CN114292807A - 一种外泌体的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种外泌体的提取方法及其应用，通过将人多能干细胞诱导得到神经干细胞的方法，得到的神经干细胞不受其它细胞影响，减少异源因素的干扰，具有更安全的应用价值，通过优化方法步骤以及培养条件，从人多能干细胞诱导出高纯度的可增殖和自我更新的神经干细胞，膜电位约为‑38mV，并且均表达外泌体标志蛋白，从诱导得到的神经干细胞分离出的外泌体粒径在30‑150nm，1488个蛋白和175个差异蛋白，神经干细胞外泌体中的标志物蛋白明显高于细胞，并且富含参与炎症调节、血管生成和神经生成相关的蛋白神经干细胞外泌体应用于皮肤修复组合物的制备中，能赋予皮肤修复组合物显著的修复效果。

Description

一种外泌体的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种外泌体的提取方法及其应用。

背景技术

目前，针对皮肤创伤的治疗手段主要有皮肤移植、生长因子治疗、神经植入、干细胞治疗、基因治疗、机械刺激疗法等。其中，皮肤移植和生长因子是目前临床上治疗皮肤创伤的主要方法。皮肤移植主要包括活体皮肤移植和皮肤替代物移植。活体皮肤移植分为中厚皮肤移植和全层皮肤移植，主要来源分为同种自体、同种异体以及异种来源的移植，这种移植没有免疫排斥，但是存在挛缩和移植范围受限的问题。由于活体皮肤移植的应用局限性，人工皮肤替代物成为有前景的发展方向，在体外通过生物工程制备的皮肤替代物有充足的细胞来源，但是存在耗时和免疫排斥的问题，这仍需要较长时间去解决。在生长因子疗法中，目前只有血小板衍化生长因子PDGF-BB被美国FDA批准用于慢性创伤的临床治疗。临床发现becaplermin能有效治疗糖尿病足部溃疡[，但由于使用剂量大，可能有潜在的副作用与安全风险，如何在不提高剂量的情况下提高递送效率是目前面临的问题^[。另外成纤维细胞生长因子FGF-2前几年在中国和日本被批准可以局部使用，但生长因子用于皮肤损伤的修复普遍存在易被降解和快速清除的问题。目前针对多能干细胞诱导制备神经干细胞，也存在细胞分化不同步，导致提取的外泌体的纯度以及作用效果不理想的问题，因此，针对皮肤创伤，仍然需要做进一步研究开发出有效作用的产品。

综上，在生物医药技术领域，仍然存在亟待解决的上述问题。

发明内容

基于此，为了解决现有技术中外泌体的纯度以及作用效果不理想的问题，本发明提供了一种外泌体的提取方法，具体技术方案如下：

一种外泌体的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

将人多能干细胞放置第一培养基进行人多能干细胞传代培养，待人多能干细胞生长至20％-25％的密度，转移至第一诱导培养基进行第一诱导培养，所述第一诱导培养2d-3d后转移至第二诱导培养基进行第二诱导培养，所述第二诱导培养至5d后，用Accutase酶消化细胞，用神经维持培养基将其放置提前铺胶处理的六孔板中，并添加小分子抑制剂，记为第一代神经干细胞的第一代；

继续传代培养至第14代后，往所述神经维持培养基中添加牛血清蛋白，得到神经干细胞；

将所述神经干细胞进行第一离心处理、第二离心处理、第三离心处理以及第四离心处理后，添加PBS重悬外泌体沉淀，经过第五离心处理，得到神经干细胞外泌体；

其中，所述外泌体粒径为30nm-150nm，具有1488个蛋白和175个差异蛋白；所述外泌体能应用于皮肤修复组合物的制备中。

进一步地，所述第一培养基为DMEM/F12培养基。

进一步地，所述人多能干细胞传代培养为：将基质胶溶解后与所述DMEM/F12培养基混合，加入六孔板中，然后放置细胞培养箱中于37℃的条件孵育处理1h，去除所述基质胶，再铺入多能干细胞，且每日更换新鲜的DMEM/F12培养基。

