CN116286664A - 一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 - Google Patents
一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286664A CN116286664A CN202310227074.8A CN202310227074A CN116286664A CN 116286664 A CN116286664 A CN 116286664A CN 202310227074 A CN202310227074 A CN 202310227074A CN 116286664 A CN116286664 A CN 116286664A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cell
- solution
- imtp
- umbilical cord
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 138
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 93
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 125
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims abstract description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 72
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 68
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 29
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 claims description 19
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 230000007574 infarction Effects 0.000 claims description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 16
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 13
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims description 13
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 10
- 206010028594 Myocardial fibrosis Diseases 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 8
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 230000004217 heart function Effects 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 8
- OTPDWCMLUKMQNO-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydropyrimidine Chemical compound C1NCC=CN1 OTPDWCMLUKMQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 7
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 7
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000033774 Ventricular Remodeling Diseases 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 4
- 230000001964 calcium overload Effects 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 claims description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 claims description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- NIUAGEVCVWHMTA-UHFFFAOYSA-N 5-(4-iodophenyl)-1-(4-methylsulfonylphenyl)-3-(trifluoromethyl)pyrazole Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1N1C(C=2C=CC(I)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=N1 NIUAGEVCVWHMTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 60
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 31
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 26
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 17
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 12
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 12
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 12
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 12
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 12
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 11
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 10
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 10
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 9
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 9
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 9
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 9
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 9
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 9
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 8
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 7
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 7
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 7
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 7
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 7
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 5
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 5
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 5
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000027746 artery morphogenesis Effects 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000002906 medical waste Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 3
- 238000013042 tunel staining Methods 0.000 description 3
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 description 2
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000012401 Fluo-3 AM staining Methods 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000003217 Tetany Diseases 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000035565 breathing frequency Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 2
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150054866 Acadl gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101150073597 DLST gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040401 DNA topoisomerase 3-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 101100295675 Dictyostelium discoideum odhB gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 1
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 1
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 101000611068 Homo sapiens DNA topoisomerase 3-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001076422 Homo sapiens Interleukin-1 receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- -1 IL-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100026017 Interleukin-1 receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710177984 Isocitrate dehydrogenase [NADP] Proteins 0.000 description 1
