KR20190128622A

KR20190128622A - 주산기 조직 유래된 중간엽 줄기 세포: 그의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20190128622A
Application number: KR1020197019932A
Authority: KR
Inventors: 종차오 한; 지보 한; 타오 왕
Original assignee: 헬스 앤드 바이오테크 프랑스 (에이치 앤드 비 프랑스)
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-11-18
Also published as: WO2018108859A1; CA3046576A1; RU2019118712A3; KR102590455B1; US20200009193A1; JP2020503375A; JP7275441B2; ES2927461T3; EP3551748B1; CN110352240A; EP3551748A1; RU2019118712A; PT3551748T

Abstract

본 발명은 태반 조직 유래 CD106^고CD151 +네스틴+ 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 제법을 개시한다. 제1 측면에서, 본 발명은 이들 세포를 산업적 규모로 제조하는 특정 방법 및 그것에 의하여 생성된 세포 집단에 관한 것이다. 제2 측면에서, 본 발명은 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM-1) 마커를 발현하는 태반　CD106^고CD151 +네스틴+ MSC를 함유하는, 상기 특정 방법에 의해 수득된 세포 배양물에 관한 것이다. 본 출원은 상기 태반 CD106^고CD151 +네스틴+ MSC가 시험관내 및 생체내에서 혈관형성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 본원에 제시된 결과는 상기 태반 CD106^고CD151 +네스틴+ MSC를 허혈성 질환 또는 순환계의 장애를 앓고 있는 개체에게 투여하는 것이 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 검출 가능한 개선을 결과함을 또한 나타낸다. 따라서, 제3 측면에서, 본 발명은 허혈성 질환, 순환계의 장애, 면역 질환, 장기 손상 또는 장기 기능 부전을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 태반　CD106^고 CD151 +네스틴+ MSC에 관한 것이다.

Description

주산기 조직 유래된 중간엽 줄기 세포: 그의 제조 방법 및 용도

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 재생 의학 및 조직 공학에서 유용한 것으로 공지되어 있다. 성인에서, 골수, 지방 조직, 치수, 및 월경혈이 MSC의 주요 공급원이다. 중간엽 줄기 세포는 FCS-보충 DMEM에서 3-4 주 동안 태반 세포 또는 제대 세포를 배양함으로써 또한 수득될 수 있다 ([12], [13], [14]).

MSC는 중배엽, 외배엽 및 내배엽 분화 잠재력을 갖는다. MSC는 또한 면역억제 특성을 갖는다. MSC는 수지상 세포의 성숙 및 T 세포, B 세포 및 NK 세포의 증식을 억제하거나 중단시킨다. 중간엽 줄기 세포의 면역조정 작용은 그들이 분비하는 시토카인 및 케모카인에 의해 매개된다. 몇몇 군은 태반 조직 내의 MSC가 시험관내 및 생체내에서 다중-계통(multi-lineage) 발달 소성(developmental plasticity)을 나타냄을 입증하였다. 태반 조직 (제대, 제대혈, 태반, 융모막, 양막 및 양수) - 유래 MSC는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105의 양성 발현을 나타내고, 조혈 표면 마커 CD11b, CD19, CD34 및 CD45에 대한 음성 발현을 나타내고, 내피 표면 마커 CD31에 대한 음성 발현을 나타낸다. 게다가, 태반 조직-유래 MSC는 적절한 조건 (예를 들어 완전 배지)에서 모든 세 가지 배엽의 세포로 전환분화(trans-differentiation)할 수 있다.

주산기 조직-유래 MSC는 광범위한 면역조절 능력을 보유하는 것으로 또한 나타났으며 적응 면역 반응 및 선천 면역 반응 둘 다에 영향을 미칠 수 있다. 이들 MSC는 면역 세포의 증식 및 성숙을 억제하고 비-MHC 제한된 방식으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 면역 반응을 억제한다. 따라서, 이들 MSC는 HLA 클래스 I의 낮은 발현 수준, HLA 클래스 II의 무 발현, 및 CD40, CD80 및 CD86을 포함한 공동자극 분자의 무 발현을 표시하여, 면역원성이 낮은 것으로 간주된다. 기본적으로, 이들 MSC는 선천 면역 체계 및 적응 면역 체계 둘 다의 세포에 대해 광범위한 면역조정 효과를 나타낼 수 있을 것이다. 생체외 확장된 태반 MSC는 T 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, 수지상 세포 (DC), B 세포, 호중구, 단구, 대식세포 등을 포함한, 광범위한 면역 세포의 활성을 억제하는 것으로 또한 나타났다

인간 주산기 조직-유래 MSC는 수많은 임상 시험 보고에 따르면 또한 안전하다. B형 간염 바이러스 (HBV) 감염과 연관된 만성 간부전의 급성 악화(acute-on-chronic liver failure) (ACLF) 환자에 대한 제대 유래 MSC (UC-MSC) 수혈의 안전성 및 초기 효능이 평가되었다. 이들 결과는 MSC 수혈이 임상에서 안전하며 HBV-연관 ACLF 환자를 위한 새로운 치료 접근법으로서 제공될 수 있음을 시사하였다 [1]. 또한, 류마티스성 관절염 (RA)의 치료에서 인간 UC-MSC의 안전성 및 효능이 평가되었다. 이들 결과는 주입 동안에 또는 후에 어떠한 심각한 유해 효과도 관찰되지 않음을 나타냈다. 더욱이, MSC의 치료는 28-관절 질환 활동 점수에 따라 질환의 유의한 관해를 유도하였다 [2]. 과학자들은 단기 및 5년 추적 관찰 동안에 급성 심근 경색 (AMI) 직후, 9명의 환자에서 심근내 MSC 주사의 안전성 및 실행 가능성을 평가하였다 [3]. 이들 결과는 AMI 직후 환자에서 MSC의 심근내 주사가 5년 추적 관찰까지 실행 가능하고 안전하다는 것을 시사하였다. 중증 사지 허혈 환자에서의 MSC 안전성을 결정하기 위한 전향적 이중 맹검 무작위 위약 대조 다중-센터 연구는 MSC가 2백만개 세포/kg 체중의 용량으로 근육내 주사시 또한 안전하다는 것을 나타냈다 [4]. 어떠한 MSC 이식 부위에서도 신생물 합병증은 전혀 검출되지 않았다. 문헌 [Hongye Fan et al] ([15])은 IL1β 초회민감 MSC의 이식이 DSS-유도 뮤린의 결장염에서 향상된 치료 효율을 갖는다는 것을 나타냈으며, 이는 그의 증가된 면역억제능 및 향상된 이동 능력에 달려 있다. WO 2014/093948은 또한, 정제된 MSC의 치료학적 가치를 개시하였다.

그러나, MSC의 정의는 이들을 분명하게 동정하는 특이적 또는 특유한 세포 표면 마커가 없기 때문에 항상 논란의 여지가 있어 왔다. 지금까지, MSC는 세포 표면 표현형 단백질 마커, 플라스틱 부착성 섬유모세포-유사 성장 및 기능적 특성의 조합을 사용함으로써 정의되어 왔다. 그런데도, 이들 세포 표면 마커에 따라 몇몇 상이한 아집단이 있으며 이들 상이한 아집단은 상이한 생물학적 특성, 생물학적 기능을 나타내며 치료 프로토콜에서 모두 효율적이지는 않다. 예를 들어, 일부 MSC 집단은 IL1β에 의해 자극되며 ([12]), 한편 다른 집단은 그렇지 않다 ([15]에서의 CD106 양성 MSC). 게다가, 일부 MSC 집단의 증식은 IL4에 의해 억제되고 ([12]), 한편 다른 것들은 이 시토카인의 존재하에 증식으로 유도된다 ([13]). 따라서 임상 효율성을 가지며 그의 제조 공정을 표준화하는 기능적 MSC의 집단을 동정하는 것이 절실히 필요하다. 모든 태반 및 배아외 조직에서 상호교환하여 사용될 수 있는 프로토콜을 설정하는 것이 또한 중요하다. 더 엄밀히 말하면, 태반 조직으로부터 또는 제대 단편으로부터 치료학적으로 효율적인 MSC 집단을 산출하는 제조 공정을 동정하는 것이 중요하다.

한편, 현재 수많은 치료적 적용에 대한 인간 MSC의 요구가 높으나 시장에서의 가용성이 불충분하다. 따라서 기능적 MSC의 높은 수율을 제공하는 산업적 규모의 공정에 대한 필요성이 있다. 적당한 비용으로 최적의 수율을 제공함으로써, 모든 태반 조직 및 배아외 조직으로부터 수득한 MSC에 대한, 수요-공급 격차를 감소시키는, 효율적인 배양 시스템에 대한 필요성이 또한 있다.

본 출원은 상이한 기원 (태반 조직으로부터 또는 제대로부터)의 MSC 아집단을 생성시키고 정제하기 위한 최적의 방법을 제안하고 궁극적으로는 최소로 가능한 계대배양 및 최소한의 집단 배가 수로 상기 아집단을 확장함으로써, 이들 모든 필요성 및 다른 것들을 충족시킨다. 이 방법은 다중계통 분화능을 갖는, 매우 효능이 강한 MSC의, 태반으로부터 및 제대 조직으로부터의 회복을 야기한다. 이 방법은 임상 적용에 적합한 상당수의 MSC 세포로 재현 가능하게 제공한다.

실시예 1 (하기 참조)은 인간 태반 조직 유래 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 산업적 규모로 생성시켜, GMP-준수 시설에서 제조되고 동종이형 사용에 적합한 적어도 1x10⁵개 세포/cm² MSC의 수율을 수득할 수 있는 제조 방법을 개시한다. 상기 태반 조직 유래 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하는 세포의 95% 초과, 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 2% 미만을 포함한다.

이 방법은 동물에서 또는 인간 대상체로의 이식 시험에서 사용될 수 있는 세포를 생성시키는데 유용한다.

이는 하기 두 가지 일반 단계를 포함한다:

(i) 배양된 미분화 중간엽 줄기 세포의 집단을 생성시키기 위해, 성장 인자가 박탈된 제1 배양 배지에서 생물학적 조직 또는 유체로부터 수득된 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계,

및

(ii) 배양된 미분화 중간엽 줄기 세포의 상기 집단을 전-염증성 성장 인자(pro-inflammatory growth factor) 또는 염증 매개체를 함유하는 제2 배양 배지와 접촉시켜, 이를 필요로 하는 대상체로의 이식에 유용한 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포를 생성시키는 단계.

제1 측면에서, 본 발명은 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 산업적 규모로 제조하는 시험관내 방법으로서, 미분화 MSC의 집단을 전-염증성 성장 인자 또는 염증 매개체를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 상기 방법에 관한 것이다.

