CN115487167B - 多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及其在阿尔兹海默病治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及其在阿尔兹海默病治疗药物中的应用，利用白细胞膜包被负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体，将白细胞膜对神经毒素的中和解毒作用与药物对脑内先天免疫识别信号通路的抑制作用相结合，得到一类能同时靶向炎性病灶并全面对抗脑内免疫清除的高效纳米神经解毒剂。所制得的仿生纳米神经解毒剂能优先富集到脂多糖诱导的体内外炎性病灶，有效中和脂多糖和淀粉样蛋白为代表的神经毒素，降低神经毒素诱导的小胶质细胞激活和炎症因子表达，改善神经炎症源性的神经元凋亡和突触可塑性受损，全面提高阿尔兹海默病模型动物的学习和记忆功能。且该仿生纳米神经解毒剂生物安全性好，制备过程简单温和，具有广谱性解毒优势。

Description

多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及其在阿尔兹海默病治疗 药物中的应用

技术领域

本发明属于纳米生物药物领域，具体涉及一类多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及其在阿尔兹海默病治疗药物中的应用。

背景技术

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种发病率逐年升高的神经退行性疾病，表现为认知功能衰退以及学习记忆功能下降。AD发病机制非常复杂，其中小胶质细胞对AD脑内过量的神经毒素的免疫识别被认为是慢性神经炎症的起始诱导事件。研究表明，AD患者在临床症状出现很早之前就会在脑内聚集淀粉样蛋白(Amyloid-beta,Aβ)聚集体或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等神经毒素，小胶质细胞会识别这些神经毒素的异常积聚并触发持续的先天免疫反应，导致小胶质细胞过度激活，引发慢性神经炎症。

小胶质细胞对神经毒素的免疫识别依赖于其膜表面的模式识别受体(Patternrecognition receptors,PRRs)，其中Toll样受体4(TLR4)是小胶质细胞膜表面最常见的PRRs组成之一。临床研究表明TLR4在AD患者脑内表达非常高，为小胶质细胞识别神经毒素提供了足够的结合位点。TLR4与神经毒素的结合会激活Myd88/NF-κB促炎信号通路，促进各种炎性细胞因子的转录表达；炎症因子的大量产生又会进一步刺激小胶质细胞膜上的TLR4表达上调，形成炎症级联反应的恶性循环。降低TLR4为代表的PRRs表达有助于削弱小胶质细胞识别功能，从而减轻神经毒素识别诱导的促炎级联反应。

降低神经毒素含量以及抑制小胶质细胞的免疫识别有望减轻神经炎症源性的AD进展，但针对上述两个靶点开发药物实现AD神经炎症的协同治疗少有研究且有一定困难。血脑屏障(Brain Blood Barrier,BBB)阻碍了药物进入中枢神经系统发挥作用，经鼻递送虽然可以绕过BBB，但依然无法实现对神经毒素的特异性靶向，致使药物利用率低，且单一药物无法同时中和神经毒素和降低小胶质细胞TLR4表达，很难高效对抗脑内神经毒素诱导的慢性神经炎症。配体修饰的载药纳米材料在中枢神经系统疾病治疗中已有较多应用，但存在免疫原性高，生物相容性低和制备工艺复杂等缺点。因此，开发一类同时具有靶向神经炎症、中和神经毒素以及降低TLR4表达等抑制小胶质细胞免疫识别和对抗免疫清除的药物是AD等神经退行性疾病药物研发领域的新兴研究方向，至今未见有公开报导。

发明内容

本发明针对现有AD等神经退行性疾病药物存在的神经炎症靶向性差、脑内药物利用率低、制备工艺复杂以及难以同时实现中和解毒及抑制TLR4表达等应用限制问题，开发了一类多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及其在阿尔兹海默病治疗药物中的应用。