- 101710102690 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101710175291 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101710157228 Isoepoxydon dehydrogenase patN Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000007201 Myocardial reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000973497 Siphonognathus argyrophanes Species 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000002594 fluoroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003547 hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010921 in-depth analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000010117 myocardial relaxation Effects 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 230000016919 positive regulation of biological process Effects 0.000 description 1
- 230000025478 positive regulation of bone mineralization Effects 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000002660 stem cell treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007892 surgical revascularization Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000001644 umbilical artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000000596 ventricular septum Anatomy 0.000 description 1
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
本发明提供一种脐带间充质干细胞外泌体的用途，从多个水平和层次验证了人hUC‑MSC‑ES在体外心肌细胞模型和哺乳动物体内心肌I/R模型中的有效性，并通过多种先进可靠的技术检测方法，验证了该治疗的长期安全性和治疗效应，分析了可能的分子作用机制，同时还分析了该细胞衍生物在体内的动态生物学分布曲线和特征，为其临床适用性提供了重要证据支持。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体的用途。
背景技术
心血管疾病是全球重大的公共卫生问题，其中缺血性心脏病(ischemic heartdiseases，IHD)及其所致的心衰是全球范围内的主要死因，2015年全球有891.7万人死于IHD，到2030年每年死于心血管病的患者预计将达到2330万。目前我国缺血性心脏病的患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，至2021年我国有IHD患者1139万人。尽管临床上积极进行药物、介入治疗和外科血管重建术等措施，实现梗死心肌再灌注，挽救很多生命，但同时也造成进一步再灌注损伤，很难逆转其心衰的进程。急性心肌梗死(acute myocardialinfarction，AMI)导致不可逆的大范围心肌细胞损失和随后的心室重塑仍是慢性心功能不全和劳动力永久丧失的主要原因。要从根本上改善疗效，就必须发现新的能够有效减轻损伤和修复受损心肌的方法。
最近20年来，基础研究显示干细胞移植治疗可能减少梗死面积，促进新生血管形成，显著改善心功能和预后6，但在临床研究中干细胞疗效显示出分歧的结果：即部分研究结果显示有效，少数研究显示为中性或阴性结果。另外，干细胞治疗还存在保留和生存少、分化率低等固有瓶颈问题无法解决，制约了其疗效；同时不同干细胞自身的缺点和局限性也限制了其临床应用。目前已知在各种干细胞中，间充质干细胞(Mesenchymal StemCells，MSCs)易于获得，扩增能力强，可多谱系分化，免疫原性低，还具有免疫调节作用，能异体移植又安全，是在临床应用最多的一种干细胞。
脐带MSCs(human umbilical cord-derived MSCs，hUC-MSCs)比成体MSCs更原始，具有更强的增殖能力和自我更新能力，取材方便，易于收集、保存，且来源于医疗废弃物，采集时对供者无任何损害和痛苦，不受伦理、法律及道德方面限制；同时其致瘤性、病毒和细菌污染的可能性均较BW-MSCs低，含量丰富，具有较强的端粒酶活性，倍增时间短，免疫原性更低，异体移植时很少诱发免疫反应。研究显示hUC-MSCs具有分化为骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞(Cardiomyocytes，CMs)、神经样细胞等多种细胞的潜能，因而可能是细胞治疗修复组织损伤的理想种子细胞。猪AMI模型的研究表明hUC-MSCs能够改善心肌灌注、左室功能和心室重塑53，经静脉注射异体hUC-MSCs能够减少梗死面积和改善心功能54。临床研究也显示hUC-MSCs移植治疗能够改善心功能，减轻心脏重构和心梗后心衰，且不增加不良反应风险55 56。但是，hUC-MSCs作为细胞治疗，仍然存在移植细胞在靶器官的保留和生存极少、分化率低、具有致瘤风险和免疫原性等难以克服的问题。
目前已知绝大多数机体细胞均可分泌细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)，EVs根据直径大小可分为三种，外泌体(Exosome，ES)是其中体积最小的EVs，直径30-100nm，含有蛋白、脂类、糖类、DNAs、mRNAs、miRNAs及其他非编码RNAs，是功能最重要的EVs，也是生物纳米级载体。最近研究显示MSCs分泌的ES(MSC-ES)能够代替其亲代细胞发挥多种功能，在介导AMI后心肌细胞生存和重塑减轻中可能起重要作用。
MSCs是最有希望应用于临床的干细胞。然而MSCs全细胞移植后移植细胞保留、生存很少，且有肿瘤形成风险，使疗效大打折扣。最近研究显示无细胞的MSC-ES能够克服MSCs全细胞移植的局限性，同时几乎全景模拟其亲代细胞MSCs的有益作用，与MSCs治疗等效或者更高效。与MSCs相比，MSC-ES体积小而运动便利，能靶向特定组织，无免疫原性，可重复给药，生理学更稳定，可被细胞迅速摄取，经转移生物活性分子而影响靶细胞，是适合输送的纳米微粒。因此，MSC-ES比全细胞治疗更有优势。
AMI后再灌注恢复血供，可导致心肌细胞ATP减少、H+积聚、钙超载和活性氧产生，使缺血性损伤进一步加重和转化为不可逆，称为缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤。随着溶栓、介入、外科搭桥术等血运重建技术开展，多数AMI患者常常通过药物治疗、血栓自溶或者PCI/CABG术实现了再灌注治疗，所以心肌I/R损伤是导致AMI患者疗效不良、预后差的主要原因，也是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，与高致死率和高致残率有关。有效减轻心肌I/R损伤将可能显著改善预后，具有重要的临床意义。既往研究探索发现了一些能够减轻I/R的药物，有些药物，如心钠素、促红细胞生成素、艾塞那肽及线粒体保护剂-环孢菌素A等，甚至进入到临床研究阶段，但最终仍因无临床获益而中止。截止目前，尚无明确有效的减轻心肌I/R损伤的药物进入临床指南推荐应用，更没有一种减轻心肌I/R的细胞/无细胞生物药物进入指南推荐。
目前未有见脐带间充质干细胞外泌体用于预防或治疗I/R损伤。
发明内容
因此，本发明的第一个发明目的在于提供一种脐带间充质干细胞外泌体在预防或者治疗或者减轻心肌缺血再灌注损伤及其相关疾病的药物中的新用途。
本发明的第二个发明目的在于提供一种能够更好的预防或者治疗或者减轻心肌缺血再灌注损伤及其相关疾病的高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体。
为此，本发明提供了一种高表达IMTP(心肌靶向肽，其序列如SEQ ID No：5所示)的脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法，包括，在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-puro中插入SEQ ID No：1所示的双链片段，得到重组载体，采用重组载体与包装系统共同转染宿主细胞后得到慢病毒颗粒，用慢病毒颗粒感染脐带间充质干细胞，获得高表达IMTP的脐带间充质干细胞，获得细胞培养液，制成高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体。
进一步的，所述获得细胞培养液的过程包括如下步骤：取传代培养后的高表达IMTP的脐带间充质干细胞，重悬于无外泌体血清培养基中继续培养至至融合度为80％-95％时收取上清液，提取外泌体。
优选的，所述无外泌体血清培养基为10％FBS的DMEM/F12培养液。
优选的，培养4-6天，细胞的融合度达到80％-95％。
优选的，所述宿主细胞为293T细胞。所述包装系统包括重组载体、psPAX2质粒和pMD质粒。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
取传代培养后的脐带间充质干细胞，重悬于无外泌体血清培养基中继续培养至融合度为80％-95％时收取上清液，提取外泌体。
进一步的，所述提取外泌体的方法包括，将上清液在2000g-3000g下离心(例如20-40min)，再以8000-10000g下离心(例如30-60min)，取上清液过滤，滤液在100000g下离心(例如60-80min)去除液体，取沉淀物重悬于缓冲液中，得到脐带间充质干细胞外泌体溶液或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体溶液，加入或者不加入胶体溶液，即得。
优选的，还包括将上清液用0.22μm或0.45μm的滤膜过滤的步骤。
优选的，沉淀物重悬于缓冲液之后还可以在100000g下离心(例如60-80min)去除液体，取沉淀物重悬于缓冲液中，取上清液，即得脐带间充质干细胞外泌体溶液或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体溶液。
优选的，所述缓冲液为PBS(磷酸盐)缓冲液。本发明中，PBS或者磷酸盐缓冲液的配方如下：200mM Na2HPO4；35mM KH2PO4；2.74M NaCl；53mM KCl，pH 7.2～7.6。
进一步的，所述胶体溶液通过保存液加热后制得，所述保存液中含10-30％(w/v)植物源重组人血清白蛋白、20-40g/L海藻糖、30-50％甘油、2-4％四氢嘧啶和0.01-0.02mol/L磷酸盐缓冲液；优选的，胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体溶液的体积比为1-1.5∶1-1.5，优选的，所述保存液的pH值为7.0-7.5。
本发明还提供了上述任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体。
本发明还提供了一种药物组合物，包括上述任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体，还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、溶剂、缓冲液等常规辅料。所述药物组合物的剂型可以是注射剂、溶液剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂。
本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体或者上述任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体或者上述任一所述的药物组合物具有如下的(1)-(5)项中的至少一项用途：
(1)在制备预防或者治疗或者减轻心肌缺血再灌注损伤及其相关疾病的药物中的用途；
(2)在制备减轻炎症和/或减少心肌细胞凋亡的药物中的用途；
(3)在制备减轻钙超载和/或促进血管生成的药物中的用途；
(4)在制备减轻心肌细胞氧化应激损伤的药物中的用途；
(5)在制备减小梗死面积、改善心功能、减轻心肌纤维化中的至少一种的药物中的用途。
进一步的，所述相关疾病包括由心肌缺血再灌注损伤引起的炎症、心律失常、心室重塑、心肌纤维化、心梗后心衰中的一种或者多种。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的保存液，其特征在于，所述保存液中含10-30％(w/v)植物源重组人血清白蛋白、20-40g/L海藻糖、30-50％(v/v)甘油、2-4％(w/v)四氢嘧啶和0.01-0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述保存液的pH值为7.0-7.5。