상기 "미분화 MSC의 집단"은 생물학적 조직 또는 유체에 존재하는 단핵 세포를 수집하고 이들을 제1 배양 배지에서 성장시킴으로써 수득할 수 있다. 이들 단핵 세포는 임의의 통상적인 수단에 의해, 예를 들어, 주산기 조직 단편의 효소적 소화 또는 체외이식편(explant) 배양 [10] 또는 생물학적 유체로부터의 단리 [11]에 의해 수득할 수 있다.

체외이식편 배양은 하기 실시예 3에서 명시된 바와 같이, 제대로부터 MSC를 유도하는데 특히 바람직한 공정이다.

전형적으로, 이 공정은 샘플을 수송 용액으로부터 꺼내어, 이를 절편 (대략 약 2-3 cm 길이)으로 커팅하고, 이들을 항생제와 항진균제로 소독하여 나중에 헹구고, 상피 막을 회수하고 이들을 부착하기 위해 (바람직하게는 배지 없이, 실온에서) 플라스크에서 상기 막의 단편을 처분한 후, 완전 배지를 부착된 체외이식편에 조심스럽게 첨가하고 37℃에서 수일 동안 인큐베이션 상태를 유지하는 것을 필요로 한다. 이동된 세포는 결국 적절한 도구를 사용하여 수집하고 적절한 제1 배지 (하기 참조) 중의 배양물에서 이들이 목표 전면생장률(confluency)에 도달할 때까지 유지한다.

상기 "제1 배양 배지"는 살아 있는 1차 세포의 성장을 조력하기 위해 통상 사용되는 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 바람직하게는, 이는 어떠한 성장 인자도 어떠한 분화 인자도 함유하지 않는다.

통상의 기술자는 어떤 종류의 배양 배지가 "제1 배양 배지"로서 사용될 수 있는지 잘 알고 있다. 이들은 예를 들어 DMEM, DMEM/F12, MEM, 알파-MEM (α-MEM), IMDM, 또는 RPMI이다. 바람직하게는, 상기 제1 배양 배지는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 DMEM/F12 (둘베코 변형 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12)이다.

더 바람직하게는, 상기 제1 배양 배지는 2-20% 또는 2-10%의 소 태아 혈청을 함유한다. 대안적으로, 상기 제1 배양 배지는 1-5% 혈소판 용해물을 함유할 수 있다. 가장 바람직한 배지는 2-20% 또는 2-10%의 소 태아 혈청 및 1-5% 혈소판 용해물을 함유한다.

제1 배양 배지로서 혈청 또는 혈소판 용해물이 결여된 배지를 또한 사용할 수 있되, 단, 이는 1차 살아 있는 세포의 성장을 조력하는 다른 적절한 작용제를 함유한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 "생물학적 조직"은 태반 조직 또는 제대의 임의의 부분이다. 특히, 이는 태반의 태반 자엽, 양막 또는 융모막을 포함하거나 그로 이루어질 수 있다. 또한, 이는 제대에서 발견되는 와튼 젤리(Wharton jelly)일 수 있다. 이는 정맥 및/또는 동맥을 포함하거나, 그것이 박탈된 것일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 상기 "생물학적 유체"는 일반적으로 여성 또는 포유동물로부터 무해하게 수집된, 제대혈, 태반 혈액, 또는 양수의 샘플이다. 예를 들어, 이들 조직 및 유체는 어떠한 침습적 진행 없이, 아기 또는 자손의 출산 후에 수득될 수 있다.

미분화 MSC의 상기 집단은 바람직하게는 세포가 85-90%의 전면생장률에 도달할 때까지 임의의 성장 인자가 결여된 상기 제1 배양 배지에서 배양된, 플라스틱 표면 상에 시딩된 중간엽 줄기 세포의 집단이다.

통상은, 표면 마커 CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 및 HLA-DR의 수준을 검출하기 위해, 세포는 FACS 또는 임의의 통상적인 수단에 의해 표현형적으로 특성화된다.

세포의 95%가 양성 표면 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고, 2% 미만이 음성 표면 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현할 때, 세포를 트립신 처리하고 다시 저밀도로, 예를 들어 cm²당 1000 내지 5000 MSC의 밀도로 제2 배양 배지에 시딩한다.

바람직하게는, 상기 "제2 배양 배지"는 살아 있는 1차 세포 성장을 조력하기 위해 통상 사용되는 임의의 통상적인 배지이다. 이는 "1차 배양 배지"와 동일한 배지일 수 있거나, 예를 들어 DMEM, DMEM/F12, MEM, 알파-MEM (α-MEM), IMDM, 또는 RPMI 중에서 선택된 또 다른 것일 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 제2 배양 배지는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지) 또는 DMEM/F12 (둘베코 변형 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12)이다.

더욱더 바람직하게는, 상기 제2 배양 배지는 혈청 또는 혈소판 용해물, 예를 들어 2-20%의 소 태아 혈청 및/또는 1-5% 혈소판 용해물을 함유한다. 가장 바람직한 제2 배지는 2-20%의 소 태아 혈청 및 1-5% 혈소판 용해물을 함유하는 DMEM이다. 제2 배양 배지로서 혈청 또는 혈소판 용해물이 결여된 배지를 또한 사용할 수 있되, 단, 이는 1차 살아 있는 세포의 성장을 조력하는 다른 적절한 작용제를 함유한다.

세포가 40-50% 전면생장률에 도달할 때, 전-염증성 성장 인자 또는 염증 매개체를 제2 배양 배지에 첨가하고 세포는 이들이 90-95% 전면생장률에 도달할 때까지 상기 배지에서 배양한다.

상기 "전-염증성 성장 인자"는 전형적으로, 전-염증 효과를 갖는 것으로 공지된 인터루킨 또는 케모카인이다. 제2 배양 배지에 첨가될 수 있는 인터루킨의 예는 TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18, 및 IFNγ를 포함한다. 제2 배양 배지에 첨가될 수 있는 케모카인의 예는 CXCL8, CXCL10, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CCL2, 및 CCL5를 포함한다. 다른 염증 매개체 (예컨대 항염증제)를 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 적어도 2종의 전-염증성 성장 인자가 상기 정의된 제2 배양 배지에 첨가된다. 이들 적어도 2종의 전-염증성 성장 인자는 TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18, 및 IFNγ로 이루어진 군에서 선택된다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 전-염증성 성장 인자는 IL1, IL4, IL12, IL18 중에서 선택된다. 더욱더 바람직하게는, 이들은 IL1 및 IL4이다

MSC에 첨가될 수 있는 성장 인자(들)의 전형적인 농도는 1-200 ng/mL, 바람직하게는 1-100 ng/mL, 더 바람직하게는 10-80 ng/mL로 포함된다. 바람직하게는, 성장 인자(들)를 사용한 MSC의 배양 단계는 적어도 1일 동안, 더 바람직하게는 2일 동안 지속된다.

본원에서의 용어 "IL1"은 인터루킨 1의 임의의 이소형, 특히 IL1α 및 IL1β를 지정한다. IL1 이소형은 의도된 적용에 따라, 다양한 기원일 수 있다. 예를 들어, 동물 IL1은 수의학적 적용에 사용될 수 있다. 바람직하게는, IL1β만이 본 발명의 제2 배양 배지에 첨가된다. 이 특정 실시양태에서, 첨가된 인터루킨 1β의 농도는 1-100 ng/mL, 바람직하게는 1-50 ng/mL, 더 바람직하게는 10-40 ng/mL로 포함될 수 있다.

인간 IL1베타 (IL1β)는 수탁 번호 NP_000567.1 (서열식별번호: 6, 269 아미노산)로서 참고 표시가 된다. 재조합 단백질은 GMP 조건 (알엔디 시스템즈(RnD systems), 써모피셔(Thermofisher), 셀제닉스(Cellgenix), 페프로텍(Peprotech))에서 시판되고 있다.

본원에서의 용어 "IL4"는 인터루킨 4의 임의의 이소형을 지정한다. IL4는 의도된 적용에 따라, 다양한 기원일 수 있다. 예를 들어, 동물 IL4는 수의학적 적용에 사용될 수 있다.

인간 IL4는 수탁 번호 AAA59149 (서열식별번호: 7, 153 아미노산)로서 참고 표시가 된다. 재조합 단백질은 GMP 조건 (알엔디 시스템즈, 써모피셔, 셀제닉스, 페프로텍)에서 시판되고 있다.

상이한 전-염증성 성장 인자의 임의의 혼합물이 본 발명의 제2 배지에서 사용될 수 있다. 특히, 하기 실험 부분에 개시된 바와 같이, IL1과 IL4의, 더 엄밀히 말하면, IL1β와 IL4의 혼합물을 사용하는 것이 바람직한 실시양태이다.

이 특정 실시양태에서, 첨가된 인터루킨 1β는 제2 배양 배지에서, 1-100 ng/mL, 바람직하게는 1-50 ng/mL, 더 바람직하게는 10-40 ng/mL로 포함되는 농도를 갖고, 첨가된 IL4는 1-100 ng/mL, 바람직하게는 1-50 ng/mL, 더 바람직하게는 10-40 ng/mL로 포함되는 농도를 갖는다. 바람직하게는, 인터루킨 1β 및 IL4를 사용한 배양 단계는 적어도 1일 동안, 더 바람직하게는 2일 동안 지속된다.

최종 단계에서, 세포는 표면 마커 CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 및 HLA-DR의 수준을 검출하기 위해, 임의의 통상적인 수단에 의해 표현형적으로 특성화된다. 이들 마커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이들 마커의 발현 수준을 검출하는데 유용한 항체는 모두 시판되고 있다.

이들 세포 표면 마커의 발현은 널리 공지된 기술 예컨대 바이오티닐화 또는 다른 동등한 기술을 사용한 세포막 염색에 이어서, 특이적 항체로의 면역침전, 유세포 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 ELISPOT, 항체 마이크로어레이, 또는 면역조직화학에 결합된 조직 마이크로어레이를 사용하여 특히 평가될 수 있다. 다른 적합한 기술은 FRET 또는 BRET, 단일 또는 다중 여기 파장을 사용하고 임의의 적합화된 광학적 방법, 예컨대 전기 화학적 방법 (전압 측정 및 전류 측정 기술), 원자력 현미경법, 및 무선 주파수 방법, 예를 들어 다극 공명 분광법, 공초점 및 비-공초점, 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율, 및 복굴절 또는 굴절 지수의 검출 (예를 들어 표면 플라즈몬 공명, 타원 편광법, 공명 거울 방법, 그레이팅 커플러 웨이브가이드 방법(grating coupler waveguide method) 또는 간섭측정법), 세포 ELISA, 방사성 동위원소성, 자기 공명 영상화, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE); HPLC-질량 분광학; 액체 크로마토그래피/질량 분석법/ 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 의한 분석을 적용하는 단일 세포 현미경법 또는 조직화학 방법을 포함한다.

