CN109468280B - 过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体，通过以下方法制备得到：使用无血清培养基培养原代神经干细胞至2代或以后，采用过表达pEGFP‑N1质粒转染使原代神经干细胞过表达circScmh1，然后收集细胞上清，依次离心去除漂浮细胞、死细胞、细胞碎片，再次离心收集沉淀，重悬，离心重悬液，收集沉淀得到过表达circschm1的神经干细胞外泌体。本发明提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体能够高效靶向脑卒中梗死侧皮层部位，显著减少脑缺血诱发的脑梗死范围，提高神经功能学评分，有望开发为治疗缺血性脑卒中疾病的潜在药物。

Description

过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于医药技术，具体涉及一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方法与应用。
背景技术
脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是目前全球第二大致死性疾病，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点，其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症状和体征。脑卒中主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率约占脑卒中病人总数的60％～70％，控制脑卒中病死率并提高生存质量是当前医学研究函待解决的难题。
目前临床常用治疗策略首选以溶栓为主，迅速复流再通是缺血性脑卒中急性期治疗成功的前提，但是在临床应用中存在着诱发脑出血等并发症以及溶栓治疗的时间窗的限制。实验动物研究发现，由缺血缺氧诱导的一系列瀑布样延迟性生化级联反应是导致脑卒中组织损伤及长期行为学障碍的关键原因。缺血性脑损伤涉及非常复杂的病理生理过程，目前研究揭示的影响脑卒中发生、发展的主要病理机制包括兴奋性毒性损伤、能量代谢障碍、离子稳态失衡、神经元过度去极化、氧化应激、炎症反应、血脑屏障破坏、凋亡和再生障碍等。基于该疾病的病理特点，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，寻找具有神经保护作用的药物具有非常重要的意义。
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，以非经典剪接方式进行反向剪接而形成，是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴并以共价键形成环形结构的RNA分子。在对circRNA结构和功能的研究基础上，已知circRNA参与调节多种生理和病理过程，在疾病的发生发展中起着重要的作用，如神经紊乱、阿尔兹海默症、动脉粥样硬化。
前期通过大数据筛选得到circScmh1，研究表明脑卒中患者血浆circScmh1水平明显下调，上调脑内circScmh1水平可能具有具有减少脑卒中梗死面积，提高神经评分的作用。但目前仍缺少合适的载体可以高效的将circ schm1载入脑缺血梗死部位。
发明内容
发明目的：针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及其制备方式，还提供了其具体应用。
技术方案：本发明所述的一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体，其通过以下方法制备得到：使用无血清培养基培养原代神经干细胞至2代或以后，采用过表达pEGFP-N1质粒转染使原代神经干细胞过表达circScmh1，然后收集细胞上清，依次离心去除漂浮细胞、死细胞、细胞碎片，再次离心收集沉淀，重悬，离心重悬液，收集沉淀得到过表达circ schm1的神经干细胞外泌体。
其中，所述无血清培养基为DMEM/F-12(GIBCO,11330032)和B27minus vitamin A(GIBCO,12587010)。
所述pEGFP-N1质粒转染浓度为每1*10^5-1*10^6个神经干细胞，加入1-10ugpEGFP-N1质粒转染，转染12-72小时。
所述重悬采用PBS溶液。
本发明制备所得过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体为粒径40-100nm的盘状囊泡状结构，circScmh1较对照外泌体过表达8-10倍。
本发明所述过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用也在本发明的保护范围内。
有益效果：本发明制备得到了一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体，其能够高效靶向脑卒中梗死侧皮层部位，显著减少脑缺血诱发的脑梗死范围，提高神经功能学评分，有望开发为治疗缺血性脑卒中疾病的潜在药物。
附图说明
图1为本发明实施例2对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的电镜鉴定结果图(50000倍)；
图2为本发明实施例3对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的表面标记蛋白鉴定结果图；
图3为本发明实施例4对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的粒径鉴定结果图；
图4为本发明实施例5对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的定量PCR检测结果；
图5为本发明实施例6对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体体内分布近红外结果图；
图6为本发明实施例6对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体高效靶向脑卒中梗死区皮层部位的荧光照片(XX倍)；
图7为本发明实施例7对提供的过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体对缺血小鼠脑梗死的保护作用以及神经功能的影响结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
原代小鼠神经干细胞，从胎鼠中获得。
pEGFP-N1质粒来源于加拿大多伦多大学健康医学中心。
无血清培养基为DMEM/F-12(GIBCO,11330032)和B27minus vitamin A(GIBCO,12587010)。
实施例1过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的制备
一种过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用无血清培养基DMEM/F-12和B27minus vitamin A原代培养小鼠神经干细胞至2代或以后；
(2)调整步骤(1)得到的小鼠神经干细胞数量为1*10^5个，加入1ugpEGFP-N1质粒转染，转染48小时后收集细胞上清；
(3)采用300g转速离心步骤(2)的细胞上清5分钟，去除漂浮细胞，收集上清；
(4)采用3000g转速离心步骤(3)中获得上清液30分钟，去除死细胞，收集上清；
(5)采用10000g转速离心步骤(4)中获得上清液60分钟，去除细胞碎片，收集上清；
(6)采用200000g转速离心步骤(5)中获得上清液120分钟，收集外泌体及蛋白沉淀；
(7)采用PBS溶液重悬步骤(6)中外泌体及蛋白沉淀；
(8)采用200000g转速离心步骤(7)中获得悬液体120分钟，收集外泌体沉淀；得到过表达circschm1的神经干细胞外泌体。
将上述制备所得过表达circschm1的神经干细胞外泌体应用于实施例2-7中的检测和分析试验。
实施例2过表circScmh1基因的神经干细胞外泌体的电镜鉴定方法
取过表达circschm1基因的神经干细胞外泌体及对照空载外泌体(以下用对照外泌体表示)各20ul，充分混匀后滴加与直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸取铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于投射电镜下观察并拍照，过表达circschm1基因的神经干细胞外泌体的分离鉴定结果如图1所示，其中circschm1基因的神经干细胞外泌体为直径约为100nm的囊泡状结构。
实施例3过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的表面标记蛋白鉴定方法
配制15％SDS-PAGE电泳胶，将过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体及对照外泌体充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与CD81/CD9/CD63/TSG101/AGO2/GM130/CYC1HSP90抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，与HRP标记的二抗37℃温育1h)，TBS/0.5％Tween20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测。图2为Westernblot检测结果，过表达circ SCHM1基因的神经干细胞外泌体中CD81/CD9/CD63/TSG101/AGO2/GM130/CYC1/HSP90的表达结果如图2所示，CD81/CD9/CD63/TSG101呈阳性表达，AGO2/GM130/CYC1/HSP90呈阴性表达。
实施例4过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的粒径分析
纳米颗粒跟踪分析(NTA)是将一束能量集中的激光穿过玻璃棱镜对样品(悬浮外泌体的溶液)进行照射，通过装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉颗粒布朗运动的视频文件，并对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，快速准确的计算出样本中哪里颗粒的流体力学半径和浓度。设置NTA仪器参数，测量时间为60s。取外泌体，用水按照1:2500比例稀释成1ml，通过NTA进行测量分析，计算出外泌体的粒径和浓度。结果如图3所述，circschm1基因的神经干细胞外泌体粒径约为91nm。
实施例5过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体的定量PCR检测方法
定量PCR检测过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体中circScmh1的增高倍数，定量PCR检测结果如图4所示：过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体circScmh1的表达量呈显著性的增高。定量检测circScmh1的引物序列如下所示：
基因名称 引物方向 序列(5’-3’)
circScmh1 Forwand CTACTGGTGCCGCTTTGACT
Reverse GGCACCTGTCAATCCAACGA
实施例6过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体体内近红外分布
使用Dil(细胞膜红色荧光探针)标记过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体。制作小鼠脑缺血/再灌模型并尾静脉注射Dil标记的神经干细胞外泌体，于1小时，6小时和24小时监测外泌体的体内和脑内分布。结果如图5所述，过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌能够进入脑缺血/再灌模型小鼠的脑部，0-6小时间，进入脑部的外泌体量随时间增长呈上升趋势，6小时后进入脑部的外泌体量随时间增长呈下降趋势。切片结果如图6所示，过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体高效靶向脑卒中梗死区皮层部位。
实施例7过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体对缺血小鼠脑梗死的保护作用以及神经功能的检测
1.实验动物
8周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重22～25g，购自南京大学模式动物中心。动物生产许可证：SCXK(苏)2015-0001。SPF级环境饲养，光照为12小时/12小时明暗交替，自由饮食。实验前，将动物置于实验环境适应7天。
2.实验分组
实验共设3个分组：模型组(进行缺血手术)、模型+对照外泌体组和模型+过表达circScmh1外泌体组。
3.大脑中动脉短暂阻塞(tMCAO)
根据Longa等人的方法进行(Longa等，1989)制备大脑中动脉短暂阻塞模型。简单介绍如下，使用3％异氟醚与30％氧气和70％一氧化二氮混合气体诱导麻醉，并保持1.5％异氟烷持续麻醉。通过股动脉插管监测平均动脉、血压和动脉血气。手术中直肠温度保持在37.0±0.5℃，使用加热垫保持小鼠体温。在小鼠颈部中间切开1cm左右的切口，在解剖显微镜下分离右颈总动脉(CCA)，并用4-0丝线缝合。分离并暴露右侧颈动脉(ECA)。用6-0丝线在ECA与其原点远端约3毫米处缝合，然后切开。将硅橡胶涂层的6-0尼龙细丝(602356PK5Re，DOCCOL Co，Sharon，MA，USA)插入ECA中，并沿着颈内动脉(ICA)向颈动脉分叉延伸9-10mm。随后缝合颈部切口，将小鼠放置在35℃的护理箱中静待苏醒。手术1小时后，除去细丝以恢复MCA区域的血流。
4.神经行为评分及脑缺血面积测定：术后24小时进行神经行为评分。改良神经功能评分(mNSS)包括一系列的神经功能障碍测试，具体的评分标准如下：1)运动功能测试
A.提尾测试：提尾后通过比较对侧肢体瘫痪程度评价：前肢不能伸展1分；后肢不能伸展1分；30秒内头部侧弯与垂直轴角度超过10°1分。
B.动物置于地上，不能直线行走1分；朝对侧旋转运动2分；对侧偏瘫3分。
2)平衡木评分测试：
抓住平衡木的边1分；单肢脱离抱住平衡木2分；两肢脱离抱住平衡木或在平衡木上旋转(﹥30秒)3分；试图保持平衡但仍滑落(﹥20秒)4分；试图保持平衡，但滑落(＞10秒)5分；10秒内从平衡木上滑落，没有试图保持平衡或抓握平衡木6分。
3)反射和异常运动测试：
耳廓反射障碍1分；角膜反射障碍1分。
上述的评价指标综合反映了运动、感觉、平衡以及反射功能，分数范围为1～14，分数越大表明神经行为损伤越明显。
神经行为评分结束后，将小鼠麻醉，0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)灌流5分钟，断头取脑，去掉嗅球、小脑、脑干和低位脑干，然后冠状切5片。脑片组织用1％TTC染色，正常组织为红色，梗死部位为白色，染色完置于4％多聚甲醛固定，24小时后用黑色背景拍照。
结果如图7所示，给脑缺血小鼠尾静脉注射15ug过表达circScmh1基因的神经干细胞外泌体可以明显减少小鼠脑梗死体积，显著改善小鼠神经功能评分。

