试结束。这种相对较低的膨胀率有利于水凝胶的植入性，因为它可以限制水的穿透量和植入后体积的变化程度。这可能是由于脂质体与凝胶网络的微交联有关，限制了水的渗透过程。

如图4 B所示，第21天ASP-GelMA的残余质量为0。相比之下，ASP-Lip+GelMA在第21天仍有11.4±3.6%的残留量，并且在第28天完全降解。对于植入性，保持完整的结构是发挥其他功能的基础。ASP-Lip+GelMA的长时间降解保证了术后药物的持续释放。

4.水凝胶的力学特点

水凝胶预交联混液交联过程如图5 A和B所示。在紫外光照射10 s后，预交联混溶液变成水凝胶。快速交联工艺使其可用于外科手术。为了研究添加脂质体对水凝胶力学性能的影响，采用万能力学试验机对ASP-Lip+GelMA和ASP+GelMA进行了压缩实验，结果如图6所示。

在压缩实验部分，ASP-Lip+GelMA组的压缩率高于ASP+GelMA组，其中ASP-Lip+GelMA组压缩率为60.53±1.49%，ASP+GelMA组压缩率为52.16±1.84%。在相同的压缩率下，ASP-Lip+GelMA的阻力为48.29±2.69 N，显著高于ASP+GelMA组17.39±2.91 N（P<0.05）。在压缩模量方面，ASP-Lip+GelMA的压缩模量为30.52±1.47 kPa，高于ASP+GelMA组19.91±1.16 kPa（P<0.05），其压缩模量与阻力结果具有相同的趋势。从这些结果可以看出，ASP-Lip+GelMA组在压缩率、阻力及压缩模量均由于ASP+GelMA组。

5.ASP在水凝胶中的释放

多功能水凝胶发挥协同治疗作用的效果体现在药物均匀分布、药物控释、局部浓度上。因此，本发明研究了ASP-Lip+GelMA和ASP-GelMA水凝胶控制ASP释放的能力。从图7中可以看出，ASP-Lip+GelMA（65.14±1.46%）的累积释放率明显高于ASP+GelMA（94.99±1.00%）（P<0.05），这可能是由于ASP-Lip+GelMA中ASP的聚集所致。ASP-Lip+GelMA中ASP的持续缓慢释放，可更好地抑制术后局部炎症反应。

实施例2

1.实验动物分组

实验分为正常对照组、缺损组、阿司匹林水凝胶组、缓释阿司匹林脂质体水凝胶组四组（表1），为避免实验动物个体引起的差异性，选取在同一个兔子体内的不同腰椎节段进行实验研究。

表1 实验动物分组

2.兔椎间盘退变模型的建立

新西兰大白兔有7节腰椎。手术前常规予禁食12 h，禁饮4 h。予速眠新0.2 mL/kg于大腿肌肉注射，予2 mg/mL戊巴比妥钠5 mL大腿肌肉注射，约20 min后，兔子可完全进入麻醉状态。麻药选用肌肉注射可大大降低静脉麻醉风险。术前肌注青霉素80万单位，常规剃毛、备皮后，安尔碘消毒、铺巾，手术采用侧方腹膜外入路，于左侧第12肋末端到髂棘作长约 10cm纵切口，切开皮肤、皮下组织，予温盐水纱布止血后，显露并沿切口线切开腹外斜肌、腹内斜肌和腹横筋膜，手术刀柄配合手指推开腹膜外脂肪组织，触及横突后，剪开胸腰筋膜前层，显露腰大肌，用手术刀柄纵行分开，即可显露椎体和椎间盘侧前方。兔髂嵴平腰6椎体，以此定位，暴露 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6 椎间隙。以18 G针头从椎体前方刺入椎间隙，限深为5 mm（兔椎间盘前后径6-8.5 mm，前方纤维环厚度约为2-3 mm），刺入后针头旋转一周，停留30 s，随即轻轻拔出针头，可见椎间盘前方留有一明显针孔印记，可见透明状胶体从针孔溢出（主要为髓核组织）。