바람직하게는, 세포 표면 마커의 수준은 FACS에 의해 평가된다. 환언하면, 본 발명의 방법은 전형적으로 다음을 필요로 한다:

a) 주산기 생물학적 조직 또는 유체에 함유된 단핵 세포를 수집하고,

b) 상기 단핵 세포를 이들이 85-90% 전면생장에 도달할 때까지, 바람직하게는 플라스틱 표면 상에, 제1 배양 배지로 성장시키고,

c) 일단 세포의 95%가 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고, 2% 미만이 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하면, 세포를 cm²당 1000 내지 5000 MSC의 밀도로 제2 배양 배지로 시딩하고,

d) 일단 세포가 40-50% 전면생장률에 도달하면 1-100 ng/mL의 염증 매개체 또는 전-염증성 성장 인자를 첨가하고,

e) 세포를 이들이 90-95% 전면생장률에 도달할 때 수집한다.

그 다음에, 수집된 세포는 표면 마커 CD73, CD90, CD105, CD166, CD45, CD34 및 HLA-DR의 수준을 검출하기 위해, FACS 또는 임의의 통상적인 수단에 의해 표현형적으로 특성화될 수 있다. 상기 제1 및 제2 배양 배지는 상기에 기재되었다.

상기 방법의 단계 d)에서, 첨가된 성장 인자(들)의 전형적인 농도는 1-200 ng/mL, 바람직하게는 1-100 ng/mL, 더 바람직하게는 10-80 ng/mL로 포함된다. 바람직하게는, 성장 인자(들)를 사용한 배양 단계는 적어도 1일 동안, 더 바람직하게는 2일 동안 지속된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 첨가된 인터루킨 1β 또는 IL4의 농도는 1-100 ng/mL, 바람직하게는 1-50 ng/mL, 더 바람직하게는 10-40 ng/mL로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 인터루킨 1β 및 IL4를 사용한 배양 단계는 적어도 1일 동안, 더 바람직하게는 2일 동안 지속된다.

최종 수집된 세포는 "본 발명의 세포 배양물" 또는 "본 발명의 CD106 ^고 CD151 ⁺ 네스틴 ⁺ MSC" 또는 "본 발명의 MSC"일 것이다. 이 세포 배양물은 전형적으로, CD106을 발현하는 세포의 60% 초과, 바람직하게는 60 내지 70%, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 더 바람직하게는 90% 초과, 더욱더 바람직하게는 95% 초과를 포함한다. 게다가, 이는 CD151을 발현하는 세포의 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과를 포함한다. 게다가, 이는 네스틴을 발현하는 세포의 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과를 포함한다. 마지막으로, 이는 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하는 세포의 95% 초과, 바람직하게는 96% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 바람직하게는 98% 초과를 포함하고, 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포 2% 미만을 포함한다.

CD106 ("혈관 세포 부착 단백질 1"에 대한 VCAM-1로도 공지됨)은 세 가지 이소형을 갖는 것으로 공지되어 있다. NP_001069.1 (본원에서 서열식별번호: 1로 지칭됨, 739 아미노산), NP_542413.1 (본원에서 서열식별번호: 2로 지칭됨, 647 아미노산) 및 NP_001186763.1 (본원에서 서열식별번호: 3으로 지칭됨, 677 아미노산)은 각각 이소형 a, b 및 c의 서열이다. 이 특정 바이오마커의 발현 수준을 검출하는 항체는 시판되고 있다 (예를 들어 써모피셔, 압캠(Abcam), 오리겐(OriGen) 등에 의해). 본 발명의 세포 표면에서 이 마커의 발현은, 이것이 그의 치료적 사용에 필수적인 신생혈관-유발(pro-angiogenic) 활성을 촉발하므로, 매우 중요하다.

네스틴 바이오마커 (본원에서 서열식별번호: 4로 지칭됨, 1621 아미노산)는 인간에서 번호 NP_006608.1 하에 참고 표시가 된다. 이 특정 바이오마커의 발현의 수준을 검출하는 항체는 시판되고 있다 (예를 들어 써모피셔, 압캠 등에 의해).

CD151 바이오마커 (본원에서 서열식별번호: 5로 지칭됨, 253 아미노산)는 인간에서 번호 NP_620599 하에 참고 표시가 된다. 이 특정 바이오마커의 발현 수준을 검출하는 항체는 시판되고 있다 (예를 들어 인비트로겐(Invitrogen), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 압캠 등에 의해).

바람직한 실시양태에서, 배양 단계 (또는 성장 단계)는 플라스틱 표면 상에서 수행된다.

보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

a) 임의로 다중 공여자로부터 태반 조직을 개별적으로 수집하는 단계;

b) 임의로 상기 태반 조직을 1X PBS를 사용하여 3회 세척하고, 1 mm³ 입방체로 해부하고 상기 입방체 조직을 다시 세척하여 조직으로부터의 혈액 대부분을 제거하는 단계;

c) 임의로 각각의 공여자의 상기 태반 조직을 콜라게나제로 개별적으로 소화시키고, 소화된 조직을 원심분리하고 단핵 세포를 수집하는 단계,

d) 수집된 단핵 세포를 배양 배지에 시딩하는 단계;

e) 상기 세포를 일단 이들이 85-90% 전면생장에 도달하면 트립신 처리하고 계대배양하는 단계;

f) 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하고, 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 백분율을 기준으로 하여 세포를 특성화하는 단계;

g) 상기 세포를 이들이 적어도 95%의 양성 마커 및 많아야 2%의 음성 마커를 포함할 때 cm²당 1000 내지 5000 MSC의 시딩 밀도로 90% 둘베코 변형 이글 배지/F12-녹아웃 (DMEM/F12-KO) 및 10% FBS 및 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 시딩하는 단계,

h) 1-100 ng/mL의 인터루킨 1β 및 임의로 1-100 ng/mL의 IL4를 이들이 40-50% 전면생장일 때 첨가하는 단계;

i) 상기 세포를 일단 이들이 90-95% 전면생장에 도달하면 트립신 처리하고 수집하는 단계; 및

j) 임의로 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166, 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 백분율을 기준으로 하여 세포의 특성을 특성화하는 단계.

하기 개시된 결과는 CD106의 발현이 제대 또는 태반으로부터 본 발명의 방법에 의해 수득된 MSC의 표면에서 크게 향상됨을 나타낸다. 이 발현은 이와 같이 생성된 세포의 치료적 사용에 매우 중요하다 (하기 참조).

따라서, 본 출원은 또한, 상기 철저히 명시된 특정 조건에서 미분화 MSC의 집단을 배양하는 것을 포함하는, 미분화 MSC의 CD106 발현 수준을 향상시키는 방법에 관한 것이며, 모든 상세한 실시양태가 준용된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기-기재된 방법에 의해 수득된 세포 배양물에 관한 것이다. 이 세포 배양물은 전형적으로, 그의 제조 동안에 어떠한 성장 인자와도 접촉되지 않은 성인 골수, 지방 조직, 제대 또는 태반으로부터 유래된 중간엽 줄기 세포보다 검출 가능하게 더 높은 수준에서 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM-1) 마커를 발현하는 단리된 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ MSC를 함유한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양물은 다음을 특징으로 한다:

(i) 검출 가능한 수준에서 CD106을 발현하는 세포의 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 더 바람직하게는 80% 초과, 더욱더 바람직하게는 90% 초과, 및

(ii) 검출 가능한 수준에서 CD151을 발현하는 세포의 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과, 및

(iii) 검출 가능한 수준에서 네스틴을 발현하는 세포의 90% 초과, 바람직하게는 92% 초과, 더 바람직하게는 95% 초과, 및

(iv) 검출 가능한 수준에서 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하는 세포의 95% 초과, 바람직하게는 96% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 바람직하게는 98% 초과.

더 바람직한 실시양태에서, 상기 세포 배양물은 그것이 검출 가능한 수준에서 마커 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 및 CD133을 발현하지 않는 MSC의 98% 초과를 함유함을 특징으로 한다. 이들 마커는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 이를 검출하는 항체는 시판되고 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양물은 다음을 함유한다:

- 검출 가능한 수준에서 CD106을 발현하는 세포의 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 더 바람직하게는 80% 초과, 더욱더 바람직하게는 90% 초과, 및

- 검출 가능한 수준에서 CD151을 발현하는 세포의 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과, 및

- 검출 가능한 수준에서 네스틴을 발현하는 세포의 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과, 및

- 검출 가능한 수준에서 마커 CD73, CD90, CD 105 및 CD 166을 발현하는 세포의 95% 초과, 바람직하게는 96% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 및

- 검출 가능한 수준에서 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 2% 미만.

본 발명에 따르면, "검출 가능한 수준에서 마커를 발현하는" 세포는 상기 마커가 그 표면 상에 상당한 수준으로 존재하는 경우, 즉, 즉 상기 세포에 대해 측정되는 상기 표면 마커의 염색과 연관된 신호 (전형적으로 상기 마커를 인식하는 항체로 수득되며, 상기 항체는 예를 들어 형광 염료에 커플링됨)가 상기 마커를 발현하지 않는 것으로 공지된 한 세포의 염색에 상응하는 신호보다 우수하다. 통상의 기술자는 상기 세포 / 마커를 동정하는 방법을 잘 알고 있어서, 이들 프로토콜을 여기서 상세히 기재할 필요는 없다.

본 출원의 실험 부분에 개시된 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포 배양물이 시험관내 및 생체내에서 혈관형성을 유도할 수 있음을 나타낸다. 이들 결과는 게다가 상기 세포를 허혈성 질환 또는 순환계 장애를 앓고 있는 개체 (인간 또는 동물 대상체)에게 투여하는 것이 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 검출 가능한 개선을 결과함을 나타낸다.

하기 개시된 결과는 또한 본 발명의 방법이 높은 수준의 CD106 / VCAM1 막 단백질을 발현하는 세포를 생성시킬 수 있음을 나타낸다. 중요하게는, 이 단백질은 최근 신생혈관-유발성 시토카인의 발현과 연관되어 왔다. 따라서, CD106 + MSC는 그의 신생혈관-유발 효율을 위해 선택되었고, 뒷다리 허혈에 대한 치료로서 제안되었다 ([16], [17]).

따라서, 제3 측면에서, 본 발명은 허혈성 질환 또는 순환계의 장애를 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 의약으로서 상기 세포의 용도에 관한 것이다. 환언하면, 본 발명은 허혈성 질환 또는 순환계의 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해 사용되도록 의도된 의약의 제조를 위한 상기 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 의약은 또한 피부 혈관 모세관 망에 적용될 수 있으며, 피부과학적 및 화장품 적용을 포함할 수 있다.

