CN114224839A - 一种细胞膜修饰脂质体的方法 - Google Patents

一种细胞膜修饰脂质体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细胞膜修饰脂质体的方法，包括将脂质材料溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕形成脂质干燥薄膜，再向上述脂质干燥薄膜中加入含细胞膜的水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，得到细胞膜修饰的脂质体。与在已形成的脂质体表面修饰细胞膜方法相比，本发明一步完成脂质体的制备和细胞膜的修饰，不仅可以获得细胞膜修饰的脂质体，还可以减少在制备过程中引起的药物渗漏，用作药物载体可提高药物生物相容性、载药量以及药物的肿瘤靶向性。

Description

一种细胞膜修饰脂质体的方法
技术领域
本发明属于材料和生物医学技术领域，具体涉及一种细胞膜修饰脂质体的方法。
背景技术
脂质体是由磷脂或磷脂与胆固醇按比例在水相中自发形成的双分子层囊泡，囊泡的内水相可装载水溶性药物，脂质分子的不饱和脂肪酸链之间可安插脂溶性药物，因此水溶性好和脂溶性好的药物都能很好地装载到脂质体中，所形成的脂质体载药粒子在疾病诊断和治疗领域有广泛应用。虽然脂质体的生物相容性和载药性能均很好，粒度可控，但静脉注射后，作为外来异物，相当一部分脂质体还未抵达病灶(如肿瘤)部位，就被体内免疫系统识别和清除。为了提高脂质体向病灶部位输送的效率，常在脂质体上修饰聚合物尤其是聚乙二醇(PEG)，以减少与调理素的相互作用和免疫系统的识别吞噬，延长在体内的循环时间。但是，PEG在体内稳定性有限，还有可能引起体液免疫反应，如发生抗PEG免疫响应，还会引起血液凝结和细胞凝结，且仍存在被体内网状内皮系统识别和吞噬的机会，不具备识别癌细胞的能力。
在脂质体等纳米粒子表面修饰细胞膜，所获得的载药系统在体内靶向输送方面明显优于PEG修饰。细胞膜属于天然材料，生物相容性好，细胞膜表面上的一些蛋白如CD47可免于宿主免疫系统攻击，逃避巨噬细胞吞噬，使载药粒子能“隐蔽”地在体内长循环，从而有更多机会进入病灶；而且有些细胞有“粘附”肿瘤细胞的能力，具有主动靶向肿瘤组织的能力，这种仿生纳米粒子在提高肿瘤靶向成像和靶向治疗效率方面有重要意义。
构建细胞膜修饰的纳米粒子通常分两步：首先准备好纳米粒子，然后在纳米粒子表面修饰细胞膜[Gao,et al.,Surface Functionalization of Gold Nanoparticleswith Red Blood Cell Membranes.Adv.Mater.2013,25,3549–3553]，制备过程主要是将细胞膜与纳米粒子进行混合，然后反复通过微孔进行挤压。但是，对于已经装载药物的纳米粒子，在其表面修饰细胞膜的过程会引起药物渗漏，特别是载药脂质体，由于脂质体膜的流动性，细胞膜与载药脂质体反复通过微孔挤压的过程会改变脂质体的大小和形貌，促进药物渗漏，不利于获得高载药量的载药纳米粒子。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种细胞膜修饰脂质体的方法，一步完成脂质体的制备和细胞膜的修饰，该方法可减少制备过程中的药物渗漏。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种细胞膜修饰脂质体的方法，包括以下步骤：
(1)将脂质材料溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕形成脂质干燥薄膜；
(2)向上述脂质干燥薄膜中加入含细胞膜的水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，得到细胞膜修饰的脂质体。
优选地，所述脂质材料选自磷脂或磷脂与胆固醇的混合物，其中磷脂选自天然磷脂或人工合成的磷脂。
优选地，所述细胞膜来源于人或动物离体组织的细胞，选自红细胞膜、上皮细胞膜、白细胞膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、血小板膜或肿瘤细胞膜中的一种或两种以上组合。
优选地，所述脂质材料和细胞膜的比例满足：当所述脂质材料为3mg时，所述细胞膜来源于1×104–1×107个细胞提取得到；如果脂质材料大于3mg时，细胞膜的量按上述比例增加；如果脂质材料小于3mg，细胞膜的量按上述比例减少。
优选地，所述水合包括向所述脂质干燥薄膜加入含细胞膜的水溶液后进行振荡或旋转或搅拌使所述脂质干燥薄膜逐渐分散于水相中，水合时间为1–24h；