3.兔椎间盘药物注射

椎间盘缺损模型建好后，沿18 G针孔口用1 mL注射器在L4-5椎间隙注射阿司匹林脂质体水凝胶0.5 mL，换用新的1 mL注射器，在L5-6椎间隙注射阿司匹林水凝胶0.5 mL。其中L4-5、L5-6椎间隙注射的阿司匹林脂质体水凝胶在紫外灯下进行光照交联，交联时间为 10s，生理盐水清洗后丝线逐层缝合，切口周围注射罗哌卡因，缝合后切口用无菌敷料覆盖。平均手术时长为40 min。术后三天每天肌注青霉素80万单位。

4.力学实验

注射完阿司匹林脂质体水凝胶并交联完后，为了避免解剖结构的差异造成力学测试的误差，选择5只实验兔L4-5椎体作为实验对象。将椎体上下两端埋入牙粉打磨，保持平行。在力学机械试验机上进行力学实验，椎体上下逐渐加压，直至看见凝胶样物质开始从纤维环缺口中挤出。

5.兔椎间盘退变的影像学检查及评估

5.1 X线检查及分析

手术后1 w、2 w分别对兔子进行X-Ray检查，采取相同的麻醉方法后，将兔子以侧卧位置于X-Ray机上，摄取X-Ray图片。以图标比例尺对椎体高度及椎间隙高度进行测量，从而算出椎间隙高度指数（Disc Height Index，DHI），以DHI% 来表示椎间盘高度在术前术后的变化。其具体测量及算法如下：DHI=（BC+EF）/（AB+DE），DHI% =（DHI_术后/DHI_术前）×100%。

5.2 MR检查及数据分析

实验兔按同样方法麻醉后，仰卧位置于定制木板（影像科自制）上，固定四肢，用细线从兔子中切齿和尾巴固定拉直实验兔躯干，使其呈仰卧位完全固定木板上，固定四肢。然后将木板置于西门子3.0T核磁共振（Magnetic Resonance Imaging，MRI）膝关节线圈内，按照预设扫描参数进行定位扫描。按MRI扫描所得T2图像进行分析处理。采取改良Thompson法进行量化，改良Thompson法可分为1-4级：1级，椎间盘信号完全正常；2级，椎间盘信号强度轻微降低，但是高信号区面积缩小；3级，中等信号轻度减弱；4级，信号轻度明显减弱。

6.实验标本的获取

术后2 w做完X-Ray及MRI检查后，在麻醉状态下，过量戊巴比妥至兔子死亡。完整取下实验兔子 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6 椎间盘，修剪附着在椎体及椎间盘周围的肌肉组织，用咬骨钳去除大部分椎体骨质及椎间盘后方椎板及棘突，只保留椎间盘及上下终板、少量邻近椎间盘骨质。

7.实验标本的制备

7.1脱钙

取下的标本在福尔马林溶液固定48 h，自来水冲洗后置入10% EDTA溶液中，密封好置于摇床上，每天更换脱钙液，视脱钙情况，适当修剪周围已经软化的骨质，直至椎间盘周围骨质完全软化。

7.2脱水、包埋

将完全软化的椎间盘标本修剪整齐，尽量去除多余骨质，冲洗干净后置于包埋盒中，进行乙醇梯度脱水。先将包埋盒放入60%乙醇溶液，置于37 ℃恒温水浴锅中1 h，然后依次换用70%乙醇溶液1 h、80%乙醇溶液1 h、90%乙醇溶液2 h、95%乙醇溶液2 h，最后将包埋盒置于正丁醇溶液中12 h。将装有标本的包埋盒从正丁醇中取出，置于包埋机融蜡盒中4 h，然后将包埋盒置于另一侧相对清洁融蜡盒中4 h。将包埋模具里装满纯蜡，将包埋盒中的兔椎间盘标本冠状面朝下置于模具纯蜡中，将模具注满纯蜡后盖上包埋盒，置于-20 ℃冷却台上固定，约1 h后取下蜡块，常温保存。