本发明还提供了用于保存脐带间充质干细胞外泌体的胶体溶液，将所述的保存液加热后制得，优选的，加热温度为80-95℃，时间为10-30min。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的保存方法，取所述的胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液混合保存，优选的，胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液的体积比为1-1.5∶1-1.5，优选的，保存温度为不高于-4℃(例如4℃～-80℃)。
本发明制得的外泌体可以在制备后24h内使用(即当天使用)。也可以使用保存液(胶体溶液)进行保存处理之后贮存于-20℃，1个月内使用或者贮存于-80℃，6个月内使用。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括，在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-puro中插入SEQ ID No：1所示的双链片段，得到重组载体，采用重组载体感染脐带间充质干细胞，获得高表达IMTP的脐带间充质干细胞，获得细胞培养液，加入或者不加入药学上可接受的辅料，制成高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体，通过人LAMP2B的CDS区序列与心肌靶向肽IMTP相融合、并在前后分别加上甘氨酸linkers，前面加GCTCGA，后面加TCCGGAGGT；在序列前加上Kozak片段GCCACC，提高翻译效率；在序列两端加上酶切位点EcoRI(GAATTC)、BamHI(GGATCC)；将靶向肽IMTP+LAMP2B序列或Blank+LAMP2B序列(对照)整合到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-puro载体中，得到重组载体，采用重组载体与包装系统共同转染宿主细胞后得到慢病毒颗粒，用慢病毒颗粒感染脐带间充质干细胞，得到了高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体，相比于天然脐带间充质干细胞外泌体，对于心肌缺血再灌注损伤具有更加明显的预防或者治疗或者减轻作用。
2.本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，这些囊泡在外泌体提纯过程中会污染活细胞产生的外泌体。因此收获hUC-MSCs时必须确定死亡细胞占比＜5％。取传代培养后的脐带间充质干细胞，悬浮于无外泌体血清培养基中继续培养至融合度为80％-95％时收取上清液，该上清液方可用于提取外泌体。如果忽视培养基更换这一步，会导致所提取外泌体被大量其他外泌体污染，影响hUC-MSC-ES的治疗效应。
3.本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体的保存液，所述保存液包括10-30％(w/v)植物源重组人血清白蛋白、20-40g/L海藻糖、30-50％甘油、2-4％四氢嘧啶和0.01-0.02mol/L磷酸盐缓冲液。通过该保存液加热后得到胶体溶液，其中，四氢嘧啶：能够平衡ES膜内外渗透压，在高温、冷冻和干燥环境下对酶、DNA、细胞膜和整个ES提供保护作用，又避免了二甲基亚砜的可能毒性，更为高效和安全；人血清白蛋白：增加外泌体保存体系中的蛋白质浓度，防止蛋白酶对外泌体膜蛋白的水解；海藻糖：低温下海藻糖可在外泌体表面形成保护膜，保护蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体生物活性；甘油：使保存液具有抗冻性，在-20℃不会结冰，防止外泌体在保存使用过程中因冻融产生结构破坏；磷酸盐缓冲液：维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，保护外泌体结构的完整性及内含物的稳定性。该保存液能够极大提高脐带间充质干细胞外泌体的稳定性，贮存于-20℃，可稳定保存1个月；贮存于-80℃，不冻融情况下可稳定保存6个月。
4.本发明提供的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体或者药物组合物的用途，从多个水平和层次验证了人hUC-MSC-ES在体外心肌细胞模型和哺乳动物体内心肌I/R模型中的有效性，并通过多种先进可靠的技术检测方法，验证了该治疗的长期安全性和治疗效应，分析了可能的分子作用机制，同时还分析了该细胞衍生物在体内的动态生物学分布曲线和特征，为其临床适用性提供了重要证据支持，具备充分的创新性。该药物属于生物药物，来源于生物体本身，更为安全。
该药物提取自医疗废弃物，采集时对供者无任何损害和痛苦，而且提取和使用无伦理、法律及道德方面的限制，分离方法相对简单，含量丰富，在提取条件恒定的情况下，其ES内容物相对稳定，因而具有来源广泛、分离简便、含量丰富、稳定性好的优点。
本方案为无细胞治疗。与细胞治疗相比，能够克服全细胞移植时贮存和运输条件高、生存和分化少、具有肿瘤形成风险等局限性，具有体积小而运动便利，能靶向特定组织，无免疫原性，可重复给药，生理学更稳定，可被细胞迅速摄取，经转移生物活性分子而影响靶细胞，是适合输送的纳米微粒，同时几乎全景模拟其亲代细胞hUC-MSCs的有益作用，与hUC-MSCs治疗等效或者更高效。
本药物由于是复合成分，可能通过多种分子物质经减少凋亡、减轻心肌纤维化、促进血管生成、减轻炎症等多个途径减轻心肌I/R损伤，改善AMI的预后，具有更高效的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的培养和鉴定结果，其中图1-A为倒置相差显微镜下观察hUC-MSCs形态图，图1-B为hUC-MSCs的生长曲线，图1-C为hUC-MSCs的流式细胞术检测结果。图1-D为hUC-MSCs的成骨分化(Osteogenic inducion)与成脂分化(Adipogenic Inducion)，其中，Induced differentiation是指加入成脂/成骨诱导液的实验组，Control是指加入常规培养基的对照组。
图2为IMTP-ES的构建与鉴定，其中图2-A为LAMP2b蛋白融合缺血心肌靶向肽(IMTP)序列的示意图。2-B为慢病毒感染hUC-MSCs的荧光纤维照片。2-C为RT-PCR检测三组脐带间充质干细胞中Lamp2b和IMTP的表达水平。2-D为Western blot检测三组脐带间充质干细胞中Lamp2b和IMTP的表达水平。2-E为RT-PCR检测三组外泌体中Lamp2b和IMTP的表达水平。2-F为Western blot检测三组外泌体中Lamp2b和IMTP的表达水平。Control-MSCs：天然hUC-MSCs；Blank-MSCs：空载体慢病毒感染的hUC-MSCs；IMTP-MSCs：携带IMTP的慢病毒感染的hUC-MSCs(也称高表达IMTP的脐带间充质干细胞)。Control-ES：由天然hUC-MSCs分泌的外泌体；Blank-ES：由空载体慢病毒感染的hUC-MSCs分泌的外泌体；IMTP-ES：由携带IMTP的慢病毒感染的hUC-MSCs分泌的外泌体(也称高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体)。
图3为Control-ES、Blank-ES和IMTP-ES的鉴定结果，其中，A：透射电镜显示3种hUC-MSC-ES，Control-ES，Blank-ES和IMTP-ES的形态特征。B：基于纳米颗粒跟踪分析测量的Control-ES、Blank-ES和IMTP-ES的粒径分布。C：以天然hUC-MSCs为对照，Western blot检测3种hUC-MSCs-ES，Control-ES，Blank-ES和IMTP-ES中CD9和CD63的表达水平。
图4为通过荧光成像显示三种hUC-MSC-ES(Control-ES、Blank-ES、IMTP-ES)在正常大鼠及心肌I/R模型中的动态生物学分布。Control-ES：正常大鼠给予Control-ES；I/R+Control-ES：I/R大鼠给予Control-ES；I/R+Blank-ES：I/R大鼠给予Blank-ES；I/R+IMTP-ES：I/R大鼠给予IMTP-ES。
图5为荧光成像显示三种hUC-MSC-ES(Control-ES、Blank-ES、IMTP-ES)在正常大鼠及心肌I/R模型不同脏器内的生物学分布特征。
图6为免疫荧光显示三种hUC-MSC-ES(Control-ES、Blank-ES、IMTP-ES)在各组大鼠心脏组织不同部位中的动态分布，其中，Normal：非梗死正常区；Infarction BorderZone：梗死交界区。
图7为免疫荧光分析三种hUC-MSC-ES(Control-ES、Blank-ES、IMTP-ES)在各组大鼠不同脏器内的荧光强度。BZ：心肌梗死交界区；RZ：心肌非梗死正常区；*：P＜0.05in BZvs.RZ，**：P＜0.01in BZ vs.RZ，NS：无统计学意义)。
图8为人胚胎干细胞源性心肌细胞(hESC-CMs)给予不同hUC-MSC-ES处理后各指标变化，A为CCK-8法检测细胞活力；B为化学法检测T-SOD活性；C为化学法检测MDA水平；D为ELISA法检测各组细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平；E-F为Western blot检测Bax、cleaved-caspase3、FasL表达及其统计学分析。Control组：细胞常规培养，不进行任何处理；H/R组：仅进行低氧/复糖复氧处理；H/R+PBS：低氧/复糖复氧处理后加入PBS；H/R+ES：低氧/复糖复氧处理后分别加入三种不同hUC-MSC-ES：Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES。
图9为Fluo-3/AM荧光探针和流式术检测不同hUC-MSC-ES处理后hESC-CMs细胞中Ca2+水平，A为荧光镜下观察各组细胞中游离Ca2+分布；B为各组细胞中Ca2+荧光强度分析；C为流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度。**为P＜0.01vs.Control组；##为P＜0.01vs.H/R+PBS组；
为P＜0.01vs.H/R+Control-ES组。
图10为小管生成试验中各组小管分支节点数量、累积小管长度、小管Loops形成数的统计学分析。
图11为TUNEL染色检测各组大鼠心脏组织中的细胞凋亡情况。Sham组：假手术组；I/R组：只建立I/R模型，不给其他处理；I/R+PBS组：建立I/R模型后注射PBS；I/R组+ES：建立I/R模型后分别注射三种不同hUC-MSC-ES(Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES)。*：vs.I/R+PBS组，P＜0.05；**：vs.I/R+PBS组，P＜0.01。
图12为Western blot检测各组大鼠I/R模型再灌注24h后心肌中MCP-1、IL-1β、TNF-α的表达A.大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达；B.TNF-α、IL-1β、MCP-1表达的量化分析(**：P＜0.01vs.Sham组；##P＜0.01vs.IR+PBS组；
P＜0.01vs.I/R+Control-ES组)；Sham组：假手术组；I/R组：只建立I/R模型，不给其他处理；I/R+PBS组：建立I/R模型后注射PBS；I/R+ES组：建立I/R模型后分别注射三种不同hUC-MSC-ES(Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES)。
图13为再灌注24h后各组大鼠梗死交界区心肌组织中的氧化应激水平和炎细胞浸润情况，其中，A.通过DHE荧光探针观察各组大鼠心肌中ROS水平；B.各组ROS荧光强度的统计学分析；C.各组大鼠心肌中MDA含量；D.HE染色显示各组大鼠梗死交界区心肌组织炎细胞浸润情况；*：P＜0.05vs.Sham组；**：P＜0.01vs.Sham组；##：P＜0.01vs.IR+PBS组；
P＜0.01vs.I/R+Control-ES组)。
图14各组大鼠术后3月梗死交界区心肌组织Masson染色分析。
图15通过超声心动图检查测量各组大鼠在术后4周及3月的左室收缩末内径(LVESD)及射血分数(EF)。***：vs.Sham，P＜0.001；###：vs.I/R+PBS，P＜0.001；+++：vs.I/R+Control-ES，P＜0.001。A-F分别为Sham组(假手术组)、I/R模型、I/R+PBS组、I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组。
图16免疫荧光分析在术后3月时各组大鼠梗死交界区心肌组织中α-SMA表达。A.显示不同处理组心肌小动脉生成的变化(400×)；B.各组心肌小动脉密度的统计学分析。结果显示Control-ES及Blank-ES治疗后心肌小动脉密度较对照组增加；IMTP-ES治疗组的小动脉生成较control-ES及blank-ES组进一步增加(蓝色为DAPI细胞核，红色为α-SMA)。
*：P＜0.05vs.Sham组；**表示P＜0.01vs.Sham组；#：P＜0.05vs.I/R+PBS组；##：P＜0.01vs.I/R+PBS组；
P＜0.05vs.I/R+Control-ES组