利用白细胞膜包被负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体构建一类高效的多功能仿生纳米神经解毒剂，将白细胞膜对神经毒素的中和解毒作用与药物对脑内先天免疫识别信号通路的抑制作用相结合，同时靶向炎性病灶并全面对抗脑内免疫清除。所制得的仿生纳米神经解毒剂能优先富集到脂多糖诱导的体内外炎性病灶，有效中和脂多糖和淀粉样蛋白为代表的神经毒素，降低神经毒素诱导的小胶质细胞激活和炎症因子表达，改善神经炎症源性的神经元凋亡和突触可塑性受损，全面提高阿尔兹海默病模型动物的学习和记忆功能。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一类多功能仿生纳米神经解毒剂，通过白细胞膜包被负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体所制得。

优选地，所述白细胞膜包括提取自经过炎性刺激或未经过炎性刺激的巨噬细胞和中性粒细胞。

优选地，所述炎性刺激包括脂多糖、淀粉样蛋白聚集体、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素1β(IL-1β)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等孵育刺激中的一种或任意组合。

优选地，所述免疫识别抑制药物包括催产素和醋酸催产素的水溶性药物及姜黄素和黄芩素的脂溶性药物中的一种或任意组合。

本发明同时提供一类多功能仿生纳米解毒剂的制备方法，包括：

(1)将脂质成分及脂溶性免疫识别抑制药物溶解于有机溶剂，得到混合溶液，所述有机溶剂体积比为氯仿：甲醇＝3：1；

(2)将混合溶液通过旋转蒸发和常温真空干燥，得到脂质薄膜，所述旋转蒸发条件为40～60℃；

(3)将水溶性免疫识别抑制药物的去离子水溶液加入步骤(2)得到的脂质薄膜中进行水合，超声后经脂质体挤出器得到负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体，所述水合和挤出温度为40～60℃，所述挤出条件为400nm、200nm、100nm各8～10次；

(4)提取白细胞膜并分散于去离子水中，经脂质体挤出器得到白细胞膜囊泡，所述白细胞膜提取方法为细胞裂解破坏和差速离心；

(5)将白细胞膜囊泡与步骤(3)得到的负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体混合超声，经脂质体挤出器挤出后离心，得到多功能仿生纳米神经解毒剂，所述超声条件为频率20kHz，功率650W，占空比20％～30％，所述离心条件为4℃，20000×g，1小时。

优选地，所述脂质成分包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG₂₀₀₀)、蛋黄磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)中的一种或任意组合。

优选地，所述脂质成分与水溶性或脂溶性免疫识别抑制药物的质量比为(6.7～33.4)：1；白细胞膜囊泡与负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体的比例满足(0.5～3)×10⁷个细胞所得白细胞膜囊泡：1mg纳米脂质体。

本发明还提供了一种代表性的多功能仿生纳米神经解毒剂在用于制备对抗神经毒素识别诱导的神经炎症的药物中的应用。

本发明的细胞水平实验结果表明，仿生纳米神经解毒剂可以优先被LPS处理的小胶质细胞摄取，能显著中和LPS，有效缓解神经毒素诱导的小胶质细胞激活及神经炎症的相关标志物；动物水平实验结果表明，仿生纳米神经解毒剂可以优先富集在LPS诱导的炎症脑区，显著缓解AD模型小鼠脑内神经炎症，阻断TLR4介导的促炎通路，改善神经炎症源性的神经元凋亡和突触可塑性受损，全面提高AD模型小鼠的学习和记忆功能。

本发明所涉及的仿生纳米神经解毒剂也可以应用于制备针对神经毒素源性炎症发病机制的其他中枢神经系统退行性疾病的药物中，不仅限于阿尔兹海默病，还包括抑郁症、多发性硬化症、中风、帕金森氏病及亨廷顿氏病；以及制备针对内毒素源性炎症发病机制的外周炎症相关疾病的药物，包括动脉粥样硬化、脓毒症以及肝缺血-再灌注损伤。

本发明还提供了仿生纳米神经解毒剂在缓解神经毒素诱导的小胶质细胞激活及神经炎症的相关标志物中的应用，所述标志物包括神经毒素识别标志物TLR4、小胶质细胞激活标志物Iba-1、炎症因子TNF-α和IL-1β。