임의의 포유동물이 본 발명의 세포에 의해 치료될 수 있다. 상기 포유동물은 애완 동물 (개, 고양이, 말 등) 또는 반추 동물 (양, 염소, 소 등)일 수 있다. 동물이 본 발명의 방법에 따라 치료될 때, 초기 미분화 MSC가 동일한 동물 종으로부터의 생물학적 샘플 (동종이형 그래프트) 또는 유사한 종으로부터 (이종기원의 그래프트) 수득될 것이며, 제2 배양 배지에서 사용되는 성장 인자는 동일한 동물 종의 것들에 상응할 것이라는 점은 통상의 기술자에게 자명하다. 예를 들어, 고양이가 치료되어야 한다면, 초기 MSC는 고양이의 주산기 조직 또는 생물학적 유체로부터 수득될 것이고, 고양이 IL1β (재조합이거나 아님)는 제2 배양 배지에, 임의로 고양이 IL4과 함께, 첨가될 것이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 이 경우에, 초기 MSC는 주산기 조직 또는 여성으로부터 수득된 생물학적 유체로부터 수득될 것이고, 인간 IL1β (재조합이거나 아님, 예를 들어, 서열식별번호: 6)는 제2 배양 배지에, 임의로 인간 IL4 (예를 들어, 서열식별번호: 7의)와 함께 첨가될 것이다.

이 목적에서, 본 발명의 세포 배양물은 상기 대상체에게 임의의 통상적인 수단에 의해 이식되거나 국소 적용될 수 있다. 이 경우에, 본 발명은 상기 기재된 세포 배양물을 허혈성 질환, 순환계의 장애, 면역 질환, 장기 손상 또는 장기 기능 부전을 앓고 있는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 이식은 이식된 저장소를 사용하거나 세포를 근육내에서 계내 주사하거나, 정맥 주사를 통해 또는 임의의 적절한 전달 시스템에 의해 수행할 수 있다. 적용은 또한, 세포를 피부 또는 점막과 직접 접촉시킴으로써, 또는 세포를 피부 또는 임의의 점막 상의 장치로 적용함으로써, 또는 세포를 임의의 적절한 전달 시스템에 의해 피부 또는 점막에 전달함으로써 국소적으로 수행할 수 있다.

바람직하게는, 상기 질환 또는 장애는　1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, GVHD, 재생불량성 빈혈, 다발성 경화증, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy), 류마티스성 관절염, 뇌졸중, 특발성 폐 섬유증, 확장성 심근병증, 골관절염, 간경변증, 간부전, 신부전, 말초 동맥 폐쇄 질환,　중증 사지 허혈, 말초 혈관 질환, 심부전, 당뇨병성 궤양 또한 임의의 퇴행성 질환, 유착증, 자궁내막 장애 또는 위장관의 섬유증 장애, 예컨대 치루로 이루어진 군에서 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 질환 또는 장애는 말초 동맥 폐쇄 질환,　중증 사지 허혈, 말초 혈관 질환, 또는 당뇨병성 궤양이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 당뇨병성 궤양, 궤양, 외상, 화상, 열탕화상, 상처 또는 상처 치유 문제, 욕창성 궤양, 사마귀 등을 포함한 (이에 제한되지는 않음) 피부 또는 점막 질환이다.

본 발명의 세포 배양물은 더 엄밀히 말하면 피부 병리 예컨대 화상, 상처, 궤양, 흉터, 사마귀, 또는 다른 질환 예컨대 유착증 또는 위장관의 섬유증 장애 (예를 들어 치루)를 치료하는 것이 목적인 피부과적 제제에서 사용될 수 있다.

또 다른 특정 실시양태에서, 상기 질환 또는 장애는 치루 또는 자궁내막 손상이다.

다른 적용은 본 출원 내에 포함된다. 특히, 본 발명의 MSC를 피부과적 또는 화장품 목적으로, 예를 들어 피부 또는 점막의 세포를 재생하거나, 피부 또는 점막의 양태(aspect)를 개선시키거나, 피부 또는 점막의 결함을 보정하거나 피부 또는 점막의 화상 부위를 치유하기 위해 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 의약의 투여의 효율을 향상시키고 용이하게 하기 위해, 본 발명의 세포 배양물은 임의의 작용제, 작용제의 조성물 또는 다른 생물학적 적합성 물질 또는 장치와 혼합될 수 있다. 본 발명의 세포 배양물은 또한 임의의 적절한 전달 시스템 또는 생체적합성 물질에 캡슐화되거나 포함될 수 있다. 세포 또는 세포를 함유하는 제제는, 예를 들어 의료 장치, 예컨대 내시경, 스텐트(stent), 또는 주사기로 적용될 수 있다. 이는 세포를 피부 또는 점막과 접촉시킴으로써 국소적으로 또한 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 세포 배양물을 함유하는 의료 장치를 목표로 한다. "의료 장치"란, 이는 본원에서 치료용 조성물을 투여하기 위한 임의의 기구, 장비, 도구, 기계, 기기, 이식물, 시약 등이 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 의료 장치는, 예를 들어, 패치, 스텐트, 내시경, 또는 주사기이다.

본 발명은 또한 본 발명의 세포 배양물을 함유하는 전달 시스템을 목표로 한다. "전달 시스템"이란, 이는 본원에서 환자에게 의약품을 투여하기 위한 임의의 시스템 (배지 또는 담체)이 포함된다. 이는 경구 전달 또는 제어-방출 시스템일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 전달 시스템은 예를 들어 리포좀, 프로리포좀, 마이크로스피어, 생체중합체의 마이크로- 또는 나노-소포, 지질 또는 나노입자이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포는 히드로겔 또는 또 다른 생체적합성 물질 또는 부형제에 포함된다. 상기 히드로겔은 특히 알기네이트 소듐 히드로겔, 히알루론산 히드로겔, 키토산　히드로겔, 콜라겐 히드로겔, HPMC　히드로겔, 폴리-L-리신 히드로겔, 폴리-L-글루탐산 히드로겔, 폴리비닐　알콜 (PVA) 　히드로겔, 폴리아크릴산 히드로겔, 폴리메틸아크릴산 히드로겔, 폴리아크릴아미드 (PAM) 히드로겔, 및 폴리 N 아크릴아미드 (PNAM) 히드로겔을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 MSC 및 가능하게는 또 다른 생체적합성 물질 또는 부형제를 함유하는 히드로겔에 관한 것이다. CN106538515에 기재된 알기네이트 히드로겔과 같은 알기네이트 히드로겔이 본원에서 바람직하다.

본 발명의 맥락에서, "생체적합성 물질"은 생체의학 분야에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 이들은 예를 들어 금속 (예컨대 스테인레스 강, 코발트 합금, 티타늄 합금), 세라믹 (산화알루미늄, 지르코니아, 인산칼슘), 중합체 (실리콘, 폴리(에틸렌), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리우레탄, 폴리락티드) 또는 천연 중합체 (알기네이트, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴 등)이다. 이들 물질은 합성 물질이거나 천연 물질일 수 있다. 생체적합성 부형제는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으므로 상세한 설명은 필요하지 않다.

이 히드로겔은 화장품 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 세포 배양물을 함유하는 제약 또는 수의학적 조성물, 뿐만 아니라 상기 언급된 질환 및 장애의 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 세포 배양물을 함유하는 피부과적 또는 화장품 조성물에 관한 것이다.

이 제약, 수의학적 또는 화장품 조성물은 상기 기재된 바와 같은 다른 생체적합성 작용제 (예를 들어 히드로겔)를 추가로 함유할 수 있다.

상기 조성물은 바람직하게는 적어도 약 1 내지 5 x 10⁶ 세포를 함유한다.

[도면의 간단한 설명]

본 개시내용이 용이하게 이해될 수 있고 실제적인 효과를 발휘할 수 있기 위해, 예시적인 실시양태 및 예시된 도면들이 이제 참조될 것이다. 하기 상세한 설명과 함께 도면들은 실시양태를 추가로 실증하고 본 개시내용에 따른 다양한 원리 및 이점을 설명하기 위해 제공된다.

도 1은 본 발명의 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC 아집단을 어떻게 제조할 수 있는지를 나타내는 도해를 개시한다.

도 2는 실시예 1에 따라, 태반에서 배양 플라스크에 부착된 MSC의 형태를 나타낸다.

도 3은 CD106^고CD151⁺네스틴⁺MSC의 지방생성 및 골형성 세포 분화를 나타낸다. 결과는 CD106^고CD151⁺네스틴⁺MSC 아집단이 적절한 배지에서 지방생성 및 골형성 분화가 가능함을 나타낸다. 백색 화살표는 지질 소적 및 강하게 광물화된 영역을 강조 표시한다.

도 4는 혈관조영술에 의한 병리학적 검사를 나타낸다: 수술 후 21일에 수득한 대표적인 혈관조영상.

도 5는 LDPI에 의한 병리학적 검사를 나타낸다: 수술 후 0일 및 21일에 수득한 대표적인 LDPI 영상. 상기 패널에서, 이 영역은 백색 화살표에 의해 나타낸 바와 같이, 이식 후 3주에 여전히 영향을 받는다. 하부 패널에서, 흑색 화살표는 이식 후 3주, 관류된 영역을 강조 표시한다.

도 6은 당뇨병 환자를 위한 태반 유래 MSC 주입의 결과를 나타낸다. 총 15명의 당뇨병 환자 (남성 11명 및 여성 4명)가 이 임상 시험에 포함되었다. (A)는 15명의 환자의 이러한 군에서 주산기 조직 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺MSC로 3회 처리한 후 평균 인슐린 요구량의 감소를 나타내며, 이는 통계적으로 유의하였다 (P<0.001). (B)는 주산기 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺MSC의 처리가 당뇨병 환자의 당화 헤모글로빈의 수준을 또한 유의하게 개선시켰음을 나타낸다 (P<0.001). 이들 결과는 주산기 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺MSC가 당뇨병 환자에게 양호한 선택일 수 있음을 나타낸다.

도 7. (A)는 비대상성 간경변증(decompensated cirrhosis)을 앓고 있는 환자에서 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺MSC 주입 전에 초음파 검사를 사용한 복수 수준를 나타낸다. 그리고 (B)는 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺MSC를 투여한 지 1개월 후에 초음파 검사를 사용한 복수 수준을 나타낸다. (C)는 상기 환자의 간 기능이 유의하게 개선되었음을 나타낸다. CA125 발현은 정상 수준으로 감소하였다. 게다가, 총 단백질, 알부민, 혈청 중 글로불린도 유의하게 증가하였다.

도 8은 동맥 결찰 및 다양한 용량의 본 발명의 제대 MSC, 또는 식염수 또는 VEGF의 주사 후의 NOD/SCID 마우스 뒷다리 허혈 모델에서 관류 속도의 평가를 나타낸다.

실시예

간단함 및 실례적 목적을 위해, 본 발명은 그의 예시적 실시양태를 참조하여 기재된다. 그러나, 본 발명이 이들 구체적 세부 사항으로 제한 없이 실시될 수 있음은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 경우에, 널리 공지된 방법은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않도록 상세히 기재하지 않았다.