图17为通过全转录组芯片分析hUC-MSC-ES中的功能富集变化，显示与hUC-MSCs相比，hUC-MSC-ES中显著上调的生物过程(Biological Process)、细胞成分(CellularComponent)和分子功能(Molecular Function)(TOP 10，前10)。
图18为通过转录组芯片分析hUC-MSC-ES中信号通路富集的变化，显示与hUC-MSCs相比，hUC-MSC-ES中显著上调及下调的信号通路(TOP 15，前15)。
图19为通过转录组芯片分析hUC-MSC-ES中信号通路互作网络的变化，结果显示hUC-MSC-ES中凋亡相关通路显著减弱。(P＜0.05vs.hUC-MSCs)
图20为通过Bulk转录组测序分析hUC-MSC-ES治疗后大鼠心肌I/R模型，梗死交界区心肌组织中显著上调的信号通路(TOP 20，前20)。
图21为通过10×Genomics单细胞转录组测序分析心肌组织的总tSNE细胞降维图。A.Sham组：假手术组(n＝3)；B.I/R+PBS组：建立I/R模型后注射200μl PBS(n＝6)；C.I/R+hUC-MSC-ES组：建立I/R模型后经尾静脉注射400μg/200μl hUC-MSC-ES(n＝6)。B cell_Cd79a high：高表达CD79a的B细胞；Cd8positive T cell：CD8阳性T细胞；CM：心肌细胞；Endothelial cell：内皮细胞；Erythroid cell：红细胞；Fibroblast：成纤维细胞；Macrophage：巨噬细胞；Neutrophil：中性粒细胞；SMC：平滑肌细胞。
图22为通过单细胞转录组测序分析各组心肌组织中不同细胞成分的占比变化。A.Sham组：假手术组(n＝3)；B.I/R+PBS组：建立I/R模型后注射200μl PBS(n＝6)；C.I/R+hUC-MSC-ES组：建立I/R模型后经尾静脉注射400μg/200μl hUC-MSC-ES(n＝6)。
B cell_Cd79a high：高表达CD79a的B细胞；Cd8 positive T cell：CD8阳性T细胞；CM：心肌细胞；Endothelial cell：内皮细胞；Erythroid cell：红细胞；Fibroblast：成纤维细胞；Macrophage：巨噬细胞；Neutrophil：中性粒细胞；SMC：平滑肌细胞。
图23为单细胞转录组分析hUC-MSC-ES治疗后大鼠I/R模型心肌细胞中显著增强的生物过程(Biological Process)、细胞成分(Cellular Component)、分子功能(MolecularFunction)(TOP 20，前20)。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
实施例1
本实施例提供一种高表达IMTP的脐带间充质干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)分离人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)
在获得知情同意后，得到足月剖宫产胎儿脐带，脐带用含1％青霉素链霉素的PBS冲洗后，去除外膜、脐动静脉，得到华通胶组织，漂洗后剪碎，置于含1mg/mLI型胶原酶，65μg/mIDNaseI(脱氧核糖核酸酶I)和1×青霉素链霉素的HBSS(Hank′s平衡盐溶液)中，37℃振荡消化3h，70μm滤网过滤，收集悬液离心30min，重悬于含10％FBS的DMEM/F12完全培养液，37℃、5％CO2培养箱培养72h，每3d换液，细胞融合至80％，加入胰酶消化传代，获得天然hUC-MSCs。
(2)高表达心肌靶向肽IMTP的载体构建和慢病毒包装
1.LAMP2B基因(NM_013995.2，CDS：1233bp)的CDS区序列来自于Human，在LAMP2B信号肽后(信号肽长28aa，即第84个碱基后)插入缺血心肌靶向肽序列CSTSMLKAC(IMTP)，对应碱基序列TGTAGCACTTCAATGCTGAAAGCATGT(SEQ ID NO.3)，并在前后分别加上甘氨酸linkers，前端加GCTCGA，后端加TCCGGAGGT，最后在序列前加上Kozak序列GCCACC以提高翻译效率，得到IMTP+LAMP2B插入序列，如序列表中的SEQ ID NO.1所示。对照慢病毒表达载体的Blank+LAMP2B插入序列仅在LAMP2B的CDS区序列前加上kozac片段，如序列表中的SEQ IDNO.2所示。
根据慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(购自丰晖生物，货号BR318)的多克隆位点选择匹配的酶切位点NheI、BamHI，将序列插入慢病毒表达载体，得到pCDH-CMV-[IMTP+LAMP2B]-MCS-EF 1-GFP+puro和pCDH-CMV-[Blank+LAMP2B]-MCS-EF1-GFP+puro质粒。两段序列的合成及对应慢病毒表达载体的构建均委托通用生物(安徽)股份有限公司完成。
(3)包装与慢病毒感染hUC-MSCs
①包装：1.50mL离心管中，加8mL新鲜的完全培养基预热后擦干，置于生物安全柜中。从液氮罐中取出冻存的293T细胞(中乔新舟)，迅速置入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1-2min内使细胞悬液完全溶解。将细胞悬液快速加到上述8mL预热的新鲜培养基中，离心，1500rpm，5分钟。去掉上清，加入5mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，加入T25培养瓶。平稳放入37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养。定期观察细胞形态及汇合度，达到90％融合度时按1∶3传代，扩增细胞数量至所需细胞数。包装病毒前一天，胰酶消化细胞，1×106细胞/皿接种于10cm培养皿(NEST)。当细胞汇合度约70％左右进行细胞转染。转染细胞时，穿梭质粒pCDH-CMV-[IMTP+LAMP2B]-MCS-EF1-GFP+puro(对照：pCDH-CMV-[Blank+LAMP2B]-MCS-EF1-GFP+puro)需和包装质粒psPAX2、pMD2.0G共转染。其中穿梭质粒使用4μg，psPAX2质粒使用4μg，pMD2.0G质粒使用4μg。转染时，将以上三种质粒的混合物和10μLP3000加入200μLDMEM无血清培养基内，在另一个微型离心管内将12μLLipofectamine3000试剂(invitrogen，货号：L3000015)加入200μLDMEM无血清培养基内。然后将稀释的DNA逐滴加入稀释的转染试剂EP管中，混匀，室温静置15分钟。将质粒和转染试剂形成的混合物加入10cm培养基内293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养。分别于细胞转染48小时和72小时收集病毒上清(转染48小时收集病毒上清后需置换新鲜培养液)，以0.45μm滤器过滤，分别获得高表达IMTP的慢病毒(LV-IMTP+LAMP2B)和空载体慢病毒(LV-Blank+LAMP2B)，分装后保存于-80℃冰箱。
②慢病毒感染：取步骤(1)天然hUC-MSCs，传代至对数生长期，分别用LV-IMTP+LAMP2B、LV-Blank+LAMP2B进行感染，病毒滴度为1*108tu/ml，MOI为50，每6ml细胞液(细胞浓度为105/ml)中加入病毒液的体积为50μl，混匀后置于37℃、5％CO2条件培养。感染72h后，获得高表达IMTP的脐带间充质干细胞(IMTP-hUC-MSCs)和空载体慢病毒感染的脐带间充质干细胞(Blank-hUC-MSCs)。
实施例2
本实施例提供一种脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，具体包括以下步骤：
取传代培养的P4代脐带间充质干细胞(细胞浓度为105/ml)，悬浮于含10％FBS的DMEM/F12培养液中，37℃、5％CO2及饱和湿度中培养72h后，更换含FBS的无外泌体的培养基继续培养48h。之后收集细胞培养上清液，用0.22μm的滤膜过滤。以4℃、2000g离心30min，再以4℃、10000g离心45min以去除较大的囊泡。将上清液用0.45μm的滤膜(Millipore，美国)过滤，收集过滤液。选择超速转子，过滤液以4℃、100000g离心70min，预冷PBS重悬，再次以4℃、100000g超速离心70min。10mL PBS重悬，取上清液，即得外泌体溶液，置于-4℃备用，当天使用。
本发明中采用三组脐带间充质干细胞，天然hUC-MSCs、实施例1制备的IMTP-hUC-MSCs和Blank-hUC-MSCs分别按照上述方法制备得到三组外泌体，外泌体溶液的浓度均为2mg/ml。天然hUC-MSCs、Blank-hUC-MSCs、IMTP-hUC-MSCs的外泌体分别被命名为control-ES、Blank-ES、IMTP-ES。外泌体分装后于-80℃保存用于后续分析。
实施例3
本实施例提供了一种脐带间充质干细胞外泌体的保存液、胶体溶液以及保存方法，用于外泌体的长期贮存。其中，保存液中含20％(w/v)植物源重组人血清白蛋白(购自禾元生物，规格10g)，30g/L海藻糖，50％(v/v)甘油，3％(质量分数)四氢嘧啶和0.01mol/L磷酸盐缓冲液，保存液的pH值为7.2。制备方法：将各组分在室温下混合，搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤后备用。
胶体溶液的制备方法：将保存液置于90℃加热20min，形成胶体溶液，冷却。
保存方法：将制得的胶体溶液和脐带间充质干细胞外泌体溶液以1∶1的体积比混合后分装保存。贮存于-20℃，可稳定保存1个月；贮存于-80℃，不冻融情况下可稳定保存6个月。
实验例1
1、人脐带间充质干细胞的鉴定
将实施例1步骤(1)培养后的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)采用如下方法进行鉴定：(1)倒置相差显微镜下观察细胞形态；(2)记录生长曲线；(3)流式细胞术检测CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、HLA-DR；(4)采用茜素红染色分析和油红O染色分析分别进行成骨分化与成脂分化。
如图1为人脐带间充质干细胞的鉴定结果，从图1-A和1-B可知，细胞形态良好。从图1-C流式细胞术检测可知CD105、CD73、CD90呈阳性，CD34、CD45、HLA-DR几乎为阴性，符合hUC-MSCs的特征。从图1-D可知，在加入成脂诱导液后，在培养7天左右时hUC-MSCs内出现脂滴，14天时通过油红O染色显示细胞内有脂性液体，hUC-MSCs向脂肪细胞分化的能力被证实。在加入成骨诱导液后，hUC-MSCs在7天左右向多角形转变，14天左右出现钙结节，经茜素红染色证实hUC-MSCs被诱导分化为成骨细胞，hUC-MSCs向成骨细胞分化的能力被证实(图1-D)。
2、靶向心肌的工程化外泌体IMTP-ES的鉴别
对实施例1中的三组脐带间充质干细胞或者实施例2中的三组外泌体进行如下鉴别：(1)荧光显微镜检测脐带间充质干细胞的感染效率；(2)RT-PCR检测三组脐带间充质干细胞中Lamp2b和IMTP的表达水平；(3)Western blot检测三组脐带间充质干细胞中Lamp2b和IMTP的表达水平；(4)RT-PCR检测三组外泌体中Lamp2b和IMTP的表达水平；(5)Westernblot检测三组外泌体中Lamp2b和IMTP的表达水平。
其中RCR鉴别方法中的引物序列、PCR体系和PCR程序见表1-3所示，对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为2％。
Western Blot鉴别：蛋白质提取、定量，上样后SDS-PAGE电泳分离蛋白质。恒电流将蛋白转印至PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，回收一抗，二抗37℃孵育45min，底物化学发光试剂盒发光，显影、定影。其中一抗和二抗孵育的条件如下，采用的抗体购自ABclonal和wanleibio公司。
表1一抗孵育条件
表2二抗孵育条件
结果见图2所示，图2-A为LAMP2b蛋白融合缺血心肌靶向肽(IMTP)序列的示意图。从图2-B中可知，在IMTP-hUC-MSCs(IMTP-MSCs组)和Blank-hUC-MSCs(Blank-MSCs组)中均观察到明显的绿色荧光信号，高表达IMTP的慢病毒和空载体慢病毒对hUC-MSCs的感染效率分别为85.2％和85.8％，证实IMTP-hUC-MSCs和Blank-hUC-MSCs中，慢病毒对hUC-MSCs的成功转染。从图2-C～F中可以看出，PCR和Western Blot证明IMTP-ES组中Lamp2b+IMTP的mRNA和蛋白质表达显著高于Control-ES和Blank-ES中Lamp2b+IMTP的表达，这些结果证实成功建立了靶向心肌的工程化外泌体IMTP-ES。
对实施例1中的三组脐带间充质干细胞或者实施例2中的三组外泌体进行如下鉴别：(1)透射电镜观察三组外泌体的形态特征。(2)基于纳米颗粒跟踪分析测量的三组外泌体的粒径分布。(3)以天然hUC-MSCs为对照，Western blot检测三组外泌体中CD9和CD63的表达水平。