和/或所述分散选自超声波分散或高速搅拌分散，分散时间为5–30min；
和/或所述微孔挤压采用多孔聚碳酸酯膜进行挤压，微孔孔径选自800nm、650nm、400nm、200nm、100nm中的一种，或者依次通过孔径为800nm、650nm、400nm、200nm、100nm的滤膜进行挤压。
优选地，所述脂质体上载有脂溶性药物或水溶性药物。
更优选地，在装载脂溶性药物的脂质体上修饰细胞膜的方法包括：将脂溶性药物和脂质材料一起溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕后形成药-脂干燥薄膜，然后向上述药-脂干燥薄膜中加入含有细胞膜的水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，即得。
更优选地，在装载水溶性药物的脂质体上修饰细胞膜的方法包括：将脂质材料溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕后形成脂质干燥薄膜，然后向上述脂质干燥薄膜中加入细胞膜和水溶性药物的混合水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过将细胞膜加入到脂质膜材中，在脂质体形成过程中，细胞膜修饰到脂质体上，一步完成脂质体的制备和细胞膜的修饰，步骤简单，同时减少制备过程中的药物渗漏。
附图说明
图1是由3g磷脂和来源于1×107个巨噬细胞的细胞膜形成的细胞膜修饰的脂质体复合粒子的电镜图(实施例1中4号样品)。
图2是由3g磷脂和来源于1×107个巨噬细胞的细胞膜和0.1mg顺铂形成的细胞膜修饰的脂质体复合粒子的电镜图(实施例2中5号样品)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
精确称取大豆磷脂15mg，用5mL氯仿溶解。向5个干燥的梨形玻璃瓶中分别加入上述氯仿溶液1mL(即每瓶含3mg的大豆磷脂)，梨形玻璃瓶编号为1、2、3、4、5号，氮气保护下旋转蒸发挥去氯仿，形成干燥磷脂薄膜。
提取巨噬细胞膜，方法是：以含10％的血清和1％双抗的高糖DMEM为培养基，于含5％CO2的培养箱37℃培养Raw264.7巨噬细胞，当细胞数量为1×107时，收集细胞，加入5mM的EDTA，离心，用pH约为7.4的Tris-镁缓冲液冲洗细胞，再将细胞分散于Tris-镁缓冲液中，采用没有装载聚碳酸酯膜的微型挤出器挤出20次左右，以破坏细胞，挤出产物与1M蔗糖混合，先低速离心，收集上清液，然后高速离心，收集沉淀，用1M蔗糖和Tris-镁缓冲液的混合液洗涤沉淀，再离心，收集沉淀，沉淀分散于PBS溶液中。
用PBS将巨噬细胞膜稀释成3个浓度，即PBS中含有来源于1×104个细胞的细胞膜、来源于1×105个细胞的细胞膜、来源于1×107个细胞的细胞膜，体积均为3mL。
向上述1号梨形玻璃瓶中加入3mL由PBS分散的来源于1×104个巨噬细胞的细胞膜，封口后，于摇床中分别振摇1h，再超声分散5min，得到的样品编号为1号。
向上述2号梨形玻璃瓶中加入3mL由PBS分散的来源于1×104个巨噬细胞的细胞膜，封口后，于摇床中分别振摇1h，再超声分散5min，然后，用微孔孔径为650nm的微孔滤膜挤压，得到的样品编号为2号。
向上述3号梨形玻璃瓶中加入3mL由PBS分散的来源于1×105个巨噬细胞的细胞膜，封口后，于摇床中分别振摇5h，再超声分散10min，得到的样品编号为3号。
向上述4号梨形玻璃瓶中加入3mL由PBS分散的来源于1×107个巨噬细胞的细胞膜，封口后，于摇床中分别振摇24h，再超声分散30min，得到的样品编号为4号，其微观结构如图1所示。
实施例2
制备装载药物的细胞膜修饰的脂质体复合粒子，方法如下：
(1)精确称取大豆磷脂3mg，用1mL氯仿溶解，氮气保护下旋转蒸发挥去氯仿，形成干燥磷脂薄膜。向3mL由PBS分散的来源于1×105个巨噬细胞的细胞膜溶液中加入0.5mL的顺铂PBS溶液，顺铂最终浓度为0.15mg/mL，将该同时含有细胞膜和顺铂的PBS溶液加入到上述磷脂薄膜中，封口后，于摇床中分别振摇5h，再超声分散5min，得到的样品编号为5号，其微观结构如图2所示。
(2)精确称取大豆磷脂3mg，加入溶解有二氢卟吩e6(0.1mg)的氯仿溶液1mL，氮气保护下旋转蒸发挥去氯仿，形成磷脂和药物的混合薄膜。然后加入3mL由PBS分散的来源于1×105个巨噬细胞的细胞膜溶液，封口后，于摇床中分别振摇5h，再超声分散5min，得到的样品编号为6号。
实验结果表明，在透射电子显微镜下，均能观察到接近球形或囊泡状纳米粒子，多数在150-400nm之间，如附图1、2所示。