7.3切片

先将常温保存的蜡块置于-20 ℃冰箱中2 h左右，然后将蜡块固定于石蜡切片机上，冠状面朝外，先将切片厚度设置为10 μm进行修片，直至肉眼看到切到髓核组织，取最近的切片摊于载玻片上，直接显微镜下低倍镜观察，确认已经切到髓核组织。然后调整切片厚度为6 μm进行切片，取得的薄组织标本先漂浮于冷水之上，用载玻片捞起后置于42 ℃水浴锅中展片，熨烫约30 s后可使其完全与载玻片贴合，将覆盖有切片的载玻片置于62 ℃烤片机上烘烤约2 h后，载玻片保存于切片盒中备用。

8.组织学实验

8.1苏木素-伊红染色（H&E 染色）

苏木素-伊红染色为最基本的染色方法。苏木素为碱性试剂，主要使细胞核内的染色质和细胞质内的核糖体染为紫蓝色；伊红为酸性试剂，主要使细胞质和细胞外基质中的成分染为红色。通过H&E 染色，可以观察椎间盘的大体结构，了解髓核的大体变化及纤维环的相关情况。具体操作步骤如下（操作过程轻柔，尽量避免脱片）：

（1）挑选好欲染色的切片，置于染色架上，70 ℃烤箱烘烤1 h至切片薄蜡完全融化。

（2）将融化的切片置于二甲苯溶液中15 min×2次。

（3）复水过程：依次将切片置入无水乙醇3 min×2次，95%乙醇3 min×2次，85%乙醇3 min×1次，75%乙醇3 min×1次，60%乙醇3 min×1次。

（4）苏木素溶液染色3 min 45 s后，自来水浸洗10 min。

（5）2%乙酸1 min，自来水浸洗5 min。

（6）氨水1 min（提拉10次），自来水浸洗5 min。

（7）95%乙醇5 s。

（8）伊红染色2 min。

（9）梯度酒精脱水：95%乙醇2 min×2次，无水乙醇3 min。

（10）二甲苯溶液中3 min×2次

（11）中性树脂封片，通风厨晾干后显微镜下观察。

8.2番红 O-快绿染色

番红O为碱性试剂，可与椎间盘内的胶原纤维、蛋白聚糖和水等物质结合而呈现出橘红色；而髓核组织周围的纤维环及上下软骨终板则与快绿试剂结合而呈现出绿色。据此，可以观察实验前后髓核形态变化情况。其具体操作步骤如下（操作过程轻柔，尽量避免脱片）：

（1）挑选好欲染色的切片，置于染色架上，70 ℃烤箱烘烤1 h至切片薄蜡完全融化。

（2）将融化的切片置于二甲苯溶液中15 min×2次。

（3）复水过程：依次将切片置入无水乙醇3 min×2次，95%乙醇3 min×2次，85%乙醇3 min×1次，75%乙醇3 min×1次，60%乙醇3 min×1次。

（4）苏木素溶液染色2 min 45 s后，自来水浸洗10 min。

（5）2%乙酸1 min，自来水浸洗5 min。

（6）氨水1 min，自来水浸洗5 min。

（7）快绿染色6 min。

（8）1%乙酸分化15 s，上下提拉9次。

（9）番红O染色6 min。

（10）梯度酒精脱水：95%乙醇1 min，无水乙醇1 min，无水乙醇3 min。

（12）二甲苯溶液中3 min×2次。

（13）中性树脂封片，通风厨晾干后显微镜下观察。

8.3组织学分析

采用Masuda椎间盘组织学分级量表，评估纤维环、纤维环与髓核的边界、髓核的细胞结构及髓核基质情况。

Masuda椎间盘组织学分级量表

9.免疫组化染色

免疫组化，是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。其具体步骤如下（操作轻柔，尽量避免脱片）：