结果见图3所示，透射电子显微镜观察显示这些提取的hUC-MSC-ES，存在典型杯状的球形囊泡(图3A)；通过粒径分析的结果显示，来源于未感染慢病毒的hUC-MSCs的的天然外泌体(Control-ES)平均粒径为79.26±14.79nm，来源于Blank-MSCs和IMTP-MSCs的外泌体的平均粒径分别为78.44±13.23nm和75.88±14.21nm，三种外泌体的粒径分布无显著差异(图3C)；Western Blot分析表明在这三种外泌体中特异性表面标志物CD63及CD9的表达均明显高于其在亲代细胞中的表达(图3B)。靶向心肌的工程化外泌体在形态，大小及表面标志物方面与天然hUC-MSC-ES无显著差异。
实验例2
1、细胞处理与分组给药
对人胚胎干细胞源性心肌细胞和HEK293细胞建立缺氧/复氧模型：
人胚胎干细胞源性心肌细胞(hESC-CMs)取出后被置于37℃水浴锅中快速溶解以复苏细胞，150g离心3min，以10％FBS+B27的RPMI-1640培养基重悬，混匀并且接种到6孔板培养板中，置于5％CO2的培养箱内在37℃培养。人胚胎肾细胞系HEK293采用含10％FBS、1％P/S的DMEM培养基在37℃，5％CO2的培养箱内培养。培养24h后观察细胞状态并换液，PBS清洗后加入新鲜培养基培养。胰酶被加入进行细胞消化和传代。
调整细胞至对数生长期，收集细胞，细胞计数，接种于96孔培养板中，每孔的细胞个数为3×103个，每组设计5个复孔。随机分为如下六组，Control组：细胞常规培养，不进行任何处理；H/R组：仅进行低氧/复糖复氧处理，不加入外泌体或PBS，当细胞的融合度达到70％时，将培养基更换为对应的无葡萄糖培养基，并将细胞置于低氧(5％CO2、95％N2)培养箱中培养，低糖低氧4h后更换完全培养基复糖复氧培养6h；H/R+PBS组：当细胞的融合度达到70％时，将培养基更换为对应的无葡萄糖培养基，并将细胞置于低氧(5％CO2、95％N2)培养箱中培养，低糖低氧4h后更换完全培养基，每孔分别加入50μl PBS，复糖复氧并共培养6h；H/R+ES组：当细胞的融合度达到70％时，将培养基更换为对应的无葡萄糖培养基，并将细胞置于低氧(5％CO2、95％N2)培养箱中培养，低糖低氧4h后更换完全培养基，每孔分别加入100μg实施例2获得的三种不同外泌体，即Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES，复糖复氧并共培养6h。
2、测试方法
(1)CCK-8法检测细胞活力
表3所用主要仪器
表4主要试剂及其生产公司
CCK-8检测：各组细胞分别弃去上清，每孔分别加入100μl的完全培养基；每孔加入10μl的CCK-8溶液，在37℃，5％CO2的培养箱内培养1h；将96孔板取出，酶标仪上检测各孔在450nm处OD值，进行数据分析。
(2)化学法检测T-SOD活性、MDA水平
表5 SOD检测主要试剂及其生产公司
SOD检测：采用上述检测试剂盒说明书给出的方法测定各组细胞上清液中的SOD含量，设定测试管和对照管，测试管加0.2ml样品，对照管加等量双蒸水，与相应试剂用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温气浴40分钟，加入显色剂2ml，混匀，室温放置10min，于波长550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色。SOD活力(U/mgprot)＝((对照OD值-测定OD值)/对照OD值)/50％×(反应液总体积(ml)/取样量(ml))/待测样本蛋白浓度(mgprot/ml)。
表6 MDA检测主要试剂及其生产公司
MDA检测：采用上述检测试剂盒说明书给出的方法测定各组细胞上清液中MDA含量，设定标准管、空白管、测定管、对照管，加入样本和试剂，漩涡混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃沸水浴40min。取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10分钟。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测吸光度。MDA含量(nmol/mgprot)＝((测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值))×标准管浓度(10nmol/ml)/待测匀浆蛋白浓度(mgprot/ml)。
(3)ELISA法检测各组细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-10水平
表7主要试剂及其生产公司
ELISA法检测：采用上述检测试剂盒说明书给出的方法测定各组上清液中的TNF-α、IL-1β、IL-10水平，对TNF-α、IL-6、IL-1β标准品、捕捉抗体、HRP-Streptavidin、TMB显色液、10×包被液进行稀释，与相应包被抗体在4℃包被过夜。取稀释后的标准品各100μl，依次加入96孔板一排7个孔中，空白孔加入1×PBST，37℃温育2h。甩掉孔内的液体，勿洗，加入稀释后的捕捉抗体100μl，37℃反应1h。用300μl PBST洗涤液洗3次，每次浸泡2min。加入稀释后的HRP-Streptavidin 100μl，37℃反应30min。用300μl PBST洗涤液洗5次，每次浸泡2min。每孔加入100μl TMB显色液37℃反应15min加入TMB终止液D 50μl终止反应，酶标仪450nm读取吸光值。以标品浓度(pg/ml)为纵坐标，对应OD为横坐标，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
(4)Western blot检测Bax、cleaved-caspase3、FasL表达
Western Blot检测：蛋白质提取、定量，上样后SDS-PAGE电泳分离蛋白质。恒电流将蛋白转印至PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，回收一抗，二抗37℃孵育45min，底物化学发光试剂盒发光，显影、定影。其中一抗和二抗孵育的条件如下，采用的抗体购自ABclonal和wanleibio公司。
表8一抗孵育条件
表9二抗孵育条件
(5)流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平
表10试剂盒
流式细胞仪检测细胞凋亡：采用上述检测试剂盒说明书给出的方法，分别取各组细胞1000rpm离心5min后，用PBS洗涤两次。加入500μl Binding Buffer重悬细胞，加入5μlAnnexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀。室温避光孵育15min，随即进行流式检测。
(6)Fluo-3/AM荧光探针染色，共聚焦显微镜观察各组细胞中的游离Ca2+([Ca2+]i)
共聚焦显微镜观察细胞钙离子：分别取各组细胞1000rpm离心5min后，小心吸除上清，用PBS洗涤细胞两次，加入稀释好的Fluo-3 AM染色液，混匀后37℃培养箱培养1h。离心后用PBS洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察。
表11主要试剂及其生产公司
(7)Fluo-3/AM荧光探针染色，流式细胞术检测各组细胞内的[Ca2+]i浓度
流式细胞仪检测细胞钙离子：取各组细胞1000rpm离心5min后，小心吸除上清，用PBS洗涤细胞两次，加入稀释好的Fluo-3 AM染色液，混匀后37℃培养箱培养1h。离心后用PBS洗3次，随即进行流式检测。
3、测试结果
结果见图8所示，与H/R组和H/R+PBS组相比，三组hUC-MSC-ES处理组心肌细胞生存明显增加，细胞中T-SOD活性增强，MDA水平下降，凋亡减少，凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3、FasL表达减少(p均小于0.05)。三组hUC-MSC-ES处理组比较，与H/R+Control-ES组和H/R+Blank-ES组相比，H/R+IMTP-ES组心肌细胞生存明显增加，细胞中T-SOD活性增强，MDA水平明显下降，凋亡明显减少，凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3、FasL表达明显减少(p均小于0.05)，ELISA检测表明hUC-MSC-ES处理组心肌细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显减少(p均小于0.05)。三组hUC-MSC-ES处理组比较，与H/R+Control-ES组和H/R+Blank-ES组相比，H/R+IMTP-ES组心肌细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显减少(p均小于0.05)。
图9所示，Fluo-3/AM荧光探针染色及共聚焦显微镜显示hUC-MSC-ES处理组心肌细胞内较H/R组和H/R+PBS组的游离Ca2+明显减少，流式细胞分析显示三组hUC-MSC-ES处理组心肌细胞内游离Ca2+浓度降低。相比于H/R+PBS组，H/R+Control-ES组、H/R+Blank-ES组以及H/R+IMTP-ES组的游离Ca2+浓度降低率分别为40.4％，41.0％和73.7％。
三组hUC-MSC-ES处理组比较，与H/R+Control-ES组和H/R+Blank-ES组相比，H/R+IMTP-ES组心肌细胞内游离Ca2+浓度明显降低。
实验例3小管生成试验
1、细胞处理与分组给药
HUVEC细胞用含5％胎牛血清、1％内皮细胞培养添加剂的内皮细胞培养基于37℃，5％CO2的培养箱内培养。
表12主要试剂及其生产公司
细胞成管培养：Matrigel胶4℃过夜解冻，冰上操作，吸取Matrigel胶至96孔培养板，每孔50μl，置37℃培养箱中孵育1h，使其凝固。收集HUVEC细胞，以5×104的密度接种到预铺有基质胶的24孔板中，按如下分组分别添加PBS或实施例2获得的三种外泌体。将24孔板置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中分别培养4、6、12h后，在倒置相差显微镜下观察拍照。利用图像分析软件计数小管分支节点数量、测量各组累积小管长度、小管Loops形成数。
实验分组：
A.HUVEC+PBS组；
B.HUVEC+50μg/mL Control-ES组；
C.HUVEC+50μg/mL Blank-ES组；
D.HUVEC+50μg/mL IMTP-ES组。
2、实验结果
如图10所示，小管生成实验结果显示hUC-MSC-ES处理明显增加了HUVEC细胞的小管生成数量、长度及小管Loops形成数量，证实了体外hUC-MSC-ES能够减轻缺氧/复氧心肌细胞的氧化应激和凋亡，增加生存，减轻钙超载，促进血管生成。
实验例4
1、实验方法
大鼠(SD大鼠，雄性，8-10周，250-300g)，共18只，随机分为I/R模型、Sham组(假手术组)、I/R+PBS组、I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组，每组3只，除了假手术组之外，各组均通过前降支结扎法建立大鼠心肌I/R模型，具体方法为：雄性SD大鼠适应性饲养1周，麻醉后仰卧于37+3℃的加热垫上。打开小动物呼吸机，设置呼吸频率为60-70次/min，大鼠进行气管插管后连接小动物呼吸机辅助呼吸。打开左胸暴露第三肋间隙的心脏，心包被分离，心脏被挤出。然后，左冠状动脉前降支被6-0缝合线结扎，宽度和深度均为2mm左右。待结扎区域下方颜色变白且心电图(ECG)上显示心前导联ST段抬高，表明左冠状动脉前降支结扎成功。缺血30min后，移除缝合线开始再灌注，建立I/R模型。
建立I/R模型后I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组分别尾静脉注射三种实施例2获得的外泌体(Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES)，注射次数为1次，注射剂量均为400μg/200μL。I/R+PBS组：建立I/R模型后尾静脉注射等体积PBS溶液，浓度0.01M，pH值7.3。I/R组不进行处理。而假手术组只挂线不结扎。
上述处理24h后，按大鼠体重，用2％戊巴比妥钠(0.25ml/100g)进行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，向左心室内注射1％肝素钠0.2ml后经左心室行主动脉插管，血管钳固定后剪开右心耳，先以生理盐水150ml快速冲洗血管，然后用4％多聚甲醛的0.01mol/LPBS(4℃，pH值7.40)250ml灌注固定，先快后慢，共需时间为50min，之后取心肌梗死交界区心脏组织，置4％多聚甲醛固定液后固定，在4℃冰箱内保存。多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。
2、测试方法
(1)Western Blot检测MCP-1、IL-1β、TNF-α的表达