进一步地，所述第一诱导培养基中含有复合维生素E以及吗啡肽。

进一步地，所述第二诱导培养基中含有复合维生素E。

进一步地，所述第一诱导培养以及所述第二诱导培养的条件均为：温度为36℃-38℃，6％二氧化碳。

进一步地，所述第一离心处理为：将神经干细胞于500×g、4℃的条件下离心处理10min。

进一步地，所述第二离心处理为：取第一离心处理后的上清液于2000×g、4℃的条件下离心处理20min-25min。

进一步地，所述第三离心处理为：取第二离心处理后的上清液于10000×g、4℃的条件下离心处理35min-45min，然后过0.22μm过滤器。

进一步地，所述第四离心处理为：取第三离心处理后的上清液于100000×g、4℃的条件下离心处理1h。

上述方案中通过将人多能干细胞诱导得到神经干细胞的方法，通过添加小分子抑制剂，得到的神经干细胞不受其它细胞影响，减少异源因素的干扰，具有更安全的应用价值，通过优化方法步骤以及培养条件，从人多能干细胞诱导出高纯度的可增殖和自我更新的神经干细胞，膜电位约为-38mV，并且均表达外泌体标志蛋白，从诱导得到的神经干细胞分离出的外泌体粒径在30-150nm，1488个蛋白和175个差异蛋白，对差异蛋白及外泌体中的定量蛋白进行生物信息学分析，结果显示神经干细胞外泌体中的标志物蛋白明显高于细胞，并且富含参与炎症调节、血管生成和神经生成相关的蛋白，为其修复机制提供依据。另外，将神经干细外泌体应用于皮肤修复组合物的制备中，能赋予皮肤修复组合物显著的修复效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中诱导得到神经干细胞的相关表征示意图，图1中的图A为人多能干细胞诱导得到神经干细胞的分化流程示意图，图1中的B为明场下的诱导多能干细胞(左)、贴壁形态的神经干细胞(中)以及神经干细胞球(右)的显微示意图，图1中的C为神经干细胞标记蛋白Nestin、Pax6和Sox2的免疫荧光共聚焦显微镜图像，图1中的图D为神经干细胞标记物Nestin、Pax6和Sox2在未分化人多能干细胞和获得的NSCs中的mRNA表达水平示意图；

图2为本发明实施例2中得到神经干细胞外泌体的相关表征示意图，图2中的图A为人多能干细胞以及神经细胞的外泌体的透射电镜示意图，图2中的B为人多能干细胞以及神经细胞外泌体的蛋白质产量示意图，图2中的图C为人多能干细胞数目以及神经细胞数目与外泌体总蛋白线性示意图，图2中的图D为人多能干细胞以及神经细胞的外泌体粒径范围示意图，图2中的图E为人多能干细胞以及神经细胞的外泌体Zeta电位示意图，图2中的图F为人多能干细胞以及神经细胞及其外泌体Western检测ALIX、CD63、TSG101和GAPDH的蛋白质表达水平示意图；

图3中的图A为NSCs和外泌体中鉴定的独特蛋白质的数量示意图，图3中的B为神经干细胞外泌体中已鉴定蛋白质(1类)、定量蛋白质(2类)和与细胞相比的差异蛋白质(3类)的数量示意图，图3中的C为神经干细胞与外泌体中蛋白质的可视化热图，图3中的图D为外泌体中175种蛋白分类示意图；

