CN114250196A - 一种外泌体扩增及保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1、间充质干细胞的选取；步骤S2、培养上清液的制备；骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。本发明公开的扩增和保存方法扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高。

Description

一种外泌体扩增及保存方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种外泌体扩增及保存方法。
背景技术
外泌体(Exosomes)，或称细胞外囊泡(EV)，是数种起源与功能不同的，具有双层膜结构，直径为30nm～200nm的囊泡结构。其功能有参与细胞之间的信息传递与物质交换、对宿主病原体相互关系的调节、炎症反应的介导等。外泌体的成分包括DNA、RNA、糖类、脂类与蛋白质等，由于其参与多种生理与病理过程，其成分可以作为对多种传染性疾病与肿瘤诊断的生物标志物。
对外泌体进行扩增和保存是从基因根源入手，提高传染性疾病与肿瘤诊断的准确性，减小患者生理痛苦，有效改善损伤器官问题，根据不同用户的疾病进行精准治疗，从而达到更好的治疗效果的有效措施。然而，现有技术中对外泌体的扩增和保存方法鲜有报道，进而限制了外泌体的进一步应用。仅有的部分报道涉及到的扩增和保存方法也或多或少存在工艺复杂，操作控制不方便，成本高，扩增速度慢且稳定性不好，扩增的灵敏度和准确不高，易出现错配，扩增和保存效果不好的缺陷。
中国发明专利申请CN112662739A公开了一种用于NGS平台的尿液外泌体RNA提取和文库构建方法，属于医学和生物技术领域。通过添加助沉试剂到尿液中实现外泌体有效沉降，解决RNA材料受限的问题，同时采用Trizol试剂直接对外泌体进行RNA提取且去除回溶、纯化步骤，减少RNA在提取中损失和降解，为后续建库提供合格原料。通过修复cDNA损伤，优化末端修复加A、纯化步骤，以及文库扩增反应循环数，使用高保真酶预混液进行PCR扩增进行建库，该文库保存了外泌体分子多样性，为NGS技术在液体活检和诊断的应用提供可靠样本。该方法有效解决了尿液样本外泌体含量低，提取RNA总量低，无法有效建库，利用NGS平台测序的难题。然而其并不涉及外泌体的具体扩增和保存方法，扩增和保存效果有待进一步提高。
因此，本领域仍然需要一种扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高的外泌体扩增及保存方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种扩增和保存效果，工艺简单，操作控制方便，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高的外泌体扩增及保存方法。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
优选的，步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。
优选的，步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15-23g/L，表皮生长因子5-12ng/mL，胎牛血清8-14ng/mL，青霉素80-120u/mL，链霉素100-110μg/mL，田菁粉0.03-0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10-20mg/mL。
优选的，所述基础培养基为DMEM-F12培养液、α-MEM培养基、DMEM培养液中的至少一种。
优选的，所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
优选的，所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20-30g/L、氯化钠1～3mol/L、超支化聚甘油50-80g/L。
优选的，所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品。
优选的，所述上清液、助沉试剂的体积比为(3-5):2。
优选的，所述第一离心的离心力为500～800xg，时间5-8min，温度3-6℃。
优选的，所述第二离心的离心力为2000～3000xg，时间8-10min，温度1-5℃。
优选的，所述第三离心的离心力为10000～20000xg，时间15-20min，温度4-8℃。
优选的，步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基20-30g/L，胎牛血清10-20ng/mL，诱导因子5～20μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液。
优选的，步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比(3-5):1混合形成的混合物。
优选的，步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:(0.3-1.5)。
优选的，所述深低温冷藏的温度为-85℃～-40℃。
优选的，所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:(0.5-0.8):(0.3-0.6):(0.8-1.2)混合形成的混合物。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)本发明提供的外泌体扩增及保存方法，无需专用设备和仪器，耗能低，操作控制方便，效率高，成本低，适合大规模工业化应用；通过扩增和保存工艺的调整，这些工艺参数相互配合共同作用，使得该方法扩增和保存效果，扩增速度快，稳定性好，扩增的灵敏度和准确高。
(2)本发明提供的外泌体扩增及保存方法，步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15-23g/L，表皮生长因子5-12ng/mL，胎牛血清8-14ng/mL，青霉素80-120u/mL，链霉素100-110μg/mL，田菁粉0.03-0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10-20mg/mL。通过田菁粉、鱼蛋白氨基酸发酵液等成分加入，使得培养基营养更丰富，生物安全性更好，能有效提高干细胞的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，抑制衰老凋亡，使得细胞稳定性和干性足。
(3)本发明提供的外泌体扩增及保存方法，所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20-30g/L、氯化钠1～3mol/L、超支化聚甘油50-80g/L；通过各成分协同作用，使得外泌体能较好地沉降，具有经济实用，操作方便快捷的特点。
(4)本发明提供的外泌体扩增及保存方法，步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基20-30g/L，胎牛血清10-20ng/mL，诱导因子5～20μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液；通过培养基中各成分的相互作用使得诱导分化扩增效率高，效果好。
(5))本发明提供的外泌体扩增及保存方法，步骤S5中添加保护剂，通过保护剂组分的配比调整，使得外泌体稳定性更好，保存时间更长。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。
实施例1
一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15g/L，表皮生长因子5ng/mL，胎牛血清8ng/mL，青霉素80u/mL，链霉素100μg/mL，田菁粉0.03mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10mg/mL；所述基础培养基为DMEM-F12培养液。
所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20g/L、氯化钠1mol/L、超支化聚甘油50g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品。
所述上清液、助沉试剂的体积比为3:2。
所述第一离心的离心力为500xg，时间5min，温度3℃；所述第二离心的离心力为2000xg，时间8min，温度1℃；所述第三离心的离心力为10000xg，时间15min，温度4℃。
步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基20g/L，胎牛血清10ng/mL，诱导因子5μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液。
步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比3:1混合形成的混合物；所述外泌体与保护剂的质量比为100:0.3；所述深低温冷藏的温度为-85℃；所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:0.5:0.3:0.8混合形成的混合物。
实施例2
一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基17g/L，表皮生长因子7ng/mL，胎牛血清10ng/mL，青霉素90u/mL，链霉素102μg/mL，田菁粉0.04mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液13mg/mL；所述基础培养基为DMEM-F12培养液。
所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮23g/L、氯化钠1.5mol/L、超支化聚甘油60g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品；所述上清液、助沉试剂的体积比为3.5:2。
所述第一离心的离心力为600xg，时间6min，温度4℃；所述第二离心的离心力为2200xg，时间8.5min，温度2.5℃；所述第三离心的离心力为13000xg，时间17min，温度5℃。
步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基22g/L，胎牛血清13ng/mL，诱导因子9μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液；步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比3.5:1混合形成的混合物；步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:0.6。
所述深低温冷藏的温度为-70℃；所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:0.6:0.4:0.9混合形成的混合物。
实施例3
一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基20g/L，表皮生长因子9ng/mL，胎牛血清11ng/mL，青霉素100u/mL，链霉素105μg/mL，田菁粉0.045mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液15mg/mL。
所述基础培养基为DMEM-F12培养液；所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮25g/L、氯化钠2mol/L、超支化聚甘油65g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品；所述上清液、助沉试剂的体积比为4:2。
所述第一离心的离心力为650xg，时间6.5min，温度4.5℃；所述第二离心的离心力为2500xg，时间9min，温度3.5℃；所述第三离心的离心力为15000xg，时间18min，温度6℃。
步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基25g/L，胎牛血清15ng/mL，诱导因子14μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液。
步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比4:1混合形成的混合物；步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:1.2；所述深低温冷藏的温度为-60℃；所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:0.7:0.5:1.1混合形成的混合物。
实施例4
一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基21g/L，表皮生长因子11ng/mL，胎牛血清13ng/mL，青霉素110u/mL，链霉素109μg/mL，田菁粉0.05mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液18mg/mL。
所述基础培养基为DMEM-F12培养液；所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮28g/L、氯化钠2.5mol/L、超支化聚甘油75g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品；所述上清液、助沉试剂的体积比为4.5:2。
所述第一离心的离心力为750xg，时间7.5min，温度5.5℃；所述第二离心的离心力为2900xg，时间9.5min，温度4.5℃；所述第三离心的离心力为19000xg，时间19min，温度7.5℃；步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基28g/L，胎牛血清18ng/mL，诱导因子17μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液。
步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比4.5:1混合形成的混合物；步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:1.3；所述深低温冷藏的温度为-55℃；所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:0.75:0.55:1.2混合形成的混合物。
实施例5
一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基23g/L，表皮生长因子12ng/mL，胎牛血清14ng/mL，青霉素120u/mL，链霉素110μg/mL，田菁粉0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液20mg/mL；所述基础培养基为DMEM-F12培养液；所述鱼蛋白氨基酸发酵液为采用天然绿色发酵工艺常温酿制而成；由宁波吉丰生物科技发展有限公司提供，具体制备方法参见中国发明专利号CN201810521499.9实施例1中鱼蛋白氨基酸发酵液的制备方法。
所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮30g/L、氯化钠3mol/L、超支化聚甘油80g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品；所述上清液、助沉试剂的体积比为5:2。
所述第一离心的离心力为800xg，时间8min，温度6℃；所述第二离心的离心力为3000xg，时间10min，温度5℃；所述第三离心的离心力为20000xg，时间20min，温度8℃。
步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基30g/L，胎牛血清20ng/mL，诱导因子20μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液。
步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比5:1混合形成的混合物；步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:1.5；所述深低温冷藏的温度为-40℃。
所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:0.8:0.6:1.2混合形成的混合物。
对比例1
本例提供一种外泌体扩增及保存方法，其与实施例1基本相同，不同的是没有添加诱导因子。
对比例2
本例提供一种外泌体扩增及保存方法，其与实施例1基本相同，不同的是没有添加鱼蛋白氨基酸发酵液。
为了进一步说明本发明实施例中所涉及的外泌体扩增及保存方法的有益技术效果，将以上实施例1-5及对比例1-2制备的外泌体进行相关性能实验，实验结果见表1；测试方法参见CN113558042A，按保存10天后外泌体粒子浓度的保留率来衡量保存效果；增殖能力是取第7d的细胞用酶标仪在450nm处检测OD值，每组取6个重复样，取平均值。
表1
项目 保存效果 7dOD值(5％Ection)
单位 ％ —
实施例1 100.00 0.90
实施例2 100.00 0.92
实施例3 99.98 0.95
实施例4 99.96 0.96
实施例5 99.93 0.98
对比例1 100.00 0.86
对比例2 100.00 0.89
由以上数据结果可以看出，本发明实施例公开的外泌体扩增及保存方法较对比例保存效果更好，外泌体增殖能力更强；诱导因子和鱼蛋白氨基酸发酵液的添加对改善上述性能均有益。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种外泌体扩增及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、间充质干细胞的选取：将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞；
步骤S2、培养上清液的制备：对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；
步骤S3、将经过步骤S2分离出的上清液中加入助沉试剂混合，依次进行第一离心、第二离心和第三离心后，得到的沉淀为干细胞外泌体；
步骤S4、将经过步骤S3制成的干细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化扩增；
步骤S5、将经过步骤S4诱导分化扩增后的外泌体与保护剂混合均匀后，置于深低温冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S1中所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S2中所述对干细胞进行培养使用的培养基，其组分及其含量如下：基础培养基15-23g/L，表皮生长因子5-12ng/mL，胎牛血清8-14ng/mL，青霉素80-120u/mL，链霉素100-110μg/mL，田菁粉0.03-0.06mg/mL，鱼蛋白氨基酸发酵液10-20mg/mL。
4.根据权利要求3所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM-F12培养液、α-MEM培养基、DMEM培养液中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述助沉试剂为水溶液，包括如下含量的各成分：聚甲基吡咯烷酮20-30g/L、氯化钠1～3mol/L、超支化聚甘油50-80g/L；所述超支化聚甘油是超支化聚甘油第4代产品。
6.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述上清液、助沉试剂的体积比为(3-5):2。
7.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述第一离心的离心力为500～800xg，时间5-8min，温度3-6℃；所述第二离心的离心力为2000～3000xg，时间8-10min，温度1-5℃；所述第三离心的离心力为10000～20000xg，时间15-20min，温度4-8℃。
8.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S4中所述分化培养基包括：分化基础培养基20-30g/L，胎牛血清10-20ng/mL，诱导因子5～20μg/mL；所述分化基础培养基为DMEM-F12培养液；所述诱导因子为促细胞生长剂3CS-NK-B1、3CS-NK-B2、M-CSF、IL-4按质量比1:(0.5-0.8):(0.3-0.6):(0.8-1.2)混合形成的混合物。
9.根据权利要求1所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，步骤S5中所述保护剂为四氢嘧啶、氨磷汀按质量比(3-5):1混合形成的混合物；步骤S5中所述外泌体与保护剂的质量比为100:(0.3-1.5)。
10.根据权利要求1-9任一项所述的外泌体扩增及保存方法，其特征在于，所述深低温冷藏的温度为-85℃～-40℃。
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