本发明还提供了仿生纳米神经解毒剂在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂、细胞凋亡TUNEL表达抑制剂和突触可塑性增强剂中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用白细胞膜包被负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体，得到一类能同时发挥中和神经毒素和抑制小胶质细胞免疫识别，且具有靶向炎性病灶作用的多功能仿生纳米神经解毒剂。首先，该仿生纳米神经解毒剂继承白细胞源性的抗吞噬和炎症靶向功能，可优先富集于脑内含有大量神经毒素的神经炎症病灶；其次，该仿生纳米神经解毒剂表面TLR4等功能蛋白可对LPS和Aβ为代表的神经毒素进行捕获和中和，避免神经毒素对小胶质细胞的持续激活；此外，该仿生纳米神经解毒剂所负载的免疫识别抑制药物被缓慢释放，降低小胶质细胞膜表面神经毒素识别位点TLR4表达并抑制其下游促炎级联通路，进一步提高神经解毒能力。

本发明所述的仿生纳米神经解毒剂，可作为广谱神经解毒剂用于中和脑内神经毒素并抑制神经毒素诱导的神经炎症，脑内神经炎症病灶靶向性好，神经解毒效应强，能降低神经毒素诱导的小胶质细胞激活和炎症因子表达，改善神经炎症源性的神经元凋亡和突触可塑性受损，全面提高阿尔兹海默病动物模型的学习和记忆功能。且该仿生纳米神经解毒剂生物安全性好，制备过程简单温和，具有广谱性解毒优势。

附图说明

图1是所制得的仿生纳米神经解毒剂的最优透射电镜图；

图2是所制得的仿生纳米神经解毒剂的最优粒径表征图；

图3是所制得的仿生纳米神经解毒剂的最优电位表征图；

图4是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对炎性细胞摄取的研究；

图5是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对LPS中和的研究；

图6是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对小胶质细胞激活的研究；

图7是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对炎症源性神经元凋亡的研究；

图8是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对靶向脑内炎症病灶的研究；

图9是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对AD模型小鼠神经元凋亡和Aβ沉积的研究；

图10是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对AD模型小鼠促炎通路的研究；

图11是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对AD模型小鼠突触可塑性的研究；

图12是所制得的仿生纳米神经解毒剂针对AD模型小鼠认知功能行为学的研究。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

下述实施例中涉及的试剂或原料若无特别说明，均可通过市售途径购买得到或根据本领域技术人员公知常识制备得到。

小鼠小胶质细胞株BV-2细胞由天津医科大学总医院赠予或购自于ATCC细胞库，小鼠海马神经元细胞株HT22细胞和小鼠白血病单核-巨噬细胞RAW 264.7细胞购自于上海细胞库ATCC细胞库；ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和APP/PS1转基因小鼠均购自于北京华阜康生物科技股份有限公司。

实施例1

本实施例提供一类多功能仿生纳米神经解毒剂和一种代表性的多功能仿生纳米解毒剂的制备方法。一类多功能仿生纳米神经解毒剂由纳米脂质体和细胞膜两部分组成。其中，纳米脂质体包括负载水溶性免疫识别抑制药物的纳米脂质体和负载脂溶性免疫识别抑制药物的纳米脂质体，白细胞膜包括提取自经过炎性刺激或未经过炎性刺激的巨噬细胞和中性粒细胞。

多功能仿生纳米神经解毒剂的制备及表征：

(1)对于负载水溶性免疫识别抑制药物的纳米脂质体，以催产素为例，制备负载催产素的纳米脂质体：

将DPPC，DSPE-PEG₂₀₀₀，胆固醇以6：3：1的摩尔比溶解在体积比氯仿:甲醇＝3：1的溶剂中，水浴超声得到混合溶液，在60℃下旋转蒸发10分钟形成脂质薄膜，于真空干燥箱中过夜挥发残留的有机溶剂，得到的脂质薄膜。向薄膜中添加催产素溶液，脂质成分与催产素的质量比为(8.4～33.4)：1，具体分别为8.4：1、16.7：1和33.4：1，进一步优选为16.7：1，于50℃下搅拌1小时进行水合，然后水浴超声5分钟后，通过脂质体挤出器的400nm、200nm、100nm聚碳酸酯膜分别挤出8～10次，得到粒径均一的负载催产素的纳米脂质体(OT-Lipo)并进行表征：透射电子显微镜下为较均一的球形颗粒，激光粒度分析结果表明，OT-Lipo的粒径为91nm，电位为-8.26mV。

(2)对于负载脂溶性免疫识别抑制药物的纳米脂质体，以姜黄素为例，制备负载姜黄素的纳米脂质体：

将DPPC，DSPE-PEG₂₀₀₀，胆固醇以6：3：1的摩尔比溶解在体积比氯仿:甲醇＝3：1的溶剂中，加入姜黄素，脂质成分与姜黄素的质量比为(6.7～20)：1，具体分别为6.7：1、10：1和20：1，进一步优选为10：1，然后水浴超声得到脂质和药物的混合溶液，在60℃下旋转蒸发10分钟形成脂质薄膜，于真空干燥箱中过夜挥发残留的有机溶剂，得到的脂质薄膜。向薄膜中添加PBS溶液，于60℃下搅拌1小时进行水合，然后水浴超声5分钟后，通过脂质体挤出器的400nm、200nm、100nm聚碳酸酯膜分别挤出8～10次，得到粒径均一的负载姜黄素的纳米脂质体(Cur-Lipo)并进行表征：透射电子显微镜下为较均一的球形颗粒，激光粒度分析结果表明，Cur-Lipo的粒径为97nm，电位为-15.7mV。

(3)巨噬细胞膜囊泡的制备：

未经炎性刺激的巨噬细胞膜囊泡：收获小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7后，以5×10⁷个/mL的浓度重悬于临用前添加了蛋白酶抑制剂的细胞膜蛋白提取试剂中，冰浴10～20分钟后，用玻璃匀浆器破碎细胞30～50次，然后在4℃，700×g的条件下离心10分钟，抽取上清在4℃，14000×g的条件下离心30分钟，得到细胞膜沉淀并用去离子水重悬，然后经过脂质体挤出器400nm、200nm的聚碳酸酯膜分别挤出15～20次，得到细胞膜囊泡，电位为-17.9mV。

经LPS刺激的巨噬细胞膜囊泡：在收获小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7前，向培养基中添加10μg/mL LPS刺激12小时，构建炎性刺激的巨噬细胞模型。收获细胞后，细胞膜提取和细胞膜囊泡制备方法与未经炎性刺激的巨噬细胞相同，所得细胞膜囊泡电位为-18.6mV。

(4)中性粒细胞膜囊泡的制备：

收集健康ICR小鼠的外周血，在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS中离心纯化得到细胞沉淀。首先加入红细胞裂解液裂解1～2分钟，在4℃，500×g的条件下离心5分钟，弃去红色上清；剩余细胞在三层梯度(78％、69％和52％)的Percoll细胞分离液中离心(21℃，800×g)30分钟，从69％-78％界面和78％层上部收集中性粒细胞，用PBS洗涤纯化。收获细胞后，细胞膜提取和细胞膜囊泡制备方法与巨噬细胞相同，所得细胞膜囊泡的电位为-24.5mV。

(5)一类多功能仿生纳米神经解毒剂的制备：

将实施例1中(1)或(2)制备得到的负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体与实施例1中(3)或(4)制备得到的白细胞膜囊泡混合，探针超声5分钟，所述超声的条件为频率20kHz，功率650W，占空比25％。然后通过400nm、200nm聚碳酸酯膜分别挤出15～20次，经4℃，20000×g离心1小时纯化，得到仿生纳米神经解毒剂。

(6)以负载催产素的纳米脂质体(OT-Lipo)和巨噬细胞膜囊泡为例，制备一种代表性的多功能仿生纳米神经解毒剂。其中用于膜提取的巨噬细胞数量(个)、纳米脂质体质量(mg)以及催产素的质量(mg)三者之间的比例为2.5×10⁷：1：0.2。对其进行表征：

如图1所示：透射电镜结果表明，该仿生纳米神经解毒剂具有经典的“核-壳”仿生纳米结构，外层环形壳为巨噬细胞膜，内层核心为OT-Lipo纳米脂质体。

如图2所示：激光粒度分析结果表明，该仿生纳米神经解毒剂粒径为106nm。

如图3所示：该仿生纳米神经解毒剂OT-Lipo@M的电位为-14.6mV，与OT-Lipo的-8.26mV相比，更接近与细胞膜囊泡的-17.9mV。

以下实施例均以负载催产素的纳米脂质体(OT-Lipo)和巨噬细胞膜囊泡制备所得的多功能仿生纳米神经解毒剂为基础进行试验。

实施例2

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂的体外炎症靶向性。

以小胶质细胞株BV-2细胞作为实验对象，通过LPS刺激构建具有炎症反应的细胞模型，方法如下：将BV-2细胞以每孔3×10⁴个细胞密度接种在24孔板中，在37℃下培养24小时，待细胞增长至80％左右，更换新鲜无血清培养基并加入LPS溶液(终浓度为100μg/mL)，等量PBS溶液作为阴性对照，孵育12小时后，加入DiO荧光标记的OT-Lipo和OT-Lipo@M孵育1小时，在共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。

如图4所示：不论细胞是否经过LPS刺激，OT-Lipo处理的细胞中DiO荧光均较弱；在经LPS刺激的细胞中，OT-Lipo@M处理后的DiO荧光较PBS处理显著增强，即OT-Lipo@M在LPS刺激的炎性BV-2细胞中有更多摄取，表明该仿生纳米神经解毒剂继承了巨噬细胞源性的炎症靶向功能。

实施例3

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂的LPS中和性能。

实验分为四组：对照组、LPS组、LPS+OT-Lipo组和LPS+OT-Lipo@M组，方法如下：分别将等体积的去离子水、OT-Lipo、OT-Lipo@M与LPS溶液在37℃共同孵育2小时，离心去除溶液中的纳米颗粒，收获上清，并采用ELISA试剂盒对上清中游离的LPS进行定量检测，PBS溶液作为阴性对照。

如图5所示：LPS+OT-Lipo组游离LPS浓度与LPS组的较高水平相差不大，而LPS+OT-Lipo@M组游离LPS浓度较LPS组显著下降，表明OT-Lipo@M可有效中和LPS，展示出仿生纳米神经解毒剂对LPS为代表的神经毒素的优异中和能力。

实施例4

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对LPS诱导的小胶质细胞激活的抑制作用。

将BV-2细胞以每孔3×10⁴个细胞密度接种在24孔板中，在37℃下培养24小时，待细胞增长至80％左右，更换新鲜无血清培养基并加入LPS溶液(终浓度为100μg/mL)，持续孵育24小时，然后加入仿生纳米神经解毒剂孵育24小时。以不做任何处理的细胞作为对照组。

通过细胞免疫荧光检测小胶质细胞激活程度，方法如下：将上述处理后的细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，用5％BSA阻断45分钟，然后用抗Iba-1一抗(稀释度1：300)在4℃下孵育过夜。随后，用PBS清洗细胞，再用含红色荧光标签的二抗孵育1小时。最后，用DAPI孵育1分钟，用PBS清洗细胞，使用倒置荧光显微镜观察并拍摄荧光图像，使用ImageJ软件对图像平均荧光强度进行定量分析，研究仿生纳米神经解毒剂对小胶质细胞激活的抑制作用。

如图6所示：与对照组相比，LPS组细胞中Iba-1的平均荧光强度显著增强，LPS+OT-Lipo组细胞中Iba-1平均荧光强度有轻微下降，而LPS刺激经OT-Lipo@M处理后，细胞的Iba-1荧光强度显著下降，表明该仿生纳米神经解毒剂能够显著抑制LPS诱导的小胶质细胞激活。

实施例5

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对神经炎症诱导的神经元凋亡的保护作用。

通过AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒检测HT22细胞凋亡情况，方法如下：将BV-2细胞以每孔3×10⁴个细胞密度接种在24孔板中，在37℃下培养24小时，待细胞增长至80％左右，更换新鲜无血清培养基并加入LPS溶液(终浓度为100μg/mL)，持续孵育24小时，然后加入仿生纳米神经解毒剂孵育24小时，收获培养基上清。以不做任何处理的细胞作为对照组。将HT22细胞以每孔3×10⁴个细胞密度接种在24孔板中，在37℃下培养24小时，将培养基换成上述BV-2的培养基上清，继续培养24小时，收获HT22细胞，按照凋亡试剂盒说明书处理细胞，采用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行分析。

如图7所示：LPS刺激的BV-2上清引起的HT22细胞的凋亡率为49.5％，而LPS+OT-Lipo及LPS+OT-Lipo@M处理后的BV-2上清引起的HT22细胞的凋亡率分别降低至16.48％和8.0％，表明该仿生纳米神经解毒剂对炎症源性神经元凋亡的显著抑制作用。

实施例6

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对海马局部炎症病灶的靶向性。

将4μL(25μg/μL)LPS溶液立体定位注射至C57BL/6J小鼠右侧海马区，用来构建海马局部炎症病灶模型，以注射PBS作为假手术对照组。手术4天后，将红色荧光染料DiL标记的OT-Lipo和OT-Lipo@M滴鼻至上述小鼠中，24小时后处死小鼠，收获小鼠脑组织，制成冰冻脑切片。切片与Iba-1(稀释度1：300)一抗在4℃孵育过夜，用PBS清洗3次后，在室温下与FITC偶联二抗(稀释度1：200)孵育1小时，PBS洗3次后，用DAPI对细胞核进行染色，再次清洗后使用抗猝灭剂进行封片。使用共聚焦显微镜观察脑切片中DiL与Iba-1的表达及共定位情况，使用ImageJ软件分析DiL与Iba-1的Manders共定位系数。

如图8所示：在LPS注射诱导的炎症脑模型中，纳米颗粒定位的DiL荧光与小胶质细胞激活标记的Iba-1荧光，两者的Manders共定位系数越大，表明纳米颗粒的炎症靶向性越强。与OT-Lipo组相比，OT-Lipo@M组在海马和皮层中的共定位系数均显著增大，表明该仿生纳米神经解毒剂成功继承了巨噬细胞源性的炎症靶向性，可在脑内炎症区域高效富集。

实施例7

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对AD模型小鼠神经元凋亡和Aβ沉积的抑制作用。

以24周龄(雌性)APP/PS1转基因小鼠作为阿尔兹海默病动物模型，以相同周龄、雌性C57BL/6J小鼠为对照，分组如下：(1)野生型组：C57BL/6J小鼠鼻内给予30μL生理盐水；(2)阿尔兹海默病组：APP/PS1小鼠鼻内给予30μL生理盐水；(3)OT-Lipo治疗组：APP/PS1小鼠鼻内给予30μLOT-Lipo(2.7mg/kg OT)；(4)OT-Lipo@M治疗组：APP/PS1小鼠鼻内给予30μLOT-Lipo@M(2.7mg/kg OT)；上述每组15只，隔天给药一次，共给药12次。以下实施例均在该治疗方案的基础上进行试验。

在上述分组治疗处理后，小鼠分别被执行安乐死并获取各组小鼠全脑组织，通过多聚甲醛固定，制成全脑石蜡切片，分别通过TUNEL染色和Aβ免疫荧光染色检测神经元凋亡水平和脑内Aβ沉积情况。

如图9所示：阿尔兹海默病组小鼠海马区TUNEL绿色荧光和Aβ红色荧光均明显高于野生型组，两者荧光在OT-Lipo治疗组中轻微降低，而在OT-Lipo@M治疗组中显著降低，表明该仿生纳米神经解毒剂能显著抑制AD模型小鼠海马中的神经元凋亡和Aβ沉积，起到神经保护作用。

实施例8

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对AD模型小鼠促炎通路的调控作用。

在上述分组治疗处理后，小鼠分别被执行安乐死并获取各组小鼠海马组织，提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测相关病理特征标志物的表达水平，包括：TLR4、Myd88、NF-κB、TNF-α及IL-1β。

如图10所示：阿尔兹海默病组中TLR4、Myd88、NF-κB、TNF-α及IL-1β的水平显著高于野生型组，OT-Lipo治疗后上述标志物的表达水平较阿尔兹海默病轻微降低，而OT-Lipo@M治疗后上述标志物的表达水平较阿尔兹海默病组显著降低，表明该仿生纳米神经解毒剂可有效下调AD模型小鼠海马中TLR4/Myd88/NF-κB通路来抑制神经炎症。

实施例9

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对AD模型小鼠突触可塑性的作用。

在上述分组治疗处理后，制备新鲜海马切片并记录CA3-CA1投射通路的兴奋性突触后电位(fEPSP)，进行长时程增强(LTP)电生理分析，具体方法如下：将小鼠断头并迅速取出脑组织，将其放入0℃且含氧的人工脑脊液中，随后使用振动组织切片机将脑组织切为400μm厚的脑片，然后将海马脑片放入33℃含氧的人工脑脊液中，孵育至少60分钟后，将海马脑片转移到MEA灌流室中，将自制尼龙网放于脑片上方以确保脑片与电极阵列之间紧密贴合。MEA由60个胞外电极组成，电极间距为200μm。每个电极既可以作为刺激电极，又可以作为记录电极。记录20分钟基线后，使用外部刺激器对海马Schaffer Collateral所在的那个电极点施加高频刺激(HFS)以诱导LTP，随后用LTP-Director1.3.2和LTP-Analyzer1.3.2记录海马CA1区兴奋性突触后电位100分钟。

如图11所示：阿尔兹海默病组小鼠的fEPSP斜率水平较野生型组大幅下降，OT-Lipo治疗组小鼠的fEPSP斜率水平较阿尔兹海默病组有所增加，OT-Lipo@M治疗组小鼠的fEPSP斜率水平可明显提升至接近野生型小鼠水平，表明该仿生纳米神经解毒剂能有效改善AD模型小鼠的突触可塑性受损。

实施例10

本实施例评价实施例1(6)得到的仿生纳米神经解毒剂对AD模型小鼠认知功能的改善作用。

在上述分组治疗处理后，可通过旷场试验、Y迷宫试验、新物体识别及两天水迷宫试验等认知行为学方法评估小鼠的学习和记忆功能，具体方法如下：

旷场试验：观测小鼠的自主行为、探究行为与紧张度。保持实验在安静的环境下进行。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时，观察小鼠在5分钟内的运动情况，记录每只小鼠的运动距离、运动轨迹及运动速度。

Y迷宫试验：采用新奇臂识别测试评估空间参考记忆。简单地说，三个手臂被指定为开始臂、其他臂和新奇臂，试验包括训练阶段和测试阶段。在训练试验中，关闭新奇臂，将小鼠放置在开始臂上，让其探索开始臂和其他臂15分钟。间隔1小时后，打开新奇臂进行测试，将小鼠重新放置在开始臂上，自由探索三臂5分钟，使用Smart v3.0视频跟踪软件分析每只臂与所有臂的距离、时间和进入次数的百分比。

新物体识别试验：测试小鼠先天对新物体有探索倾向的学习记忆能力。该试验包括训练及测试试验。在训练实验中，将A、B两个物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度一致。小鼠放入10分钟，并观察记录小鼠与这两物体接触的情况，包括鼻子、嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3厘米范围内探究的时间。待小鼠休息1小时后开始测试试验，将场地内的B物体换作C物体，仍将小鼠背向两物体，鼻尖距两物体距离相同，观察2-5分钟，观察指标同前所述。

两天水迷宫试验：两天水迷宫测试检测小鼠空间学习和记忆功能，包括第一天平台可见期和第二天平台隐藏期。在西北象限中心放置一个直径为8cm的平台，第1天将平台置于水面以上1cm处，从距离平台最远的池正东和正南方向交替将小鼠面向墙壁置于池中探索180秒，共4次训练，每次间隔1小时。第2天，将平台放置在水位以下1厘米处，按照上述方法将小鼠置于泳池中探索180秒，共3次试验，每次试验间隔1小时。采用Smartv3.0视频跟踪软件记录小鼠的游泳轨迹，测量小鼠的逃逸潜伏期。

Y迷宫新奇识别试验结果如图12所示：在测试阶段，阿尔兹海默病组小鼠对三个臂的探索行为相当，并没有表现出对新奇臂的偏好性；而OT-Lipo@M治疗组小鼠在新奇臂的轨迹线接近野生型水平，提示其对新奇臂的探索具有偏好性，表明该仿生纳米神经解毒剂可改善AD模型小鼠的空间参考记忆。

水迷宫试验结果如图12所示：野生组小鼠找到平台的游泳路径较短，而阿尔兹海默病组小鼠的游泳轨迹较长，具有绕圈现象，表明阿尔兹海默病组小鼠记忆缺陷；而经OT-Lipo@M治疗的阿尔兹海默病小鼠找到平台所用路径明显缩短至接近野生型水平，表明该仿生纳米神经解毒剂能够提高AD模型小鼠的空间学习和记忆功能。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一类多功能仿生纳米神经解毒剂，其特征在于，所述解毒剂通过白细胞膜包被负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体所制得，所述白细胞膜为未经过炎性刺激的巨噬细胞；所述免疫识别抑制药物包括催产素和醋酸催产素的水溶性药物中的一种或任意组合；其中脂质成分与水溶性免疫识别抑制药物的质量比为（6.7~33.4）：1；白细胞膜囊泡与负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体的比例满足（0.5~3）×10⁷个细胞所得白细胞膜囊泡：1 mg纳米脂质体。

2.权利要求1所述的多功能仿生纳米神经解毒剂的制备方法，其特征在于，包括：

(1)将脂质成分溶解于有机溶剂，得到混合溶液，所述有机溶剂体积比为氯仿：甲醇=3：1；

(2)将混合溶液通过旋转蒸发和常温真空干燥，得到脂质薄膜，所述旋转蒸发条件为40~60℃；

(3)将水溶性免疫识别抑制药物的去离子水溶液加入步骤(2)得到的脂质薄膜中进行水合，超声后经脂质体挤出器得到负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体，所述水合和挤出温度为40~60℃，所述挤出条件为400 nm、200 nm、100 nm各8~10次；

(4)提取白细胞膜并分散于去离子水中，经脂质体挤出器得到白细胞膜囊泡，所述白细胞膜提取方法为细胞裂解破坏和差速离心；

(5)将白细胞膜囊泡与步骤(3)得到的负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体混合超声，经脂质体挤出器挤出后离心，得到多功能仿生纳米神经解毒剂，所述超声条件为频率20kHz，功率650 W，占空比20%~30%，所述离心条件为4℃，20000×g，1小时。

3.根据权利要求2所述的多功能仿生纳米神经解毒剂的制备方法，其特征在于，所述脂质成分包括1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG₂₀₀₀）、蛋黄磷脂酰胆碱（EPC）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）中的一种或任意组合。

4.根据权利要求2所述的多功能仿生纳米神经解毒剂的制备方法，其特征在于，脂质成分与水溶性免疫识别抑制药物的质量比为（6.7~33.4）：1；白细胞膜囊泡与负载免疫识别抑制药物的纳米脂质体的比例满足（0.5~3）×10⁷个细胞所得白细胞膜囊泡：1 mg纳米脂质体。

5.权利要求1所述的多功能仿生纳米神经解毒剂在制备针对神经毒素源性炎症发病机制的中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述中枢神经系统退行性疾病为阿尔兹海默病。

7.权利要求1所述的多功能仿生纳米神经解毒剂在制备缓解神经毒素诱导的小胶质细胞激活及神经炎症的相关标志物药物中的应用，所述标志物包括神经毒素识别标志物TLR4、小胶质细胞激活标志物Iba-1、炎症因子TNF-α和IL-1β。

8.权利要求1所述的多功能仿生纳米神经解毒剂在制备淀粉样蛋白Aβ抑制剂、细胞凋亡TUNEL表达抑制剂和突触可塑性增强剂中的应用。