（1）挑选好欲染色的切片，置于染色架上，70 ℃烤箱烘烤1 h至切片薄蜡完全融化。

（2）将融化的切片置于二甲苯溶液中15 min×2次。

（3）将切片置于无水乙醇3 min×2次。

（4）3%过氧化氢+甲醇溶液30 min×2次。

（5）95%乙醇3 min×2次，85%乙醇1 min×1次，70%乙醇1 min×1次，去离子水洗片5 min。

（6）抗原修复：滴加透明质酸酶在 37 ℃下孵育70 min，甩片后滴加蛋白酶，常温孵育10 min。PBS洗片5 min×3次。

（7）滴加马血清，封闭抗原。

（8）除去血清，滴加稀释过的一抗，4-6 ℃冷藏孵育12 h。（每片每张标本约需消耗稀释的一抗约100 μL）

（9）PBS洗片5 min×3次，除去PBS液，滴加二抗，室温下孵育30 min。

（10）PBS洗片5 min×3次，除去 PBS液，滴加三抗，室温下孵育30 min。

（11）PBS洗片5 min×3次，除去 PBS 液，滴加 DAB 显色剂显色，抗体不同，DAB显色时间不同，可在显微镜观察下进行调色。去离子水浸泡5 min。

（12）苏木素染色2 min30 s，自来水冲洗10 min。

（13）2%乙酸溶液1 min，上下提拉10次。自来水洗5 min。

（14）氨水1 min。自来水洗5 min。

（15）95%乙醇3 min×1次，无水乙醇5 min×2次。

（16）二甲苯溶液中通透3 min×2次。

（17）中性树脂封片，通风厨晾干后显微镜下观察。

10.统计学分析

结果数据采用SPSS 25.0统计软件分析，多组比较选用单因素方差分析（One-wayANOVA 检验），两两比较在总体方差齐的条件下，选用LSD及Dunnett-t法进行分析。P <0.05表示数据差异有统计学意义。

实验结果：

1.建模情况

实验的20只新西兰大白兔麻醉、手术过程中未出现一例死亡，术后均能成功苏醒。术后1 w做X-Ray、MRI检查，其中一只兔子出现手术区域感染灶（MRI判断），其余实验兔子未发现明显感染迹象。及时将感染的兔子清除出实验组。术后2 w做X-Ray、MRI检查时，所有兔子均状态良好，未发现明显感染迹象。标本的获取均比较成功。

2.力学实验结果

采用针扎法在兔椎间盘缺损模型上注射外源性ASP-Lip+GelMA。加压后，选择髓核从缺损处开始溢出作为研究的终点。压缩试验结果（图8 A-D）显示，ASP-Lip+GelMA的压缩率高于缺损组，其中ASP-Lip +GelMA组为58.33±2.86%，缺损组为37.25±3.26%（P<0.05）。同一研究终点，ASP-Lip+GelMA组的阻力为69.67±4.64N，显著高于缺损组37.32±4.49N （P <0.05）。在压缩模量方面，与阻力结果具有相同的趋势，ASP-Lip+GelMA的压缩模量为14.40±1.14 kPa，高于缺损组的9.95±8.16 kPa（P<0.05）。同时，ASP-GelMA组的力学性能较缺损组亦有较大提高，但与ASP-Lip+GelMA组有较大差异（P <0.05）。从这些结果可以看出，ASP-Lip+GelMA组在压缩率、阻力、压缩模量方面均优于缺损组和ASP-GelMA组。

3.X-Ray检查结果

术后X-Ray可以直观地显示椎间隙高度的变化（图9 A）。使用DHI%能够更准确地判断椎间隙在术后1 w、2 w的高度变化情况。实验中获取的CR图像结果显示，在整个研究周期内，对照组的椎间隙高度未见明显变化。缺损组的椎间隙高度在术后1 w即可发生明显的缩窄，DHI%在第1 w有明显的下降，从100%下降至78.10±2.21%（P<0.05），并且在术后2 w还有继续下降（P<0.05）。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组在术后1 w DHI%分别从100%降至80.10±3.01% 和89.30±2.25%（P<0.05），术后1 w、2 w，ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组椎间隙高度下降幅度均小于缺损组。（图9 B）