图4为神经干细胞和神经干细胞外泌体的差异蛋白表达分析示意图；

图5中的图A为各处理组细胞迁移示意图，图5中的图B为各处理组在12h、24h的细胞迁移率示意图；

图6中的图A为各处理组6H后拍照观察血管生成情况示意图，图6中的图B为各处理组HUVEC细胞进行血管形成的计算示意图；

图7中的图A为皮肤修复组合物在不同时间点释放液加入到HDF细胞中共培养后，HDF的摄取情况示意图，图7中的图B为HDF细胞摄取神经干细胞外泌体的定量分析；

图8中的图A为各组促进小鼠皮肤创伤愈合示意图，图8中的图B为各组小鼠伤口面积的量化示意图；

图9为小鼠皮肤伤口切片的HE染色、Masson染色以及SMA、CD31的免疫组示意图；

图10中的图A为使用ImageJ软件分析各组切片的表皮厚度，图10中的图B、图C以及图D为使用IHC Toolbox工具对Masson三色染色中的蓝色胶原以及免疫组化中的SMA、CD31进行半定量的示意图；

图11为各组对皮肤中神经再生标记物Gap43和Tuj1的免疫荧光染色结果示意图。

具体实施方式

为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合其实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例中的一种外泌体的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

将人多能干细胞放置第一培养基进行人多能干细胞传代培养，待人多能干细胞生长至20％-25％的密度，转移至第一诱导培养基进行第一诱导培养，所述第一诱导培养2d-3d后转移至第二诱导培养基进行第二诱导培养，所述第二诱导培养至5d后，用Accutase酶消化细胞，用神经维持培养基将其放置提前铺胶处理的六孔板中，并添加小分子抑制剂，记为第一代神经干细胞的第一代；

继续传代培养至第14代后，往所述神经维持培养基中添加牛血清蛋白，得到神经干细胞；

将所述神经干细胞进行第一离心处理、第二离心处理、第三离心处理以及第四离心处理后，添加PBS重悬外泌体沉淀，经过第五离心处理，得到神经干细胞外泌体；

其中，所述外泌体粒径为30nm-150nm，具有1488个蛋白和175个差异蛋白；所述外泌体能应用于皮肤修复组合物的制备中。

在其中一个实施例中，所述第一培养基为DMEM/F12培养基。

在其中一个实施例中，所述人多能干细胞传代培养为：将基质胶溶解后与所述DMEM/F12培养基混合，加入六孔板中，然后放置细胞培养箱中于37℃的条件孵育处理1h，去除所述基质胶，再铺入多能干细胞，且每日更换新鲜的DMEM/F12培养基。

在其中一个实施例中，所述第一诱导培养基中含有复合维生素E以及吗啡肽。

在其中一个实施例中，所述第二诱导培养基中含有复合维生素E。

在其中一个实施例中，所述第一诱导培养以及所述第二诱导培养的条件均为：温度为36℃-38℃，6％二氧化碳。

在其中一个实施例中，所述第一离心处理为：将神经干细胞于500×g、4℃的条件下离心处理10min。

在其中一个实施例中，所述第二离心处理为：取第一离心处理后的上清液于2000×g、4℃的条件下离心处理20min-25min。

在其中一个实施例中，所述第三离心处理为：取第二离心处理后的上清液于10000×g、4℃的条件下离心处理35min-45min，然后过0.22μm过滤器。

在其中一个实施例中，所述第四离心处理为：取第三离心处理后的上清液于100000×g、4℃的条件下离心处理1h。

在其中一个实施例中，所述第五离心处理为：往第四离心处理后的沉淀中加入预冷的PBS重悬沉淀，于100000×g、4℃的条件下离心处理1h。

在其中一个实施例中，所述皮肤修复组合物包括以下重量份的成分：15份-30份透明质酸、1份-10份外泌体、1份-5份海藻胶、1份-5份甘油、1份-3份多肽、0.01份-0.05份明胶。

在其中一个实施例中，所述皮肤修复组合物的制备方法包括以下步骤：

将透明质酸、海藻胶、甘油以及多肽在1000r/min-1500r/min的条件下混合10min-20min后继续加入外泌体以及明胶，继续以500r/min-1000r/min的条件混合10min-15min，得到皮肤修复组合物。