Claims (8)

1.一种过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，通过以下方法制备得到：使用无血清培养基培养原代神经干细胞至2代或以后，采用过表达pEGFP-N1质粒转染使原代神经干细胞过表达作为circRNA的Scmh1基因，然后收集细胞上清，依次离心去除漂浮细胞、死细胞、细胞碎片，再次离心收集沉淀，重悬，离心重悬液，收集沉淀得到过表达作为circRNA的schm1基因的神经干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，所述无血清培养基为DMEM/F-12和B27 minus vitamin A。
3.根据权利要求1所述的过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，所述pEGFP-N1质粒转染浓度为每1*10^5-1*10^6个神经干细胞，加入1-10ugpEGFP-N1质粒转染，转染12-72小时。
4.根据权利要求1所述的过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，转染后收集细胞上清，依次采用300g转速离心5分钟，去除漂浮细胞；收集上清，采用3000g转速离心30分钟，去除死细胞；收集上清，采用10000g转速离心60分钟，去除细胞碎片。
5.根据权利要求1所述的过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，离心重悬液是指采用200000g转速离心120分钟。
6.根据权利要求1所述的过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，所述重悬采用PBS溶液。
7.权利要求1-6中任一所述过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体，其特征在于，为粒径40-100的盘状囊泡状结构，作为circRNA的Scmh1基因较对照外泌体过表达8-10倍。
8.权利要求1-6中任一所述过表达作为circRNA的Scmh1基因的神经干细胞外泌体在制备预防或治疗脑卒中药物中的应用。
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Extracellular Vesicle-Mediated Delivery of CircSCMH1 Promotes Functional Recovery in Rodent and Nonhuman Primate Ischemic Stroke Models;姚红红等;《circulation》;20200522;第142卷(第6期);第556-574页 *

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