4.MRI检查结果

正常的髓核组织中水成分较多，而水成分会随着髓核退变减少。水在MRI-T2WI表现为高信号，因此可通过椎间盘髓核组织T2加权像的表现，间接反映椎间盘的退变情况，并对椎间盘信号的强弱采用改良型Thompson评分进行量化比较。术后1 w、2 w，缺损组椎间隙明显变窄，边缘模糊不清，髓核组织信号相对于对照组明显减弱（图10 A），等级为3.7±0.4和3.8±0.5（P<0.05）。ASP-GelMA组髓核信号在第1 w有所降低，但在第2 w降低更明显。ASP-Lip+GelMA组在术后2 w退变与退变组有显著差异（P<0.05），但术后2 w与术后第1 w未见明显差异（P>0.05）（图10 B）。

5.组织学检查结果

苏木素-伊红染色可使细胞核内的染色质和细胞质内的核糖体染为紫蓝色，使细胞质和细胞外基质中的成分染为红色。正常的髓核组织染色可见椎间盘由圆滑饱满的椭圆形髓核和四周呈环形有层次感的纤维环包绕。髓核内可见规则排列的髓核细胞、髓核基质及胶原蛋白，髓核上下有完整的软骨终板包裹，软骨细胞排列整齐、连续。术后2 w的石蜡切片HE染色可见缺损组的髓核细胞排列紊乱，开始出现无组织结构区域，髓核组织开始向一旁皱缩。而ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组HE染色仍能清晰地看到髓核的组织结构，髓核细胞排列紊乱不明显，但两者之间并未见明显差别。根据Masuda椎间盘组织学分级，可发现，术后缺损组椎间盘可发生明显的退变（P<0.05）。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组退变程度与缺损组有明显差异（P<0.05）（图 11）。

番红 O-快绿染色可使椎间盘内的胶原纤维、蛋白聚糖和水等物质呈现出橘红色；而随和组织周围的纤维环及上下软骨终板呈现出绿色。正常的椎间盘髓核内含有大量II型胶原及蛋白聚糖，番红 O-快绿染色可见椎间盘饱满，胶原纤维、蛋白聚糖充满整个椎间盘，纤维环完整。退变的的髓核组织可见髓核内胶原纤维、蛋白聚糖和水分明显减少，髓核组织破裂、皱缩，失去原有形态。术后2 w，缺损组髓核组织明显减少并伴有纤维环的破裂，而ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组的髓核组织中仍保留有大量胶原纤维、蛋白聚糖。ASP-Lip+GelMA组较ASP-GelMA组有明显的减缓退变优势。根据上述椎间盘组织学分级，可发现，术后退变组椎间盘可发生明显的退变（P<0.05）。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组退变程度与退变组有明显差异（P<0.05）（图 12）。

6.免疫组化染色结果

炎症细胞因子在椎间盘退变中起重要作用。TNF-α主要通过诱导细胞凋亡从而影响椎间盘细胞的功能，形成退变。IL-1β调控细胞外基质的分解代谢功能，通过传导通路，诱导Ⅱ型胶原及聚蛋白聚糖降解。IL-6可促进炎症反应，也可通过影响椎间盘基质降解酶的抑制酶，增加Ⅱ型胶原及聚蛋白聚糖降解。MMP3是基质金属蛋白酶家族的主要成员，诱导蛋白多糖尤其是细胞外基质中的蛋白多糖的降解。因此，本发明通过TNF-α、IL-1β、IL-6、Collagen-II、MMP3验证ASP-Lip+GelMA在兔椎间盘缺损模型中的保护作用。

免疫组化结果发现，高倍镜（400×）下，术后2 w缺损组IL-1β深染阳性细胞数急剧上升，对比正常对照组差异明显（P<0.05）。ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组较正常组有所上升，但是与缺损组相比较，IL-1β水平有明显降低（P<0.05）（图13 A）。缺损组IL-6深染的细胞核和细胞质水平较正常组差异明显（P<0.05），ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组与缺损组相比，有明显差异（P<0.05），ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组之间并没有明显差异（P>0.05）（图13 B）。TNF-α变化水平与IL-1β、IL-6类似，缺损组TNF-α在术后2 w上升明显（P<0.05），深染细胞胞质和胞核明显增多，ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组阳性区域增加不明显，但是ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA相对于缺损组，则存在明显差异（P<0.05）（图13 C）。术后2 w，Collagen-II染色阳性区域面积减少，着色变浅，排列稀疏，较正常组下降约60%（P<0.05），ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组较退变组，Collagen-II染色阳性区域增加40.23±4.56%和41.1±3.45%（P<0.05），但是组内之间并无明显差异（P>0.05）（图13 D）。MMP3在正常髓核组织中表达较少，仅5.34±1.23%。缺损组染色MMP3阳性细胞数增加约33%（P<0.05），MMP3在ASP-GelMA组和ASP-Lip+GelMA组中相对于缺损组降低明显（P<0.05），但相对于正常组还是有所上升，其中ASP-GelMA组上升明显，ASP-Lip+GelMA组上升不明显（图13E）。