上述方案中通过将人多能干细胞诱导得到神经干细胞的方法，通过添加小分子抑制剂，得到的神经干细胞不受其它细胞影响，减少异源因素的干扰，具有更安全的应用价值，通过优化方法步骤以及培养条件，从人多能干细胞诱导出高纯度的可增殖和自我更新的神经干细胞，膜电位约为-38mV，并且均表达外泌体标志蛋白，从诱导得到的神经干细胞分离出的外泌体粒径在30-150nm，1488个蛋白和175个差异蛋白，对差异蛋白及外泌体中的定量蛋白进行生物信息学分析，结果显示神经干细胞外泌体中的标志物蛋白明显高于细胞，并且富含参与炎症调节、血管生成和神经生成相关的蛋白，为其修复机制提供依据。另外，将外泌体应用于皮肤修复组合物的制备中，能赋予皮肤修复组合物显著的修复效果。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1：

将基质胶放在冰上溶解，在六孔板中用预冷的枪头加入1mL用DMEM/F12培养基稀释的基质胶，随后放入细胞培养箱中孵育，1h后，除去基质胶，将人多能干细胞铺入六孔板中进行培养，在显微镜下观察细胞的生长状态，每日更换新鲜的培养基；待生长至20％密度后，将人多能干细胞的更换为第一神经诱导培养基。每天更换培养液，培养2d后，更换为第二神经诱导培养基，每天更换培养液，诱导培养5d后，用用Accutase酶消化细胞，用神经维持培养基将其放置提前铺胶处理的六孔板中，并添加10μM小分子抑制剂，记为第一代神经干细胞的第一代；

继续传代培养至第14代后，往所述神经维持培养基中添加5μg/mL牛血清蛋白，得到神经干细胞。

图1中的图A为人多能干细胞诱导得到神经干细胞的分化流程示意图，图1中的B为明场下的诱导多能干细胞、贴壁形态的神经干细胞以及神经干细胞球的显微示意图，图1中的C为神经干细胞标记蛋白Nestin、Pax6和Sox2的免疫荧光共聚焦显微镜图像，图1中的图D为神经干细胞标记物Nestin、Pax6和Sox2在未分化人多能干细胞和获得的NSCs中的mRNA表达水平示意图，由图1中分析可知本申请中人多能干细胞诱导得到的神经干细胞具有更优异的稳定性和纯度，传代培养至第13-14代，细胞在基质胶中主要以成团贴壁、更加致密，通过免疫荧光观察神经干细胞标志蛋白nestin，pax6和sox2的表达情况，结果显示本发明诱导的神经干细胞都高表达nestin，pax6和sox2这三种标志蛋白，而为了进一步鉴定神经干细胞，我们以诱导前的人多能干细胞作为对照，通过qPCR观察三种标志物的mRNA表达情况，人多能干细胞中几乎没有表达，而诱导后的神经干细胞中的标志物mRNA相对表达量都比较高，说明本申请诱导得到的神经干细胞的纯度高。

实施例2：

将人多能干细胞和第13代神经细胞分别铺至六孔板中，每日用新鲜培养基替换时，收集旧的培养基，两种细胞的培养基均为无血清配方，可排除血清外泌体的干扰，神经干细胞中传入铺有基质胶的75mm²培养瓶中进行大批量培养，将收集的培养基在500×g、4℃的条件下离心处理10min，弃沉淀，将上清液转移到干净的离心管中；于2000×g、4℃的条件下离心处理20min，以去除大细胞碎片，将上清液转移至干净的离心管中；于10000×g、4℃的条件下离心处理40min，弃去含细胞碎片的沉淀，将所得上清液通过0.22μm过滤器以去除残余细胞碎片，继续将过滤的上清液转移至干净的贝克曼专用8/9ml超速离心管中，于100000×g、4℃的条件下离心处理1h，将离心管取出后，吸去上清液，然后加入预冷的PBS重悬沉淀，再次于100000×g、4℃的条件下超速离心处理1h，离心后弃去上清液，得到神经干细胞外泌体。

将实施例2中的外泌体通过透射电镜进行形态学鉴定，图2所示，图2中的图A为人多能干细胞以及神经细胞的外泌体的透射电镜示意图，图2中的B为人多能干细胞以及神经细胞外泌体的蛋白质产量示意图，图2中的图C为人多能干细胞数目以及神经细胞数目与外泌体总蛋白线性示意图，图2中的图D为人多能干细胞以及神经细胞的粒径范围示意图，图2中的图E为人多能干细胞以及神经细胞的外泌体Zeta电位示意图，图2中的图F为人多能干细胞以及神经细胞及其外泌体Western检测ALIX、CD63、TSG101和GAPDH的蛋白质表达水平示意图。从图2中可以看出神经干细胞外泌体在电镜下都呈现椭圆形或类圆形的碗状结构，且大小在30-60nm，主要分布于10nm，但人多能干细胞外泌体粒径范围为40-120nm，主要分布在70nm。选取四次跨膜蛋白CD63和两种与外泌体形成相关的胞质蛋白ALIX、TSG101作为外泌体标志物，进行了Western blot蛋白质印迹实验，可知，人多能干细胞的外泌体与神经干细胞的外泌体中的蛋白表达差异大。

另外，对差异性表达的蛋白进行测试。如图3所示，图3中的图A为NSCs和外泌体中鉴定的独特蛋白质的数量示意图，图3中的B为神经干细胞外泌体中已鉴定蛋白质(1类)、定量蛋白质(2类)和与细胞相比的差异蛋白质(3类)的数量示意图，图3中的C为神经干细胞与外泌体中蛋白质的可视化热图，图3中的图D为外泌体中175蛋白分类示意图。从图3分析可知，外泌体中共鉴定到1488种蛋白，其中46种为外泌体高表达，而细胞中没有发现的蛋白质，1442种为与细胞共同表达，但表达水平不同的蛋白质。将每组样品的丰度值归一化后，以细胞组为control，外泌体组为Sample，以丰度值之比(Abundance Ratio：Sample/Control)大于2，p＜0.05，筛选高表达的差异蛋白，结果显示外泌体中有1471种蛋白质可以被量化，其中有175种为高表达的差异蛋白。在细胞与外泌体中的所有蛋白质中，有753种蛋白质为外泌体中未发现或者低表达的蛋白质。蛋白质的可视化热图，红色点代表外泌体高表达的蛋白质，蓝色点代表低表达的蛋白质，且都有显著性差异，有部分蛋白在外泌体中的表达水平都较高，说明与细胞相比，外泌体中可能含有高表达的功能性蛋白质。通过David在线分析工具对这175个蛋白质进行GO本体论分析，有172个蛋白可被识别，差异蛋白的蛋白质成分主要为细胞外外泌体成分、细胞质膜、细胞外区域组分和细胞溶质等成分，体现了外泌体的特征，列出了质谱在外泌体组中鉴定到的高表达典型蛋白标志物，包括ALIX、TSG101和四次跨膜蛋白CD31等。在差异蛋白参与的生物学过程中，ECM重构、细胞黏附、免疫应答和细胞增殖、细胞迁移等均为皮肤创伤修复中的重要过程。说明神经干细胞外泌体与细胞相比，含有更多的功能性蛋白，具有更显著的修复作用。

如图4所示，图4为神经干细胞和神经干细胞外泌体的差异蛋白表达分析示意图，对神经干细胞和神经干细胞外泌体的差异蛋白表达分析可知，发现神经干细胞外泌体中除了含有更多的外泌体相关蛋白，还含有更多与抗炎、促血管生成、促进轴突再生相关的蛋白，体现了神经干细胞外泌体中含丰富的蛋白参与细胞迁移与黏附、抗炎、促血管生成、抗氧化与促进轴突再生。

如图5所示，图5中的图A为各处理组细胞迁移示意图，图5中的图B为各处理组在12h、24h的细胞迁移率示意图，(计算公式为细胞迁移率＝(初始划痕面积-24h后的划痕面积)/初始划痕面积×100％。(*＝P<0.05，**＝P<0.01，***＝P<0.001.)；由图5分析可知，通过划痕实验探索神经干细胞的外泌体对细胞迁移的影响。将人多功能干细胞外泌体以及bFGF生长因子作为阳性对照。如图5中的图A所示神经干细胞外泌体组的细胞在12小时已有明显迁移，在24小时后，神经干细胞外泌体处理过的细胞组几乎完全迁移，与人多能干细胞外泌体组有差异，说明神经干细胞外泌体可以显著促进HDF细胞划痕后的迁移效果，也初步验证了对神经干细胞外泌体蛋白质组学的功能分析，神经干细胞外泌体中含有多种细胞黏附蛋白，如LAMB1,Syndecan-2等，有助于促进细胞迁移，进而促进皮肤修复。

如图6所示，图6中的图A为各处理组6H后拍照观察血管生成情况示意图，图6中的图B为各处理组HUVEC细胞进行血管形成的计算示意图。由图6分析可知：将HUVEC以2×10⁵/mL的细胞密度种到铺有Matrigel的96孔板中，每孔100μL，以20μg/mL的浓度加入不同细胞的外泌体，以含2％FBS的DMEM为空白对照组，在6H后可以看到两种外泌体组都形成了网状小管结构，而且明显比对照组更好，通过定量分析可以看出神经干细胞外泌体有更多的小管节点和分支总长度，说明了神经干细胞外泌体对HUVEC细胞有明显的促血管生成能力。神经干细胞外泌体的蛋白质组学分析中参与血管生成的相关蛋白质有S1PR1,Ephrin,SFRP1等。

实施例3：

将30份透明质酸、5份海藻胶、5份甘油以及1份多肽在1000r/min-1500r/min的条件下混合10min-20min后继续加入10份外泌体以及0.01份明胶，继续以500r/min-1000r/min的条件混合10min-15min，得到皮肤修复组合物。

需要说明的是，本实施例中采用的是实施例2中得到神经干细胞外泌体。

将所述皮肤修复组合物进行体外细胞摄取实验。制备装载DiD染料标记的皮肤修复组合物，将皮肤修复组合物在不同时间段的释放液加入到提前用DAPI标记过的HDF细胞中，孵育一段时间后，观察细胞对外泌体的摄取情况。结果如图7所示。

图7中的图A为皮肤修复组合物在不同时间点释放液加入到HDF细胞中共培养后，HDF的摄取情况示意图，图7中的图B为HDF细胞摄取神经干细胞外泌体的定量分析。从图7中分析可知，随着时间的增加，细胞摄取了更多的外泌体，说明皮肤组合物能在体外对神经外泌体具有优异的缓释作用。

为了进一步验证神经干细胞外泌体的皮肤修复作用，还做了以下试验：采用小鼠皮肤全层损伤涉及皮下组织、感觉神经末梢等结构的缺失和部分神经免疫功能的降低，伤口表面的愈合一般要两周时间左右，可以作为皮肤创伤修复的短期模型。构建小鼠皮肤创伤模型后，设置神经干细外泌体组以及皮肤修复组合物组，其中神经干细胞外泌体的对照组为PBS，对伤口进行每日给药，给药量为每只小鼠50μg的外泌体，而皮肤修复组合物组以空白水凝胶为对照组，给药剂量相同，但每隔三天给药一次。每日对伤口部位进行拍照，结果如图8所示。

图8中的图A为各组促进小鼠皮肤创伤愈合示意图，图8中的图B为各组小鼠伤口面积的量化示意图。由图8分析可知，在手术后第5天时神经干细胞外泌体组的伤口面积比PBS组小，而皮肤修复组合物。在第10天时，单独外泌体组的伤口已明显缩小，与PBS有明显差异，而载外泌体的皮肤修复组合物也明显比空白水凝胶组恢复得更快，降低了给药频率，提高了生物利用度。

在皮肤创伤后的第12天，对各组小鼠进行麻醉剪取伤口皮肤，并制作石蜡切片，进一步从切片染色上对皮肤伤口的愈合后期进行评价。通过HE染色评价皮肤中的组织结构修复情况，结果如图9所示。

图9为小鼠皮肤伤口切片的HE染色、Masson染色以及SMA、CD31的免疫组示意图，从图9中分析可知，通过HE染色评价皮肤中的组织结构修复情况，通过Masson三色染色可以判断皮肤中的胶原再生情况，SMA是平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin)标志，SMA的增多说明皮肤平滑肌细胞的修复情况，有助于牵拉皮肤伤口的收缩，加快伤口愈合。此外，在炎症期过后，血管生成是增殖期的主要过程，CD31是血小板-内皮细胞粘附分子，可以标记新生血管数量的多少与血管再生情况。通过对各组皮肤切片进行HE、Masson染色和CD31、SMA的免疫组化，并通过ImageJ软件中的IHC Toolbox工具进行半定量分析。图10中的图A为使用ImageJ软件分析各组切片的表皮厚度，图10中的图B、图C以及图D为使用IHC Toolbox工具对Masson三色染色中的蓝色胶原以及免疫组化中的SMA、CD31进行半定量的示意图，结合图10分析，本申请中神经外外泌体具有促进再上皮化、促进胶原再生、促进皮肤收缩和血管生成等综合作用达到皮肤创伤修复的效果，将神经外泌体应用与皮肤修复组合物中，也具有较高的物的生物利用度，促进皮肤修复作用显著。

图11为各组对皮肤中神经再生标记物Gap43和Tuj1的免疫荧光染色结果示意图，从图11中分析可知本申请的神经外泌体具有显著的神经再生效果，其应用于皮肤修复组合物中依然具有显著神经再生效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种外泌体的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

将人多能干细胞放置第一培养基进行人多能干细胞传代培养，待人多能干细胞生长至20％-25％的密度，转移至第一诱导培养基进行第一诱导培养，所述第一诱导培养2d-3d后转移至第二诱导培养基进行第二诱导培养，所述第二诱导培养至5d后，用Accutase酶消化细胞，用神经维持培养基将其放置提前铺胶处理的六孔板中，并添加小分子抑制剂，记为第一代神经干细胞的第一代；

继续传代培养至第14代后，往所述神经维持培养基中添加牛血清蛋白，得到神经干细胞；

将所述神经干细胞进行第一离心处理、第二离心处理、第三离心处理以及第四离心处理后，添加PBS重悬外泌体沉淀，经过第五离心处理，得到神经干细胞外泌体；

其中，所述外泌体粒径为30nm-150nm；所述外泌体能应用于皮肤修复组合物的制备中。

2.根据权利要求1所述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第一培养基为DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求2所述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述人多能干细胞传代培养为：将基质胶溶解后与所述DMEM/F12培养基混合，加入六孔板中，然后放置细胞培养箱中于37℃的条件孵育处理1h，去除所述基质胶，再铺入多能干细胞，且每日更换新鲜的DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求2所述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第一诱导培养基中含有复合维生素E以及吗啡肽。

5.根据权利要求4所述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第二诱导培养基中含有复合维生素E。

6.根据权利要求5所述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第一诱导培养以及所述第二诱导培养的条件均为：温度为36℃-38℃，6％二氧化碳。

7.根据权利要求1述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第一离心处理为：将神经干细胞于500×g、4℃的条件下离心处理10min。

8.根据权利要求7述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第二离心处理为：取第一离心处理后的上清液于2000×g、4℃的条件下离心处理20min-25min。

9.根据权利要求8述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第三离心处理为：取第二离心处理后的上清液于10000×g、4℃的条件下离心处理35min-45min，然后过0.22μm过滤器。

10.根据权利要求9述的外泌体的提取方法，其特征在于，所述第四离心处理为：取第三离心处理后的上清液于100000×g、4℃的条件下离心处理1h。

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