取各组大鼠的心肌梗死交界区心脏组织，按重量(g)∶体积(ml)＝1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500rpm离心10min，取上清液进行测定。采用下述各抗体，经过一抗孵育，回收一抗，二抗孵育，显影，检测MCP-1、IL-1β、TNF-α的表达。
表13一抗孵育条件
表14二抗孵育条件
(2)氧化应激水平和炎细胞浸润情况
主要试剂及其生产公司
DHE染色：按照DHE试剂盒中说明书公开的方法进行检测，具体为：将心肌梗死交界区心脏组织置于样本托上，使用OCT包埋剂包埋样本，置于冷冻切片机上预冷。调整切片厚度，将组织切成10μm的薄片，将组织展平后，使用载玻片将组织轻轻迅速吸附于载玻片上。晾干后于-70℃冰箱中保存。取出切片，晾干后，用蒸馏水浸洗3次，每次5min。取出切片架，滴加DHE试剂，按1∶100稀释，37℃避光孵育30min。取出切片，摆放在切片架上，浸泡在PBS中3次，每次5min。依次取出切片，擦干周围液体，胶头滴管滴加半滴抗荧光淬灭剂，盖玻片封片。荧光显微镜下观察染色效果，镜下拍照。
(3)HE染色观察组织形态学变化
表15主要试剂及其生产公司
HE染色：制作各组大鼠心肌梗死交界区心脏组织的石蜡切片，依次将石蜡切片放入二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-95％酒精5min-95％酒精2min-85％酒精2min-75％酒精2min-蒸馏水洗。切片入苏木素染5min，蒸馏水浸泡5min，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水流水冲20min，蒸馏水浸泡2min。切片入伊红染液中染色3min。将切片依次放入75％酒精2min-85％酒精2min-95％酒精2min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-二甲苯0min-二甲苯10min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
(4)TUNEL染色检测各组大鼠心脏组织中的细胞凋亡情况
表16主要试剂及其生产公司
TUNEL染色：制作各组大鼠心肌梗死交界区心脏组织的石蜡切片，依次将石蜡切片放入二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-95％酒精5min-95％酒精2min-85％酒精2min-75％酒精2min-蒸馏水2min-PBS 5min。滴加0.1％Triton X-100(0.1％柠檬酸钠盐配置)50μl，室温放置8min，PBS漂洗3次，每次5min。擦干标本周围，滴加TUNEL反应液(Enzyme solution及Label Solution按1∶9配制)50μl，保湿、避光、37℃孵育60min，PBS漂洗3次，每次5min。取出切片，滴加DAPI至完全覆盖组织，避光复染5min。PBS漂洗3次，每次5min。取出切片，滴加荧光淬灭剂封片。显微镜下观察染色效果，并拍照。
(5)免疫荧光单染检测各组大鼠心脏组织中TNF-α、CD206的表达，观察巨噬细胞M1、M2型极化情况
免疫荧光单染：制作各组大鼠心肌梗死交界区心脏组织的石蜡切片，依次将石蜡切片60℃烘箱中烤片30min-二甲苯I15min-二甲苯II15min-95％酒精1min-85％酒精1min-75％酒精1min，PBS漂洗3次，每次5min。置于抗原修复液中，高温低火修复10min，PBS漂洗3次，每次5min。吸干切片，滴加1％BSA至完全覆盖组织，湿盒内室温15min。一抗用PBS按1∶100稀释，滴加至完全覆盖组织，湿盒内4℃过夜，PBS漂洗3次，每次5min。滴加荧光二抗，用PBS1∶200稀释(以下操作注意避光)，滴加至完全覆盖组织，室温孵育60min，PBS漂洗3次，每次5min。擦干周围液体，滴加DAPI至完全覆盖组织以复染核，PBS漂洗3次，每次5min。擦干周围液体，滴加抗荧光淬灭剂，盖玻片封片。荧光显微镜下观察染色效果。镜下拍照。
表17主要试剂及其生产公司
(6)MDA检测
MDA检测：取各组心肌梗死交界区心脏组织，设定标准管、空白管、测定管、对照管，加入样本和试剂，漩涡混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃沸水浴40min。取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10分钟。取上清，532nn处，1cm光径，蒸馏水调零，测吸光度。MDA含量(nmol/mgprot)＝((测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值))×标准管浓度(10nmol/ml)/待测匀浆蛋白浓度(mgprot/ml)。
3、测试结果
再灌注24h后hUC-MSC-ES治疗组心肌细胞凋亡明显减少(P＜0.05，图11)。
相比于I/R+PBS组，Western Blot检测显示hUC-MSC-ES处理组TNF-α、IL-1β、MCP-1表达明显减少(P＜0.01，图12)。DHE荧光探针染色显示hUC-MSC-ES处理组ROS明显减少(P＜0.01)，MDA水平明显减低(P＜0.01)，HE染色分析表明hUC-MSC-ES组炎细胞浸润情况减轻(图13)。这些结果提示在体内静脉应用hUC-MSC-ES减轻大鼠I/R模型的心肌氧化应激损伤，减轻炎症，减少凋亡。
其中，相比于I/R+Control-ES组，I/R+IMTP-ES组TNF-α、IL-1β、MCP-1表达明显减少(P＜0.01)，ROS明显减少(P＜0.01)，MDA水平明显减低(P＜0.01)，炎细胞浸润情况明显减轻，说明I/R+IMTP-ES组能够明显增强改善大鼠I/R模型的心肌氧化应激损伤、减轻炎症和减少凋亡的程度。
实验例5
1、实验方法
大鼠(SD大鼠，雄性，8-10周，250-300g)，共18只，随机分为I/R模型、Sham组(假手术组)、I/R+PBS组、I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组，每组3只，除了假手术组之外，各组均通过前降支结扎法建立大鼠心肌I/R模型，具体方法为：雄性SD大鼠适应性饲养1周，麻醉后仰卧于37±3℃的加热垫上。打开小动物呼吸机，设置呼吸频率为65次/min，大鼠进行气管插管后连接小动物呼吸机辅助呼吸。打开左胸暴露第三肋间隙的心脏，心包被分离，心脏被挤出。然后，左冠状动脉前降支被6-0缝合线结扎，宽度和深度均为2mm左右。待结扎区域下方颜色变白且心电图(ECG)上显示心前导联ST段抬高，表明左冠状动脉前降支结扎成功。缺血30min后，移除缝合线开始再灌注，建立I/R模型。而假手术组只挂线不结扎。术后3d、5d、14d、28d重复上述注射处理。
建立I/R模型后I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组分别尾静脉注射三种实施例2获得的外泌体(Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES)，注射次数为1次，注射剂量均为400μg/200μL。I/R+PBS组：建立I/R模型后尾静脉注射等体积PBS溶液，浓度0.01M，pH值7.3。上述四组术后3d、5d、14d、28d重复上述注射处理。I/R组不进行处理。
上述处理24h后，按大鼠体重，用2％戊巴比妥钠(0.25ml/100g)进行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，向左心室内注射1％肝素钠0.2ml后经左心室行主动脉插管，血管钳固定后剪开右心耳，先以生理盐水150ml快速冲洗血管，然后用4％多聚甲醛的0.01mol/LPBS(4℃，pH值7.40)250ml灌注固定，先快后慢，共需时间为50min，之后取心肌梗死交界区心脏组织，置4％多聚甲醛固定液后固定，在4℃冰箱内保存。多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。
2、测试方法
(1)HE染色和Masson染色分析
表18主要试剂及其生产公司
HE染色：制作各组大鼠心肌梗死交界区心脏组织的石蜡切片，依次将石蜡切片放入二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-95％酒精5min-95％酒精2min-85％酒精2min-75％酒精2min-蒸馏水洗。切片入苏木素染5min，蒸馏水浸泡5min，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水流水冲20min，蒸馏水浸泡2min。切片入伊红染液中染色3min。将切片依次放入75％酒精2min-85％酒精2min-95％酒精2min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-二甲苯0min-二甲苯10min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。
Masson染色：心肌组织石蜡切片常规脱蜡，按Masson染色试剂盒(南京森贝伽生物)配制染色液，切片染色10min，酸性乙醇分化水洗，氨水溶液返蓝水洗，丽春红品红染色液染色10min，乙酸、磷钼酸、乙酸溶液各洗1min，苯胺蓝染色2min，乙醇脱水，二甲苯处理3min后中性树脂封片，镜下观察各组纤维化情况。通过Image J图像软件分析梗死面积。
(2)超声心动图
于术后4周、3个月时进行超声心动图检查，检测各组大鼠左室舒张末径(LVEDD)、左室收缩末径(LVESD)、左室缩短分数(FS)、射血分数(EF)、舒张期室间隔厚度(IVSd)、舒张期左心室后壁厚度(LVPWd)、左心室质量(LVmass)。
(3)心肌组织中α-SMA表达和FITC-Isolectin B4(BS-I)表达
表19主要试剂及其生产公司
免疫荧光染色：细胞爬片以4％多聚甲醛4℃固定过夜，TBS冲洗，3％H2O2室温孵育20min，TBS冲洗后滴加羊血清封闭液封闭30min，TBS洗后加入α-SMA单抗为一抗，4℃孵育过夜，TBS洗3次，加入Cy3标记山羊抗兔IgG为二抗，37℃孵育1h，TBS洗3次，DAPI染核；封固剂封片；荧光显微镜下观察、扫描、分析。
3、测试结果
(1)Masson染色分析
结果如图14所示，I/R损伤后心肌组织中的心肌细胞明显减少，胶原纤维大量增加；Control-ES处理组和Blank-ES处理组的心肌纤维化较对照组有所减轻，较I/R+PBS组分别减轻51.9％、55.3％；IMTP-ES处理组心肌纤维化较Control-ES及Blank-ES组进一步减轻了83.1％、81.9％(400×，红色为心肌纤维，蓝色为胶原纤维)。
(2)超声心动图结果
结果如图15所示，hUC-MSC-ES处理组心肌重塑明显减轻，心功能改善。
(3)心肌组织中α-SMA表达
结果如图16显示，Control-ES及Blank-ES治疗后心肌小动脉密度较对照组增加；hUC-MSC-ES组心脏梗死交界组织中α-SMA表达和FITC-Isolectin B4(BS-I)表达增加，提示单位面积心肌小动脉密度、直径和心肌毛细血管密度增加，IMTP-ES治疗组的小动脉生成较control-ES及blank-ES组进一步增加(蓝色为DAPI细胞核，红色为α-SMA)。
综上所述，hUC-MSC-ES处理组心室重塑明显减轻，心功能改善；免疫荧光显示术后3个月hUC-MSC-ES组心脏梗死交界组织中α-SMA表达和FITC-Isolectin B4(BS-I)表达增加，提示单位面积心肌小动脉密度、直径和心肌毛细血管密度增加；Masson染色表明治疗组心肌纤维化程度减轻，梗死面积减少；HE染色显示hUC-MSC-ES治疗组大鼠心脏、肝脏、肺、脾脏、全脑、肾脏、大肠、股四头肌等主要脏器均未观察到大体肿瘤和镜下异型细胞形成。这些结果提示hUC-MSC-ES治疗I/R损伤，能够减轻心室重塑、减小梗死面积、改善心功能，促进新生血管生成，减轻心肌纤维化和心梗后心衰，且未增加肿瘤形成风险，具备长期有效性和安全性。
实验例6动态生物学分布变化
1、实验方法
大鼠(SD大鼠，雄性，8-10周，250-300g)，共36只，随机分为Control-ES组、I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组，每组9只，除了Control-ES组之外，各组均通过前述前降支结扎法建立大鼠心肌I/R模型。
I/R模型建立后，I/R+Control-ES、I/R+Blank-ES和I/R+IMTP-ES组分别尾静脉注射三种实施例2获得的外泌体(Control-ES，Blank-ES，IMTP-ES)，注射次数为1次，注射剂量均为400μg/200μL。Control-ES组为正常大鼠注射400μg/200μL的Control-ES。注射完成后1h、24h和48h对各组小鼠以及各小鼠脏器进行荧光成像分析，并记录各脏器荧光强度。
2、测试结果