Claims (8)

1.一种细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将脂质材料溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕形成脂质干燥薄膜；
(2)向上述脂质干燥薄膜中加入含细胞膜的水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，得到细胞膜修饰的脂质体。
2.根据权利要求1所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，所述脂质材料选自磷脂或磷脂与胆固醇的混合物，其中磷脂选自天然磷脂或人工合成的磷脂。
3.根据权利要求1所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，所述细胞膜来源于人或动物离体组织的细胞，选自红细胞膜、上皮细胞膜、白细胞膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、血小板膜或肿瘤细胞膜中的一种或两种以上组合。
4.根据权利要求3所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，所述脂质材料和细胞膜的比例满足：当所述脂质材料为3mg时，所述细胞膜来源于1×104–1×107个细胞提取得到。
5.根据权利要求1所述细胞膜修饰脂质体的制备方法，其特征在于，所述水合包括向所述脂质干燥薄膜加入含细胞膜的水溶液后进行振荡或旋转或搅拌使所述脂质干燥薄膜逐渐分散于水相中，水合时间为1–24h；
和/或所述分散选自超声波分散或高速搅拌分散，分散时间为5–30min；
和/或所述微孔挤压采用多孔聚碳酸酯膜进行挤压，微孔孔径选自800nm、650nm、400nm、200nm、100nm中的一种，或者依次通过孔径为800nm、650nm、400nm、200nm、100nm的滤膜进行挤压。
6.根据权利要求1所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，所述脂质体上载有脂溶性药物或水溶性药物。
7.根据权利要求6所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，在装载脂溶性药物的脂质体上修饰细胞膜的方法包括：将脂溶性药物和脂质材料一起溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕后形成药-脂干燥薄膜，然后向上述药-脂干燥薄膜中加入含有细胞膜的水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，即得。
8.根据权利要求6所述细胞膜修饰脂质体的方法，其特征在于，在装载水溶性药物的脂质体上修饰细胞膜的方法包括：将脂质材料溶于有机溶剂中，待有机溶剂挥发完毕后形成脂质干燥薄膜，然后向上述脂质干燥薄膜中加入细胞膜和水溶性药物的混合水溶液，在氮气保护的条件下依次经过水合、分散和/或微孔挤压，即得。
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