通过以上实验得知，ASP-Lip+GelMA在体内与ASP +GelMA相比具有更好的力学性能。ASP-Lip+GelMA在体内能很好地维持椎间隙的高度，延缓椎间盘的退变。ASP-Lip+GelMA中阿司匹林的缓释能很好地起到抗炎作用，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP3显著降低，并且还能维持Collagen-II含量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种缓释阿司匹林脂质体水凝胶，其特征在于，包括阿司匹林、脂质体和明胶甲基丙烯酰水凝胶，其中，所述明胶甲基丙烯酰水凝胶与所述脂质体交联，所述脂质体负载所述阿司匹林。

2.一种如权利要求1所述的缓释阿司匹林脂质体水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）阿司匹林负载的脂质体的制备

将脂质材料卵磷脂和胆固醇混合，和阿司匹林同时溶解在氯仿中；然后将这些复合材料的溶液转移到茄型烧瓶中，用旋转真空蒸发器将有机溶液除去；在烧瓶瓶体中，经过温和的蒸发，形成了均一的蜂窝状薄膜；然后，通过旋转和加热，利用预热的去离子水对蜂窝状薄膜进行水合物化，即制得了初始载药脂质体，然后分别在不同直径的聚碳酸酯膜上超声挤出，即制得阿司匹林载药脂质体，然后，在海藻糖的保护下，对所述阿司匹林载药脂质体进行冻干，使其粉末状；

（2）明胶甲基丙烯酰水凝胶的制备

将明胶在60℃下不断搅拌至完全溶解后，取明胶加入PBS缓冲液中，一滴一滴加入甲基丙烯酸酐，滴落过程持续1h；2h后，加入预热至50℃的PBS缓冲液，连续搅拌15 min停止反应；然后将其密封在透析袋中，透析1周，去除未反应的甲基丙烯酸酐；1周后收集透析袋中的溶液加热至60℃，通过微孔膜过滤净化产品；最后将得到的净化产品在-80 ℃冷冻过夜，然后进行冻干得到明胶甲基丙烯酰水凝胶材料；

（3）缓释阿司匹林脂质体水凝胶的制备

将阿司匹林载药脂质体冻干粉称重，溶解去离子水中，待其完全溶解后，加1wt% 2-羟基-4’-2-羟基乙氧基-2-甲基丙哌酮和20wt%明胶甲基丙烯酰水凝胶，制成预交联溶液；然后将预交联溶液分别倒入模具中，使用波长360-480 nm的紫外光照射将预交联溶液交联，光照过程持续10s。

3.如权利要求1所述的缓释阿司匹林脂质体水凝胶在制备治疗复发性腰椎间盘突出症药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述复发性腰椎间盘突出症为纤维环缺损引起的椎间盘退变。

5.一种治疗复发性腰椎间盘突出症的药物制剂，其特征在于，包括治疗有效量的缓释阿司匹林脂质体水凝胶和药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的治疗复发性腰椎间盘突出症的药物制剂，其特征在于，所述缓释阿司匹林脂质体水凝胶的含量质量计为1-99%。

7.根据权利要求6所述的治疗复发性腰椎间盘突出症的药物制剂，其特征在于，所述缓释阿司匹林脂质体水凝胶的含量质量计为10-90%。

8.根据权利要求5-7任一项所述的治疗复发性腰椎间盘突出症的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射剂。