结果见图4-7所示，生理状态下天然hUC-MSC-ES进入体内后，在起初24h主要分布于肌肉、肾、肝、肺；而在I/R模型中天然hUC-MSC-ES在起初24h主要分布于肝、肾、脾、心，其在心脏中分布较正常状态下增加；经静脉注射靶向心肌的工程化hUC-MSC-ES后起初24h主要分布于肝、心、肺、肾，其在心脏中分布较I/R模型中天然hUC-MSC-ES的分布进一步增加，而在股四头肌中的分布较其他组明显减少。胃肠道ES荧光总体分布较少。免疫荧光显示control-ES组的ES荧光强度在各时间点在肝、肾、心、脾较强，其他脏器荧光较弱；I/R+control-ES组和I/R+Blank-ES组ES荧光在心脏梗死交界区(BZ)、心脏非梗死区(RZ)、肾、肝较强；I/R+IMTP-ES组ES荧光在心脏RZ、BZ、肾、肝较强。在高倍镜下心肌细胞中的hUC-MSC-ES主要位于靠近细胞核的胞质中；肝脏中ES一部分位于肝血窦内，另一部分被肝细胞和巨噬细胞吞噬；脾脏ES荧光主要分布于红髓；肾脏ES主要位于肾小囊血管球内；股四头肌中ES密集分布于细胞核周围的细胞浆中；肠道ES主要分布在上皮层和固有层；各组大鼠脑中在所有时间点几乎都没有ES荧光分布。这些结果提示，hUC-MSC-ES在机体细胞内主要位于细胞核附近的细胞质中；肝和脾可能是ES的早期分布器官，肾脏是ES较早期的主要排泄器官，胃肠道是较晚期的次要排泄器官。这些结果第一次显示了天然hUC-MSC-ES和心脏靶向hUC-MSC-ES在正常大鼠和I/R不同状态下的动态生物学分布特征，为hUC-MSC-ES应用于I/R的临床转化提供了重要的动力学数据。
实验例7治疗机制研究
通过全转录组芯片(购自中康博生物科技)分析了人hUC-MSC-ES(来源于实施例2的Control-ES)的转录组基因信息，发现了hUC-MSC-ES中的关键mRNAs、miRNAs、LncRNAs、CircRNAs及相互靶向关系、重要作用信号通路，通过生物信息学方法，结合相应数据库，建立了全局信号转导网络、信号通路互作网络和共表达调控网络。通过全转录组芯片分析了人hUC-MSC-ES的转录组基因信息。通过转录组芯片分析hUC-MSC-ES中信号通路互作网络的变化。
大鼠(SD大鼠，雄性，8-10周，250-300g)，共15只，随机分为A.Sham组：假手术组只挂线不结扎；B.I/R+PBS组：通过前述前降支结扎法建立I/R模型后注射200μL PBS，浓度0.01M，pH值7.3(n＝6)；C.I/R+hUC-MSC-ES组：通过前述前降支结扎法建立I/R模型后给予400μg/200μL hUC-MSC-ES(来源于实施例2的Control-ES)处理(n＝6)。术后2h按前述方法取大鼠心肌梗死交界区心脏组织。
通过Bulk转录组测序分析hUC-MSC-ES治疗后大鼠心肌I/R模型。梗死交界区心肌组织中显著上调的信号通路。通过10×Genomics单细胞转录组测序分析心肌组织的总tSNE细胞降维图。通过单细胞转录组测序分析各组心肌组织中不同细胞成分的占比变化。单细胞转录组分析hUC-MSC-ES治疗后大鼠I/R模型心肌细胞中显著增强的生物过程(Biological Process)、细胞成分(Cellular Component)、分子功能(MolecularFunction)。
参考文献如下Cell.2018 Nov 29；175(6)：1665-1678.e18.Nat Commun.2018 Apr24；9(1)：1614.Lancet Oncol.2018 Mar；19(3)：382-393.
结果显示，与hUC-MSCs相比，hUC-MSC-ES中显著上调的生物过程(BiologicalProcess)、细胞成分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)如图17所示。hUC-MSC-ES中显著上调的生物过程前五名包括骨矿化的正向调节、心肌舒张、中性粒细胞趋化性、中性粒细胞聚集、白细胞迁移参与炎症反应，显著上调的分子功能前五名包括鸟苷酸环化酶活性、钙离子结合、过氧化物酶活性、Toll样受体4结合、氧气结合。
如图18和19所示，hUC-MSC-ES中凋亡通路和凋亡相关P53通路、MAPK通路均显著减弱。
如图20所示，梗死交界区心肌组织中显著上调的信号通路前三名包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、丙酸盐代谢、柠檬酸循环(TCA循环)，显著上调的生物过程TOP3包括脂肪酸β-氧化、三羧酸循环、2-酮戊二酸代谢过程，显著上调的分子功能前三名包括电子载流子活性、丙酮酸脱氢酶(NAD+)活性、磷酸吡哆醛结合。
如图21-23以及下表所示，正常心肌组织共由9种细胞22个亚群组成，包括心肌细胞(1个亚群)、巨噬细胞(5个亚群)、内皮细胞(5个亚群)、成纤维细胞(4个亚群)、平滑肌细胞(3个亚群)、B细胞(1个亚群)、T细胞(1个亚群)、中性粒细胞(1个亚群)、红细胞(1个亚群)。I/R损伤后内皮细胞、心脏成纤维细胞(CFbs)和炎细胞数量明显变化，内皮细胞变化最显著，在I/R后明显减少，CFbs、巨噬细胞和中性粒细胞均明显增加，而hUC-MSC-ES治疗在一定程度上减轻了这些变化。深入分析发现，hUC-MSC-ES处理组心肌细胞中Acadl、IDH、Dlst、PINK1等基因显著增加，强烈提示hUC-MSC-ES可能通过增强脂肪酸β氧化、改善线粒体自噬，而翻转I/R后心肌细胞的能量代谢状态、促进心肌修复。我们还发现，hUC-MSC-ES处理后心肌中MAPK和p38MAPK表达均减弱，IL1R2和TLR4表达也减少，这些结果提示hUC-MSC-ES通过MAPK途径减少凋亡、改善纤维化，并可通过趋化因子途径减轻炎症反应，而减轻心肌再灌注损伤、改善预后。
表19
| Cell Name | A | B1 | B2 | C1 | C2 |
| B cell_Cd79a high(Adult-Heart) | 0.29 | 0.51 | 0.33 | 0.73 | 0.60 |
| Cd8 positive T cell | 2.17 | 2.41 | 1.68 | 2.80 | 2.30 |
| CM | 0.38 | 0.28 | 0.21 | 0.56 | 0.17 |
| Endothelial cell | 81.20 | 39.96 | 41.15 | 59.69 | 42.53 |
| Erythroid cell(Adult-Heart) | 1.08 | 0.20 | 0.42 | 1.70 | 0.56 |
| Fibroblast | 7.25 | 23.00 | 9.29 | 15.40 | 3.08 |
| Macrophage | 0.71 | 23.59 | 33.25 | 9.31 | 41.08 |
| Neutrophil(Adult-Heart) | 1.38 | 0.62 | 8.16 | 0.45 | 4.93 |
| SMC | 5.54 | 9.44 | 5.51 | 9.36 | 4.75 |
Cell Name：细胞名称；B cell_Cd79a high(Adult-Heart)：Cd79a高表达B细胞(成人心脏)；Cd8 positive T cell：Cd8阳性T细胞；CM：心肌细胞；Endothelial cell：内皮细胞；Erythroid cell(Adult-Heart)：红细胞(成人心脏)；Fibroblast：成纤维细胞；Macrophage：巨噬细胞；Neutrophil(Adult-Heart)：中性粒细胞(成人心脏)；SMC：平滑肌细胞。
实验例8保存稳定性
按照实施例2制备外泌体(control-ES)，均分为4份，分为PBS组和保存液组，每组2份，PBS组按照体积比为1∶1将外泌体溶液与PBS溶液混合，保存液组按照体积比为1∶1将外泌体溶液与实施例3制备的胶体溶液混合。分别于贮存于-20℃和-80℃，分别于1月(-20℃)和6月时(-80℃)通过Western Blot检测各组CD63表达(检测方法同实验例1)。结果显示1月时，保存液组CD63表达较PBS组增加19.5％(p＜0.05)，6月时较PBS组增加26.7％(p＜0.05)，说明保存液加入使得外泌体更为稳定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (13)
1.一种高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括，在慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-puro中插入SEQ ID No：1所示的双链片段，得到重组载体，采用重组载体与包装系统共同转染宿主细胞后得到慢病毒颗粒，用慢病毒颗粒感染脐带间充质干细胞，获得高表达IMTP的脐带间充质干细胞，获得细胞培养液，制成高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述获得细胞培养液的过程包括如下步骤：
取传代培养后的高表达IMTP的脐带间充质干细胞，悬浮于无外泌体血清培养基中继续培养至融合度为80％-95％时收取上清液，提取外泌体。
3.一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取传代培养后的脐带间充质干细胞，悬浮于无外泌体血清培养基中继续培养至融合度为80％-95％时收取上清液，提取外泌体。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述提取外泌体的方法包括，将上清液在2000g-3000g下离心，再以8000-10000g下离心，取上清液过滤，滤液在100000g下离心去除液体，取沉淀物重悬于缓冲液中，得到脐带间充质干细胞外泌体溶液或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体溶液，加入或者不加入胶体溶液，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胶体溶液通过保存液加热后制得，所述保存液中含10-30％(w/v)植物源重组人血清白蛋白、20-40g/L海藻糖、30-50％甘油、2-4％四氢嘧啶和0.01-0.02mol/L磷酸盐缓冲液；优选的，胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液或者与高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体溶液的体积比为1-1.5∶1-1.5，优选的，所述保存液的pH值为7.0-7.5。
6.一种权利要求1-5中任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-5中任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体，还包括任选的药学上可接受的辅料。
8.一种脐带间充质干细胞外泌体或者权利要求1-5中任一所述的制备方法制得的脐带间充质干细胞外泌体或者高表达IMTP的脐带间充质干细胞外泌体或者权利要求6所述的药物组合物具有如下的(1)-(5)项中的至少一项用途：
(1)在制备预防或者治疗或者减轻心肌缺血再灌注损伤及其相关疾病的药物中的用途；
(2)在制备减轻炎症和/或减少心肌细胞凋亡的药物中的用途；
(3)在制备减轻钙超载和/或促进血管生成的药物中的用途；
(4)在制备减轻心肌细胞氧化应激损伤的药物中的用途；
(5)在制备减小梗死面积、改善心功能、减轻心肌纤维化中的至少一种的药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述相关疾病包括由心肌缺血再灌注损伤引起的炎症、心律失常、心室重塑、心肌纤维化、心梗后心衰中的一种或者多种。
10.一种脐带间充质干细胞外泌体的保存液，其特征在于，所述保存液中含10-30％(w/v)植物源重组人血清白蛋白、20-40g/L海藻糖、30-50％甘油、2-4％四氢嘧啶和0.01-0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
11.根据权利要求10所述的脐带间充质干细胞外泌体的保存液，其特征在于，所述保存液的pH值为7.0-7.5。
12.一种用于保存脐带间充质干细胞外泌体的胶体溶液，其特征在于，将权利要求10或11所述的保存液加热后制得，优选的，加热温度为80-95℃，时间为10-30min。
13.一种脐带间充质干细胞外泌体的保存方法，其特征在于，取权利要求12所述的胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液混合保存，优选的，胶体溶液与脐带间充质干细胞外泌体溶液的体积比为1-1.5∶1-1.5，优选的，保存温度为不高于-4℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310227074.8A CN116286664A (zh) | 2023-03-10 | 2023-03-10 | 一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310227074.8A CN116286664A (zh) | 2023-03-10 | 2023-03-10 | 一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286664A true CN116286664A (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=86835558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310227074.8A Pending CN116286664A (zh) | 2023-03-10 | 2023-03-10 | 一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286664A (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150125950A1 (en) * | 2012-05-18 | 2015-05-07 | Agency For Science, Technology And Research (A*Sta (A*Star) | Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes |
| CN111471650A (zh) * | 2020-04-14 | 2020-07-31 | 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用 |
| WO2020251347A1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Ming Medical Sdn Bhd | A method of preparing exosomes from mesenchymal stem cells |
| CN112352047A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-02-09 | 江苏大学 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用 |
| WO2021207025A1 (en) * | 2020-04-06 | 2021-10-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc | Mesenchymal cell (msc) exosomes increase t cell differentiation towards t regulatory cells |
| CN113558042A (zh) * | 2021-07-02 | 2021-10-29 | 普纳思细胞(厦门)生物科技有限公司 | 一种外泌体的保存方法 |
| CN114250196A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | 深圳贝蒂斯生物科技有限公司 | 一种外泌体扩增及保存方法 |
| CN114984049A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-09-02 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 人脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途 |
| US20220287967A1 (en) * | 2019-04-18 | 2022-09-15 | The Regents Of The University Of California | Exosome mimicking nanovesicles making and biological use |
| CN115537389A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-12-30 | 博雅干细胞科技有限公司 | 具有炎症调控功能的脐带间充质干细胞源外泌体的制法 |
-
2023
- 2023-03-10 CN CN202310227074.8A patent/CN116286664A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150125950A1 (en) * | 2012-05-18 | 2015-05-07 | Agency For Science, Technology And Research (A*Sta (A*Star) | Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes |
| US20220287967A1 (en) * | 2019-04-18 | 2022-09-15 | The Regents Of The University Of California | Exosome mimicking nanovesicles making and biological use |
| WO2020251347A1 (en) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | Ming Medical Sdn Bhd | A method of preparing exosomes from mesenchymal stem cells |
| WO2021207025A1 (en) * | 2020-04-06 | 2021-10-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc | Mesenchymal cell (msc) exosomes increase t cell differentiation towards t regulatory cells |
| CN111471650A (zh) * | 2020-04-14 | 2020-07-31 | 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用 |
| CN112352047A (zh) * | 2020-09-08 | 2021-02-09 | 江苏大学 | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法及应用 |
| CN113558042A (zh) * | 2021-07-02 | 2021-10-29 | 普纳思细胞(厦门)生物科技有限公司 | 一种外泌体的保存方法 |
| CN114250196A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-29 | 深圳贝蒂斯生物科技有限公司 | 一种外泌体扩增及保存方法 |
| CN114984049A (zh) * | 2022-05-23 | 2022-09-02 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 人脐带间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗急性肾损伤的药物中的用途 |
| CN115537389A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-12-30 | 博雅干细胞科技有限公司 | 具有炎症调控功能的脐带间充质干细胞源外泌体的制法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王旭: "靶向性骨髓间充质干细胞外泌体治疗小鼠心梗的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》, 15 January 2019 (2019-01-15), pages 49 - 62 * |
| 王朝瑾、张饮江: "《水产生物流通与加工贮藏技术》", 30 November 2007, 上海科学技术出版社, pages: 71 - 72 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Xu et al. | Exosomes derived from adipose tissue, bone marrow, and umbilical cord blood for cardioprotection after myocardial infarction | |
| Sun et al. | HIF-1α overexpression in mesenchymal stem cell-derived exosomes mediates cardioprotection in myocardial infarction by enhanced angiogenesis | |
| Zhao et al. | Irisin promotes cardiac progenitor cell‐induced myocardial repair and functional improvement in infarcted heart | |
| Toma et al. | Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart | |
| ES2373551T3 (es) | Métodos para usar células derivadas de tejido adiposo en el tratamiento de afecciones cardiovasculares. | |
| Bollini et al. | In vitro and in vivo cardiomyogenic differentiation of amniotic fluid stem cells | |
| CN104582711B (zh) | 诱导心肌梗塞的修复再生的多能性干细胞 | |
| US20200016210A1 (en) | Methods of Reducing Teratoma Formation During Allogeneic Stem Cell Therapy | |
| US20210169812A1 (en) | Purified exosome products, method of making, and methods of using | |
| Khan et al. | Skeletal myoblasts transplanted in the ischemic myocardium enhance in situ oxygenation and recovery of contractile function | |
| KR20190128622A (ko) | 주산기 조직 유래된 중간엽 줄기 세포: 그의 제조 방법 및 용도 | |
| Adas et al. | Treatment of ischemic colonic anastomoses with systemic transplanted bone marrow derived mesenchymal stem cells. | |
| Wang et al. | Preparation of high bioactivity multilayered bone-marrow mesenchymal stem cell sheets for myocardial infarction using a 3D-dynamic system | |
| CN110013544B (zh) | 小分子组合在制备治疗慢性肝损伤的药物中的应用 | |
| Liu et al. | The functional study of human umbilical cord mesenchymal stem cells harbouring angiotensin‐converting enzyme 2 in rat acute lung ischemia‐reperfusion injury model | |
| CN110193025A (zh) | 人脂肪干细胞来源的外泌体冻干粉及其制备方法和应用 | |
| CN113559273B (zh) | 一种静脉注射用成体干细胞的预处理方法、成体干细胞注射液及应用 | |
| Xu et al. | Implantation of BM cells transfected with phVEGF 165 enhances functional improvement of the infarcted heart | |
| Li et al. | Deciphering the Heterogeneity Landscape of Mesenchymal Stem/Stromal Cell‐Derived Extracellular Vesicles for Precise Selection in Translational Medicine | |
| CN116286664A (zh) | 一种脐带间充质干细胞外泌体的用途 | |
| CN112566646A (zh) | 用于治疗组织坏死或改善心脏功能的药物 | |
| CN105396136B (zh) | CCN1（Cyr61）在治疗皮肤损伤及皮肤萎缩相关疾病中的应用 | |
| CN107970435B (zh) | 联合诱导内源Lgr5+肝脏干细胞增多的方法及应用 | |
| CN113616677A (zh) | 抑制细胞因子风暴的方法及组合物 | |
| CN117165520B (zh) | 间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |