CN111454894A - 一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，包括上清液分离、初提取、二次提取、培养基纯化培养、诱导分化和冷冻储存。本发明的有益效果是：通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3CS‑NK‑B1和3CS‑NK‑B2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。

Description

一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法
技术领域
本发明涉及一种细胞外泌体的培养方法，具体为一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，属于生物培养技术领域。
背景技术
细胞外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡，包含有蛋白质、mRNA 、miRNA和DNA片段等生物活性物质,参与人体许多重要的生理或病例过程，在细胞通讯、细胞迁移、促进组织修复或调节免疫反应等作用，具有广阔的应用前景，获得高纯度的细胞外泌体一直是展开应用研究的前提。
由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后，高速离心得到。
上述方法提取出的细胞外泌体杂蛋白含量特别高，纯度很不纯，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，包括以下步骤：
步骤一、上清液分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤二、初提取，将步骤一所述的培养上清液与外泌体提取液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤三、二次提取，将步骤二所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
步骤四、培养基纯化培养，将得到的细胞外泌体转移到纯化培养基上进行除杂纯化；
步骤五、诱导分化，将步骤四所得到的纯化细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化；
步骤六、冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，将培养上清液与Total exosomeIsolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液，并在4℃，10000g条件下离心60min得到含有干细胞外泌体的浓缩液。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，分化培养基由两部分组成，分化培养基A是在基础培养基中添加血小板衍生因子（PDGF AB）、地塞米松和10%胎牛血清（FBS）的培养基；分化培养基B为分化培养基A和mTeSR1培养基的混合液；所述细胞培养板为I型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，MSC培养液为基础培养基中添加FBS、GlutaMAX-I和非必需氨基酸的培养基。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。
本发明的有益效果是：该干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法设计合理：
1、通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；
2、改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。
附图说明
图1为本发明流程结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，包括以下步骤：
步骤一、上清液分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤二、初提取，将步骤一所述的培养上清液与外泌体提取液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤三、二次提取，将步骤二所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
步骤四、培养基纯化培养，将得到的细胞外泌体转移到纯化培养基上进行除杂纯化；
步骤五、诱导分化，将步骤四所得到的纯化细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化；
步骤六、冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基，保证所使用的干细胞活性充足。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，将培养上清液与Total exosomeIsolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液，并在4℃，10000g条件下离心60min得到含有干细胞外泌体的浓缩液，改变已有的离心提取技术，方便后续的纯化操作。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，分化培养基由两部分组成，分化培养基A是在基础培养基中添加血小板衍生因子（PDGF AB）、地塞米松和10%胎牛血清（FBS）的培养基；分化培养基B为分化培养基A和mTeSR1培养基的混合液；所述细胞培养板为I型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长，抑制杂蛋白的表达和扩撒，定向对细胞进行诱导分化，使其外泌体量和质得以提高。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，MSC培养液为基础培养基中添加FBS、GlutaMAX-I和非必需氨基酸的培养基，保证对应所需的营养供应充足。
进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存，保证外泌体以及少量细胞的活性，方便下次的直接取用。
工作原理：在使用该干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法时，首先将干细胞的培养液进行分离，选取其上清液，再进行两次提纯提取，提取后的物质放置在纯化培养基上进行纯化，纯化培养基内含有抑制剂，有效防止其他杂蛋白表达，然后将纯化后的物质用采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化，将分化后的外泌体进行-80℃的深低温冷藏即可，方便下次取用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、上清液分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤二、初提取，将步骤一所述的培养上清液与外泌体提取液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
步骤三、二次提取，将步骤二所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
步骤四、培养基纯化培养，将得到的细胞外泌体转移到纯化培养基上进行除杂纯化；
步骤五、诱导分化，将步骤四所得到的纯化细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化；
步骤六、冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤一中，将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤二中，将培养上清液与Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液，并在4℃，10000g条件下离心60min得到含有干细胞外泌体的浓缩液。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤五中，分化培养基由两部分组成，分化培养基A是在基础培养基中添加血小板衍生因子（PDGF AB）、地塞米松和10%胎牛血清（FBS）的培养基；分化培养基B为分化培养基A和mTeSR1培养基的混合液；所述细胞培养板为I型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤五中，MSC培养液为基础培养基中添加FBS、GlutaMAX-I和非必需氨基酸的培养基。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤六中，在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。
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