1. 태반 조직으로부터 본 발명의 MSC를 수득하는 방법

본 발명의 방법은 다음에 의해 실현되었다:

a) 다중 모 공여자로부터 인간 태반 조직을 개별적으로 수집하는 단계;

b) 상기 태반 조직을 1X PBS를 사용하여 3회 세척하고, 1 mm³ 입방체로 해부하고 상기 입방체 조직을 다시 세척하여 조직으로부터의 혈액 대부분을 제거하는 단계;

c) 각각의 공여자의 상기 태반 조직을 콜라게나제로 개별적으로 소화시키고, 소화된 조직을 원심분리하고 단핵 세포를 수집하는 단계,

d) 상기 단핵 세포를 배양 배지에 시딩하는 단계;

h) CD106을 발현하는 80% 초과의 세포, CD151의 경우 98%, 네스틴의 경우 98%, 및 양성 마커 CD73, CD90, CD 105 및 CD 166을 발현하는 95% 세포, 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 2% 미만의 세포 (이식 사용을 위함)를 포함하는 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ MSC를 수득하고 20 ng/mL의 IL1 β (페프로텍에 의해 제공됨) 및 20 ng/mL의 IL4 (페프로텍에 의해 제공됨)를 이들이 40-50% 전면생장일 때 첨가하는 단계;

i) 상기 세포를 일단 이들이 90-95% 전면생장에 도달하면 트립신 처리하고 수집하는 단계;

j) 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166, 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 백분율을 기준으로 하여 세포를 특성화하는 단계.

이 방법은 동종이형 투여에서 사용될 수 있는 적어도 1x10⁵개 세포/cm² MSC (이들이 90% 전면생장일 때 T75 cm² 플라스크에서 5x10⁶개 MSC)의 수율로 태반-유래 MSC의 아집단을 생성할 수 있게 한다. 이들 세포 배양은 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하는 95% 초과의 세포 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 2% 미만의 세포를 포함하였다.

인간 주산기 조직 유래 CD106^고CD151⁺ 네스틴⁺ MSC는 섬유모세포-유사이며 플라스틱 플라스크 상에서 매우 잘 성장한다 (도 2 참조).

세 가지 독립적인 실험이 수행되었다 (실험 1, 실험 2 및 실험 3). 20 ng/mL의 인터루킨 1 (β) 및 인터루킨 4 둘 다가 세포가 40-50% 전면생장일 때 첨가되었다 (도 1 참조). 그 시점에서, MSC는 양성 마커 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 발현하는 95% 초과의 세포, 및 음성 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 2% 미만의 세포를 포함한다. 그 후, MSC는 실제로 약 2일 동안애 90% 세포가 전면생장일 때까지 계속 성장한다 (하기 표 1 및 2 참조).

주목할 만하게, MSC 세포 표면 단백질 CD106, CD151 및 네스틴의 발현은 인터루킨 1 및 4를 첨가한 후에 유의하게 증가하였다.

표 1은 태반 실시예 1, 2, 및 3에서 수득된 인터루킨 1 및 4를 첨가하기 전의 태반 조직 유래 MSC 상에서의 CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD 105, CD106, CD151, 네스틴 및 HLA-DR의 발현을 나타낸다. 이들 결과는 태반 유래 MSC가 마치 골수 및 지방 조직 유래 MSC 처럼 통상적인 세포 표면 마커를 가짐을 나타낸다.

표면 마커	실험 1	실험 2	실험 3
IgG-PE	0.4%	0.9%	0.1%
IgG-FITC	0.5%	0.1%	0.4%
CD11b-PE	0.2%	1.4%	0.3%
CD19-FITC	0.7%	0.2%	0.6%
CD34-FITC	0.9%	0.1%	0.3%
CD45-PE	0.2%	1.1%	0.3%
CD31-FITC	0.3%	0.1%	0.4%
CD73-PE	99.2%	99.1%	99.8%
CD90-PE	99.7%	100%	98.9%
CD105-FITC	96.7%	98.1%	98.8%
CD106-PE	31.5%	23.2%	30.6%
CD151-PE	95.6%	96.1%	93.8%
CD29-PE	99.4%	100%	99.9%
CD44-FITC	99.6%	99.4%	99.2%
네스틴-PE	82.5%	78.7%	84.1%
HLA-DR-PE	0.0%	0.9%	0.0%

표 2는 실험 1, 2, 및 3에서 인터루킨 1 및 4를 첨가한 후의 태반 조직 유래 MSC 상에서의 CD11b, CD19, CD29, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD 105, CD106, CD151, 네스틴 및 HLA-DR의 발현을 나타낸다. 결과는 CD106 및 네스틴 단백질 마커가 완전 배지에서 IL-1 및 IL-4를 첨가한 후 48시간에 유의하게 증가하였음을 나타낸다. 한편, CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 세포는 여전히 통상적인 MSC 세포 표면 표현형 마커를 갖는다.

표면 마커	실험 1	실험 2	실험 3
IgG-PE	0.1%	0.6%	0.2%
IgG-FITC	0.2%	0.4%	0.4%
CD11b-PE	0.2%	1.0%	0.1%
CD19-FITC	0.4%	0.8%	0.8%
CD34-FITC	0.4%	0.2%	0.5%
CD45-PE	0.5%	0.8%	0.7%
CD31-FITC	0.7%	0.5%	0.8%
CD73-PE	99.9%	99.9%	99.7%
CD90-PE	99.3%	100%	99.7%
CD105-FITC	99.8%	99.8%	95.5%
CD106-PE	82.7%	81.9%	84.3%
CD151-PE	98.2%	99.4%	98.3%
CD29-PE	100%	100%	99.6%
CD44-FITC	99.8%	99.8%	99.6%
네스틴-PE	93.7%	92.9%	90.6%
HLA-DR-PE	0.0%	1.3%	0.5%

이들 아집단은 더 많은 세포 성장 인자, 시토카인, 면역조정 인자 및 염증 인자를 분비할 수 있다 (표 3 참조). 따라서 이들 CD106^고CD151⁺ 네스틴⁺ MSC는 면역조정 및 혈관형성의 더 양호한 잠재력을 가질 것이다.

표 3은 q-PCR에 의해 소비된 배지에서 분비된 성장 인자의 관련 발현 수준을 나타낸다. 결과는 태반 조직 유래 MSC가 완전 배지에서 IL-1 및 IL-4를 첨가한 후 48시간에 IL-6, IL-8, IL-10, HGF, ANG, MMP2, VEGF-A 및 TGF-β의 더 많은 단백질 발현 또는 분비를 가짐을 또한 나타낸다.

성장 인자	IL-1 및 IL-4 이전	IL-1 및 IL-4 이후	T -검정
IL-6	1.03±0.29	15.06±3.24	P＜0.05
IL-8	1.07±0.31	13.74±4.51	P＜0.05
IL-10	0.82±0.31	7.84±2.32	P＜0.05
HGF	0.85±0.42	4.19±1.63	P＜0.05
ANG	1.13±0.28	3.58±1.25	P＜0.05
MMP 2	0.95±0.42	3.92±1.29	P＜0.05
VEGF-A	1.18±0.24	2.83±0.76	P＜0.05
TGF-β	0.96±0.29	2.07±0.37	P＜0.05
bFGF	1.05±0.35	1.47±0.44	P＞0.05
SDF	1.13±0.27	1.92±0.66	P＞0.05

2. 제대 조직으로부터 본 발명의 MSC를 수득하는 방법

하기 시약이 본 실시예에서 사용되었다:

2.1. 체외이식 방법에 의한 세포 단리

제대를 수송 용액으로부터 꺼내어 2-3 cm 길이의 절편으로 커팅하였다. 부착성 혈액 세포에 의한 오염을 피하기 위해, 제거될 수 없는 혈병을 함유하는 각각의 탯줄 세그먼트를 폐기하였다. 그 다음에 절편을 αMEM + 반코마이신 1 g/L + 아목시실린 1 g/L + 아미카신 500 mg/L + 암포테리신 B 50 mg/L로 구성된 항진균제와 항생제의 조에서 실온 (RT)에서 30분 동안 소독하였다. 항생제를 주사용 멸균수에 즉석으로 용해시켰다.

제대의 절편을 상기 조로부터 꺼내고 실온에서 1X PBS에서 신속하게 세정하였다. 상피 막은 혈관에 닿지 않으면서 약간 절개되었다. 그 다음에 각각의 절편을 0.5 cm 두께의 슬라이스로 잘게 썰고 뚜껑이 달린 150 cm²플라스틱 플라스크의 바닥에 배치하였다. 플라스크당 6 내지 10개의 슬라이스를 각각의 슬라이스 주위에 적어도 1 cm 반경 원의 자유 공간으로 배치하고, 실온에서 배지 없이 15분 동안 부착하도록 방치하였다.

부착 후, 완전 배지 (αMEM + 5% CPL + 2 U/mL 헤파린)를 조심스럽게 첨가하여, 체외이식편을 플라스크의 바닥에 부착된 상태로 유지하였다. 그 다음에 플라스크를 37℃, 90% 습도 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.

배양 배지를 5 내지 7일 후에 교체하였다.

단리 10일 후에, 체외이식편으로부터의 세포의 이동은 도립 현미경검사에 의해 제어하였다. 부착 세포의 원이 체외이식편의 대부분 주위에 가시적이라면, 멸균, 일회용, 1회용 핀셋 하나로, 뚜껑을 통해 플라스크로부터 이들을 골라냄으로써 이들을 조심스럽게 제거하였다.

이 단계로부터, 세포의 전면생장률은 격일로 시각적으로 검사하고, 필요한 경우, 배지 교체는 17일에 수행하였다.

세포가 70-90% 전면생장률 또는 D20에 도달하였을 때, 배지를 제거하고 세포를 플라스크당 30 mL의 1X PBS로 세척하였다. 그 다음에, 트립지언(Trypzean)®을 사용하여 세포를 꺼내고 구 배지로 수집하고 2500 rpm에서 10분 원심분리하였다. 상청액을 폐기한 다음에 세포를 αMEM + 100 mg/mL HSA + 10% DMSO로 이루어진 냉동보존 용액에 현탁시키고 냉동보존하였다.

2.2. 효소적 방법에 의한 세포 단리

제대를 수송 용액으로부터 꺼내어 2-3 cm 길이의 절편으로 커팅하였다. 부착성 혈액 세포에 의한 오염을 피하기 위해, 제거될 수 없는 혈병을 함유하는 각각의 세그먼트를 폐기하였다. 그 다음에 절편을 αDMEM + 반코마이신 1 g/L + 아목시실린 1 g/L + 아미카신 500 mg/L + 암포테리신 B 50 mg/L로 구성된 항진균제와 항생제의 조에서 실온 (RT)에서 30분 동안 소독하였다. 항생제를 주사용 멸균수에 즉석으로 용해시켰다.

그 다음에 탯줄을 작은 단편으로 커팅하고 2.7 mg/mL 콜라게나제 유형 I 및 0.7 mg/mL 히알루로니다제를 포함하는 효소 칵테일에 함침하고, 부드럽게 교반하면서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후에, 2.5% 트립신을 첨가하고 30분 동안 추가 인큐베이션하였다.

소화된 현탁액을 배지로 1:2로 희석하여 현탁액의 점도를 감소시키고 나일론 메시를 통과시켜 단일 현탁액을 수득하였다. 세포를 20분 동안 300 × g에서 원심분리하고, 신선한 배지로 10,000개 세포/cm²로 시딩하였다.

배양 배지를 5 내지 7일 후에 교체하고 그 이후 7일마다 교체하였다.

세포가 70-90% 전면생장률 또는 D20에 도달하였을 때, 배지를 제거하고 세포를 플라스크당 30 mL의 1X PBS로 세척하였다. 그 다음에, 트립지언®을 사용하여 세포를 꺼내고 구 배지로 수집하고 2500 rpm에서 10분 원심분리하였다. 상청액을 폐기한 다음에 세포를 αMEM + 100 mg/mL HSA + 10% DMSO로 이루어진 냉동보존 용액에 현탁시키고 냉동보존하였다.

2.3. 세포 해동 및 배양

세포를 통상적인 프로토콜에 따라 해동시켰다. 간단히 말해서, 액체 질소를 위해 냉동관을 제거하고 37℃ 수조 내로 신속하게 플런지하였다. 상기 관에 얼음이 남아 있지 않은 즉시, 세포를 미리 가열된 (37℃) 완전 배지 (αMEM + 0.5% (v/v) 시프로플록사신 + 2U/mL 헤파린 + 5% (v/v) LP)에 희석하고 신속하게 원심분리하였다 (300 g, 실온, 5분).

원심분리 후, 세포를 미리 가열된 완전 배지에 현탁시키고, 수 및 생존력 (블루 트립판 / 말라세즈(Mallassez) 혈구계)을 평가하였다.

세포를 완전 배지에서 2개의 75 cm² 플라스틱 배양 플라스크에 시딩하고, 인큐베이션하였다 (90% 습도, 5% CO₂, 37℃).

2.4. 세포 자극

며칠의 확장 후, 세포를 전면생장률에 대해 점검하였다. 전면생장률이 30 내지 50%에 도달하였을 때, 구 배지를 폐기하고 비자극 상태를 위한 신선한 완전 배지로, 또는 10 ng/mL의 IL-1β 및 10 ng/mL의 IL-4로 완성된 신선한 배지로 대체하였다.

그 다음에 세포를 유세포 분석법 실험 전에 적어도 2일 전에 인큐베이션하였다.

2.5. 세포 수확 및 유세포 분석법 분석

2 내지 3일의 확장/자극 후, 세포를 전면생장률에 대해 점검하였다. 전면생장률이 최대 80%인 경우, 세포를 수확하였다. 간단히 말해서, 구 배지를 폐기하고 세포를 1X DPBS로 세척하였다. 트립신 EDTA를 첨가하고 세포를 37℃에서 5분 인큐베이션하였다. 트립신은 배지의 부피의 적어도 2X로 중화시키고, 세포 현탁액을 수확하고 수 및 생존력을 평가하였다.

유세포 분석법 실험은 1x10⁶개 세포를 필요로 하였으며, 이를 원심분리하고 1X DPBS + 0.4% HSA에 재현탁하였다.

세포를 하기 프로토콜에 따라 CD73, CD90 CD105, CD106, CD151 및 CD31, CD34, CD45, HLA-DR에 대해 표지하였다:

1. 세포를 생존력 및 수에 대해 평가하였다.

2. 20,000개 세포 / 표지 관을 수득하기 위해 필요한 현탁액의 부피를 15 mL 프로필렌 플라스틱 관에 넣었다.

3. 상기 관을 300 g 및 4℃에서 5분 원심분리하였다.

4. 세포를 1X DPBS + 0.4% HSA (1XDPBS에서 10x 4 mg/mL HSA 희석)로 재현탁하였다. 필요한 부피는 표지 관 당 500μL이었다.

세포외 염색을 FACS 제조자 및 항체 제공자에 의해 권장되는 CD106 및 CD151 마커에 대해 수행하였다. 세포내 염색을 네스틴에 대해 수행하였다. 세포내 염색을 위해, "BD 시토픽스(Cytofix)/시토펌(Cytoperm) 키트"라고 칭해지는 고정/투과(Fixation/Permeabilization) 용액을 사용하였다.

염색 직후에 세포를 분석하지 않는다면, 세포를 1XDPBS 0.5% 포름알데히드 용액과 접촉시킴으로써 고정 단계를 수행하였다.

표지 후, 세포를 1X DPBS + 0.4% HSA로 세척하고 네스틴 표지를 위해 투과화하였다.

표지된 세포를 아쿠리(Accuri) C6 + BD 바이오사이언시즈(Biosciences) 세포계산기로 분석하고, 결과를 BD 아쿠리 C6 플러스(Plus) 소프트웨어로 분석하였다.

2.6. 결과

상기 2.4. 지점에 명시된 조건에서 상기 (2.1.)에 개시된 체외이식 방법에 의해 단리된 탯줄-MSC를 배양함으로써 제대-유래 MSC의 수개의 배치 (HB-COR001 내지서 COR005-MSC)를 수득하였다. 탯줄 3 및 5 (COR003 및 COR005)의 경우, 2개의 MSC 집단 (MSC1 및 MSC2)을 본 발명의 단계들을 별도의 방식으로 반복함으로써, 부수적으로 수득하였다.

상기 세포의 표면에서 CD106의 발현은 유세포 분석법에 의해 측정하였다.

MSC의 모든 시험된 배치는 CD106 발현 수준에서 급격한 증가 (>60%)를 나타냈다 (표 4 참조).

3. 제대-유래 MSC의 CD106 발현에 대한 단리 프로토콜의 영향

중간엽 줄기 세포를 상기에 명시된 두 가지 상이한 방법 (2.1 및 2.2 참조)을 사용하여: 체외이식 단리에 의해 및 효소적 소화에 의해 제대로부터 단리하였다.

모든 세포를 동일한 배양 배지 (αMEM + 5% 혈소판 용해물 (LP))에서 배양하고, 본 발명의 방법에 따라 계대배양 3에서 자극하고 자극 후 2일에 수집하였다. 세포 생존력을 측정하고 세포를 계수하였다.

그 다음에, CD106을 포함한 몇몇 표현형 마커의 발현을 유세포 분석법으로 측정하였다.

모든 MSC는, 단리 방법 또는 자극 조건이 무엇이든, 통상적인 방법으로 표현형 마커를 발현하였다: CD73, CD90, CD105는 95% 초과 양성이며, 한편 CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR은 음성이었다.

CD151+ 및 네스틴은 또한 둘 다, 자극 또는 단리 방법과 관계 없이, 95% 초과 양성이었다.

자극 없이, 효소적 소화에 의해 단리된 MSC는 체외이식 방법으로 단리된 MSC (20%)보다 자극 전에 더 높은 수준의 CD106 (53%)을 발현하였다. 그러나 이들은 염증 칵테일을 사용한 자극에 덜 민감하였다: CD106의 더 작은 증가가 관찰되었다 (+4% 증가 대 +60% 증가).

따라서 체외이식 방법은 제대-유래 MSC에 대해 본 발명의 바람직한 방법이다.

2.1. 및 2.2에 명시된 두 가지 실험 프로토콜 후에 수득된 MSC 생존력 및 세포 수.

	COR27Enz P3+1 효소 분해에 의해 단리된 MSC		COR88Ex P3+1 체외이식 방법에 의해 단리된 MSC
조건	자극되지 않음	자극됨	자극되지 않음	자극됨
생존력	97.8%	95.8%	99.2%	97.1%
세포 수	6.0x10⁶	4.65x10⁶	6.2x10⁶	8.26x10⁶

2.1. 및 2.2에 명시된 두 가지 실험 조건에 의해 수득된 제대-유래 MSC의 분자 마커.

	COR27 Enz (-)	COR27 Enz (+)	COR88 Ex (-)	COR88 Ex (+)
CD73+	100,00%	99,88%	99,99%	99,99%
CD90+	99,98%	99,87%	99,95%	98,56%
CD105+	99,99%	100,00%	99,99%	99,99%
CD31-	99,97%	99,59%	99,85%	99,92%
CD34-	93,57%	93,70%	99,35%	97,91%
CD45-	99,92%	99,94%	99,96%	99,98%
HLADR -	100,00%	100,00%	99,99%	99,99%
CD106+	53,41%	57,21%	20,68%	80,31%
CD151+	99,99%	100,00%	99,99%	100,00%
네스틴+	100,00%	100,00%	100,00%	99,98%

4. 제대 중간엽 줄기 세포의 CD106 수준에 미치는 IL1-IL4 조합 자극 대 IL1 또는 IL4 단독 자극의 영향

중간엽 줄기 세포를 두 개의 제대로부터 체외이식 단리에 의해 단리하였다 (2.1 참조).

모든 세포를 동일한 배양 배지 (αMEM + 5% 혈소판 용해물 (LP))에서 배양하고, 10 ng/mL의 IL-1b와 10 ng/mL의 IL-4의 혼합물로, 또는 각각의 인터루킨으로 개별적으로 (10 ng/mL 각각) 본 발명의 방법에 따라 계대배양 4에서 자극하고 자극 후 2일에 수집하였다. 세포 생존력을 측정하고 세포를 계수하였다.

모든 MSC는, 자극 조건과 관계 없이, 통상적인 방법으로 표현형 마커를 발현하였다: CD73, CD90, CD105는 95% 초과 양성이며, 한편 CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR은 음성이었다. CD151+는 또한, 자극과 관계 없이, 95% 초과 양성이었다.

CD106 마커와 관련하여, IL1과 IL4의 조합물을 사용한 자극으로 관찰된 발현의 증가는 단일 인터루킨 자극으로 관찰된 발현의 증가보다 3 내지 5배 더 높다 (표 7 참조).

5. 당뇨병 래트에서 태반 유래 CD106 ^고 CD151 ⁺ 네스틴 ⁺ MSC의 혈관신생 효과

본 실시예는 태반 유래 CD106^고CD151⁺ 네스틴⁺ MSC의 치료학적 혈관신생 효과에 초점을 맞춘다. 이는 당뇨병에서 중증 뒷다리 허혈을 치료하기 위한 인슐린 주사와 조합된 세포-기반 요법으로서의 임상적 사용을 위한 그의 잠재력에 대한 통찰을 제공한다. 본 발명자들의 결과는 태반 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC가 혈관 세포로 직접 분화함으로써 혈류 관류를 회복시키고 허혈을 개선시키기 위해 혈관형성 및 치료적 혈관화에 참여한다는 것을 나타냈다. 게다가, 태반 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC는 당뇨병 래트에서 허혈 손상 및 기능 회복을 개선시켰다.

6주령의 면역결핍성 수컷 누드 래트를 바이탈 리버 레보러토리즈(Vital River Laboratories) (중국의 찰스 리버 레보러토리즈(Charles River Laboratories))로부터 구매하였다. 당뇨병을 야간 공복후 스트렙토조토신 (시트레이트 완충제 중 70 mg/kg, 주사 직전에만 제조)의 단일 복강내 주사로 유도하였다. 공복 혈장 글루코스 수준을 매주 측정하고 11 mM 내지 15 mM의 혈장 글루코스를 가진 래트를 당뇨병이 있는 것으로 간주하였다. 복강내 시트레이트 완충제 주사를 받은 연령- 및 체중-매칭된 누드 래트를 비당뇨병 대조군 (5.5 내지 8 mM의 혈당증)으로 사용하였다.

2주 후, 당뇨병 누드 래트를 마취시키고 (60 mg/kg 펜토바비탈 복강내), 좌측 대퇴 동맥을 이를 3-0 실크로 라이게이션하여 폐쇄하였다. 결찰은 복재 및 슬와 동맥의 분기점 근위로 0.5 cm 적용되었다. 리피오돌 (1.5 ml/kg)을 사용하여 혈관내 색전증을 유도하였다. 좌측 뒷다리가 비허혈성인 채로 좌측 대퇴 동맥에 겉보기 결찰(sham ligature)을 적용하였다.

허혈 모델이 확립된 후, 사지가 더 이상 어떠한 체중도 지지할 수 없고 발이 부풀어 오르고 빨갛게 될 수 있기 때문에 외과적 사지 결핍이 자명하였다. 시간이 지남에 따라 모든 군에서 허혈성 손상이 상이한 정도로 개선되었다. 사지 기능의 회복은 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC 아집단에서 유의하게 증가되었다 (도 4).

더 엄밀히 말하면, 도 4의 조직학적 데이터는 모세혈관 밀도가 PBS 군과 비교하여 세포 이식 군에서 증가되었음을 나타낸다. 게다가, PBS 군과 비교하여 당뇨병 래트 및 비-당뇨병 래트의 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC 아집단 세포 이식 군에서 더 많은 모세혈관 수가 관찰되었다.

도 5는 혈관신생 LDPI를 사용한 허혈-유도 변화의 기능적 증거를 나타냈다. 영상은 혈류가 수술 일에 좌측 뒷다리에서 완전히 막혔다는 것을 나타내며; 이것은 짙은 암색에 의해 표시된다. 3주 후, 혈류 관류는 모든 군에서 어느 정도 회복되었으나 허혈/비허혈 관류 비가 단지 52% 달성된 PBS 군에서는 정상으로 돌아가지 않았다. 세포 이식 군에서의 관류 회복은 유의하게 더 높았다. 비는 선행 기술의 P-MSC 군에서 81% (P<0.05 대 PBS 군)이었고 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC 아집단 군의 경우 86% (P<0.01 대 PBS 군)이었다.

MSC 아집단 둘 다에서 관류 회복이 유의하게 더 높았다. 따라서, 결과는 MSC가 혈류 관류를 개선시키고 본 발명의 MSC가 그렇게 하는데 더 효과적이라는 것을 밝혀냈다. 사실은, 본 발명의 MSC는 당뇨병 및 비당뇨병 래트 둘 다에서 혈류의 회복에 유의한 개선을 나타냈다.

결과는 본 발명의 MSC는 선행 기술의 MSC보다 더 효율적으로 혈류 관류를 개선시킨다는 것이 밝혀졌다. 본 실시예는 본 발명의 MSC의 투여가 당뇨병성 중증 사지 허혈에 대한 유망한 신규한 접근법임을 나타낸다.

6. 당뇨병 환자에 대한 본 발명의 태반 유래 CD106 ^고 CD151 ⁺ 네스틴 ⁺ MSC의 치료 효과

본 실시예는 본 발명의 태반 유래 CD106^고 CD151⁺ 네스틴⁺ MSC가 당뇨병을 앓고 있는 환자에게 미치는 치료 효과에 초점을 맞춘다. 이는 당뇨병에 대한 세포-기반 요법으로서의 임상적 사용을 위한 그의 잠재력에 대한 통찰을 제공한다.

총 15명의 당뇨병 환자 (남성 11명 및 여성 4명)가 이 임상 시험에 포함되었다.

포함 기준은 톈진 종합 병원(Tianjin General Hospital)에서 2013년 11월부터 2014년 11월까지 진단된 2형 당뇨병 환자들이었다. 환자는 30세 내지 85세이고, 당뇨병의 지속기간은 ≥3년이고, 적어도 1.5년 동안 ≥0.7 U/kg/일의 용량으로 최적 혈당 제어를 위해 인슐린을 필요로 하고, 인슐린 기능장애를 갖고, 인슐린-기반 치료로 혈당 변동이 잘 제어되지 않으며, 연구에 참여할 의향이 있다. 이들 15명의 환자는 42세 내지 67세로, 중앙 연령은 59세이고; 당뇨병의 지속기간은 3년 내지 17년으로, 중앙값은 8년이고; 일일 인슐린 요구량은 38 유닛 내지 90 유닛으로, 평균 58.7 유닛이었다. 동시 포도당 내성 검사, 인슐린 분비 검사, C 펩티드 자극 검사 및 당화 헤모글로빈의 측정은 3개월마다 검사하였다. 심장, 간 및 신장 기능 검사를 수행하였다. 치료 동안에 유해 사례 및 부작용을 관찰하였다. 일일 인슐린 요구량이 치료 후 ≥50% 만큼 감소하고 3개월 넘게 지속될 경우 효과적인 것으로 간주되었다.

환자는 본 발명의 태반 유래 MSC (P-MSC)를 1개월 간격의 주입으로, 3회 정맥내 주입받았다. 각각의 환자에게 투여된 P-MSC의 총 수는 (1.0-1.5)× 10⁶ / kg으로, 평균 1.25 ×10⁶/kg이었다. 동시에, 환자들은 계속해서 인슐린을 적용하고, 혈당 수준에 따라 인슐린 용량을 조정하였다. 합병증의 경우, 원래의 일반 치료를 유지하였다. 환자 모두는 요법 후 적어도 6개월 동안 추적 관찰되었다.

이 임상 시험은 15명의 이러한 환자 군에서 본 발명의 태반 유래 MSC의 3회 투여 후 평균 인슐린 요구량이 감소한 것으로 나타났으며, 이는 통계적으로 유의하였다 (P<0.001). 당뇨병 환자를 위한 인슐린 주사 투여량은 본 발명의 태반-유래 MSC를 투여한 후 (MSC 투여 전 6개월 동안에 복용한 평균 인슐린 투여량과 비교하여) 거의 절반으로 감소하였다 (도 6A).

이 임상 시험은 본 발명의 태반 유래 MSC를 사용한 치료가 당뇨병 환자의 당화 헤모글로빈의 수준을 유의하게 감소시킴을 나타냈다 (P<0.001) (도 6B).

이들 데이터는 본 발명의 MSC가 당뇨병 환자의 치료에 사용될 수 있음을 뒷받침한다.

7. 재생불량성 빈혈 환자에 대한 본 발명의 태반 유래 MSC의 치료 효과

본 실시예는 재생불량성 빈혈 환자에 대한 본 발명의 태반 유래 MSC의 치료 효과에 초점을 맞추고 재생불량성 빈혈에 대한 세포-기반 요법으로서의 임상적 사용을 위한 그의 잠재력에 대한 통찰을 제공한다.

재생불량성 빈혈은 형성저하증 및 지방성 BM을 가진 범혈구 감소증 및 감소된 혈관형성을 특징으로 하는, 면역-매개 골수 (BM) 부전 증후군으로서 대부분 간주된다. 이전 연구는 후천적 재생불량성 빈혈은 HSC/HPC 및 조혈 미세환경의 이상에 의해 나타나는 것으로 입증하였다.　 많은 증거들이 재생불량성 빈혈이 HSC/HPC 및 MSC를 포함한 줄기/전구-세포 장애를 특징으로 하는 증후군일 수 있음을 암시하여 왔다. MSC는 조혈을 지원하고 조혈 및 면역 항상성을 유지하기 위해 거의 모든 면역 세포 기능을 조절한다. MSC는 T 세포, B 세포, 단구, DC, NKT 및 호중구를 포함한 주 면역 세포의 기능을 조정할 수 있다 [5]. MSC는 Th1, Th17 및 CTL에 주목할 만한 면역억제 특성을 갖고 있다. MSC는 Th2 세포에 의한 IL-10 생산 및 Treg 세포의 확장을 촉진하면서 Th1 세포에 의한 T 세포의 증식, IFN-γ 및 TNF-α 분비를 억제한다. 그러나, 최근 연구는 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC는 불량한 증식 및 MLR, PHA-유도 T 세포 활성화 및 IFN-γ 방출의 결핍된 면역 억제를 갖는다는 것을 나타냈다 [6,7]. 본 발명자들의 최근 연구는 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC는 Treg 세포 확장을 촉진하면서 CD4+ T 세포의 증식 및 클론원성 잠재력을 억제하는데 있어서 감소되었음을 나타냈다. MSC는 또한 CD4+ 세포에 의한 TNF-α 및 IFN-γ의 생산을 억제하는데 결함이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, IL-4, IL-10 및 IL-17의 생산을 조절하는데 어떠한 유의한 차이도 없었다 [8]. 게다가, 본 발명자들의 연구는 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC는 건강한 대조군으로부터의 BM-MSC와 비교하여 이상 형태학, 감소된 증식 및 클론원성 잠재력, 및 증가된 아폽토시스를 나타냈음을 또한 나타냈다. 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC는 지방세포로 분화하도록 유도되기 쉬우나 골모세포로 분화하기가 더 어려웠다. 비정상적 생물학적 특징과 일치하여, 세포 주기, 세포 분열, 증식, 주화성 및 조혈 세포 계통과 관련된 많은 수의 유전자가 이들 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC에서 현저하게 감소된 발현을 나타냈다. 정반대로, 아폽토시스, 지방형성 및 면역 반응과 관련된 더 많은 유전자가 재생불량성 빈혈 환자로부터의 MSC에서 증가된 발현을 나타냈다. MSC의 유전자 발현 프로파일은 비정상적 생물학적 특성을 추가로 확인해 주고 재생불량성 빈혈에서 BM 미세환경 파괴의 가능한 메커니즘에 대한 중요한 증거를 제공하였다 [9].

MSC는 하기 두 가지 중요한 사실로 인해 재생불량성 빈혈을 치료하기 위한 유망한 치료제 후보이다:

i) 조혈은 일반적으로 MSC의 지지적이며 효능이 강한 면역억제능이며,

ii) 재생불량성 빈혈 환자로부터 유래된 MSC에서 관찰된 생물학적 특성 차이 및 기능적 결핍.

임상 시험에서, 1개월 초과 동안 계속된 간헐적인 열을 가진 6세 소녀를 MSC로 치료하였다. 2건의 골수 생검이 저세포성을 밝혀낸 후 재생불량성 빈혈이 확인되었다. 거의 6개월 동안 시클로스포린 및 스타노졸롤의 치료 후 말초 혈액 표현형에서 개선이 전혀 없었다. 조혈 줄기 세포 이식은 매칭된 공여자를 찾는 것이 매우 어려웠기 때문에 양호한 선택이 아니었다. 따라서, 환자는 본 발명의 태반 유래 MSC의 1×10⁷로 정맥내 주입에 의해 투여되었다. 말초 혈액 표현형은 1차 MSC 이식 후 유의하게 개선되었다. 그러나, 환자는 여전히 적혈구 및 혈소판 수혈을 포함한 혈액 제품 수혈에 의존하고 있었다. 6개월 후, 환자는 2차에 본 발명의 MSC의 1×10⁷ 정맥내 주사를 수용하였다. 말초 혈액의 표현형은 유의하게 개선되었으며 2차 주사후 12개월에 거의 정상 수준에 도달하였다. 게다가, 환자는 2차 주사 후 12개월에 혈액 제품 수혈에 대해 완전히 독립적이었다 (표 8). 이들 데이터는 본 발명의 태반 유래 MSC가 재생불량성 빈혈 환자의 임상 치료에 사용될 수 있음을 뒷받침한다.

태반 유래 MSC의 처리 동안에 말초 혈액의 표현형.

PB의 표현형	처리 전	1차 MSCT 후 6개월	2차 MSCT 후 12개월
WBC	0.64Х10⁹/l	4Х10⁹/l	5Х10⁹/l
ANC	0.03Х10⁹/l	1Х10⁹/l	1.5Х10⁹/l
HGB	48 g/l	80 g/l	110 g/l
PLT	3Х10⁹/l	28Х10⁹/l	53Х10⁹/l

8. 간 질환 환자에 대한 본 발명의 태반 유래 MSC의 치료 효과

본 실시예는 간 질환을 앓고 있는 환자에게 투여된 본 발명의 방법에 따라 수득된 태반 유래 MSC (즉, IL1 및 IL4 처리를 사용)의 치료 효과에 초점을 둔다. 이는 간 질환에 대한 세포-기반 요법으로서의 임상적 사용을 위한 그의 잠재력에 대한 통찰을 제공한다.

이 임상 시험에서, 40세의 남성이 10년 넘게 알콜성 간염을 앓고 있는 것으로 확인되었다. 환자는 통상적인 치료를 수용하였긴 하지만 2년 전에 비대상성 간경변증으로 확인되었다. 비대상성 간경변증의 치료에는 양호한 선택이 없으므로, 환자는 자발적으로 본 발명의 4×10⁷ MSC의 정맥내 주사를 수용하였다.

이 임상 시험에서, 초음파 검사 결과는 MSC가 투여되기 전에 9.7 cm의 복수 수준을 나타냈다 (도 7A 참조). 그러나, 복수 수준은 MSC의 투여 1개월 후 3.6 cm로 감소하였다 (도 7B). 더욱이, 결과는 MSC의 투여 후 비대상성 간경변증 환자의 간 기능이 유의하게 개선됨을 나타냈다. 게다가, 혈청에서의 CA125 발현은 임상적 기준에 따라 정상 수준으로 감소하였다.

이들 결과는 본 발명의 MSC로 치료된 비대상성 간경변증 환자에서 우수한 임상 반응을 입증한다.

게다가, 혈청 내의 총 단백질, 알부민, 글로불린이 또한 임상적 기준에 따라 정상 수준에 도달하는데 유의하게 증가하였다 (도 7C). 이들 결과는 MSC의 정맥내 주사 1개월 후 환자의 간 합성 및 대사 기능이 개선됨을 나타냈다.

따라서, 본 발명의 태반 유래 MSC는 간 질환에 대한 매우 양호한 세포치료학적 선택이다.

9. 제대로부터 수득된 본 발명의, 세포의 혈관형성 잠재력

본 발명의 MSC의 신생혈관-유발성 잠재력은 뒷다리 허혈 뮤린 모델에서 추가로 시험되었다.

물질 및 방법

12마리의 8주령 NOD/SCID 마우스 (장비에 연구소(Laboratoire Janvier))를 케타민과 크실라진의 혼합물로 마취시켰다. 그 다음에 좌측 다리의 대퇴 동맥의 좌측 근위 및 원위 부분을 라이게이션하고 (6.0 실크 봉합사, 에티콘(Ethicon), 프랑스 이시레몰리노)하고 결찰 사이의 부분을 절제하였다. 수술 후 허혈의 80% 초과를 나타내는 마우스를 상기 2.4 지점에서 명시된 프로토콜에 따라 수득된 바와 같이 본 발명의 MSC의 2회 용량으로 허혈성 사지의 비복근에 근육내 주사하였다 (군 2에서 동물당 0.5×10⁶개 세포, 군 3에서 동물당 0.05. 10⁶개 세포). 식염수 주사를 대조군 1에서 사용하였다. 20 ng/mL의 VEGF/마우스의 용량을 대조군 4에 또한 주사하였다.

주입 계획뿐만 아니라 용량은 세포의 의도된 임상적 사용을 위해 유래되었고, 동물에게 투여된 용량은 인간에서 I/II 상 임상 시험을 위해 제안된 용량 (이는 약 25x10⁶개 세포/kg이며, 이는 약 0.5x10⁶개 세포/마우스 (평균 마우스 중량 = 20 gr)를 의미한다)의 >10배이었다.

스캐너-레이저 도플러 (레이저 도플러 관류 시스템, 페리메드 페리스캔(Perimed PeriScan) PIM III)를 사용하여 뒷다리 혈류를 측정하였다. 허혈성 및 비허혈성 사지의 평균 관류는 허혈 전후, 그리고 허혈 후 21일까지 7일마다 측정하였다. 레이저 주파수의 혈액-의존적 변화는 상이한 유색 픽셀을 사용하여 영상화하였다. 영상을 분석하여 혈액 관류 분석 소프트웨어 (LPDIwin)를 사용함으로써 혈류를 정량화하였다. 관류의 백분율을 비허혈성 뒷다리에 대한 허혈성 뒷다리의 비로서 표시하였다.

뒷다리 근육 절편의 헤마톡실린-에오신 염색

마우스를 실험 종료시에 안락사시켰다 (D21). 뒷다리 비복근을 절개하고 염색하여 근육 섬유의 세포 핵의 분포를 시각화하였다. 허혈성 뒷다리로부터 단리된 근육을 파라핀에 고정시키고 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다.

결과

도 8은 상이한 주사: NaCl 0,9% (음성 대조군 - n=8), VEGF 20 ng/ml (양성 대조군 - n=6), 50.10³ MS 세포 (n=9) 및 500.10³ MS 세포 (n=7)로 처리한 마우스에서 뒷다리 허혈 후 평균 재관류 속도를 나타낸다.

이들 결과는 대퇴 동맥의 결찰 후 마우스에서 본 발명의 MSC의 고용량의 투여는 단독 투여된 VEGF의 비히클 (NaCl)과 비교할 때 더 높은 관류 속도를 결과함을 입증하였다. 최고 용량의 세포 (0.5x 10⁶개 세포)를 받은 마우스에 대해 세포 주입 후 이미 7일에 100% 관류율이 관찰되었다. 다른 군과 통계적으로 유의한 차이가 있었다.

또한, 이 예비 실험에서 세포의 최고 용량 (0.5x 10⁶개 세포)이 10배 더 낮은 용량보다 더 양호한 관류 속도를 달성하는 것으로 보이기 때문에 용량 반응 효과가 있을 수 있다.

이들 결과는 CLI의 이 마우스 모델에서 혈액 관류를 개선시키는 본 발명의 MSC의 실제 혈관형성 효능을 확인해 준다.

헤마톡실린-에오신 염색에서 관찰된 결과 (데이터는 나타내지 않음):

정상의 비허혈성 근육에서, 세포 핵은 근육 섬유의 주변에 분포한다.

허혈 유도 21일 후, 군 1 (NaCl 0,9%) 및 군 4 (VEGF 20 ng/mL)로부터의 마우스의 허혈성 근육에서, 세포는 이들이 여전히 재생하고 있기 때문에, 근육 섬유의 주변에서 핵을 거의 나타내지 않는다.

허혈 유도 21일 후, 군 3 (0.05. 10⁶MSC세포 또는 50k)으로부터의 마우스의 허혈성 근육에서, 근육 섬유의 50%가 재생되고 섬유의 주변에서 핵을 나타낸다. 재생은 군 1 및 군 4보다 더 빨리 일어난다.

허혈 유도 21일 후, 군 2 (0.5×10⁶개 MSC 세포 또는 500k)로부터의 마우스의 허혈성 근육에서, 근육 섬유의 100%가 재생되고 섬유의 주변에서 핵을 나타낸다. 근육의 염색 프로파일은 정상의 비허혈성 근육과 동일하다. 이 실험에서, 500k 세포 용량은 근육의 완전한 재생을 가능하게 한다.

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Gly Glu Thr Ile 370 375 380 Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr Asp Met Lys Ser Leu Glu 385 390 395 400 Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro Thr Ile Glu Asp Thr Gly 405 410 415 Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His Ile Asp Asp Met Glu Phe 420 425 430 Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr Leu Tyr Val Asn Val Ala 435 440 445 Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro Ser Ser Ile Leu Glu Glu 450 455 460 Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser Gln Gly Phe Pro Ala Pro 465 470 475 480 Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn Gly Glu Leu Gln Pro Leu 485 490 495 Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser Thr Lys Met Glu Asp Ser 500 505 510 Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln Ala Gly Arg Ser Arg Lys 515 520 525 Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro Lys Asp Ile Lys Leu Thr 530 535 540 Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Ile Ile Ser 545 550 555 560 Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp Ile Ile Leu Lys Lys Lys 565 570 575 Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser Ile Asp 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Gly Pro Arg Lys Asp 1130 1135 1140 Leu Glu Glu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Glu Phe Ser Glu Leu Pro 1145 1150 1155 Gly Lys Ser Arg Asp Pro Trp Glu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Glu 1160 1165 1170 Glu Ser Glu Ala Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu Glu Ala Phe Pro 1175 1180 1185 Ala Glu Thr Leu Gly His Thr Gly Ser Asp Ala Pro Ser Pro Trp 1190 1195 1200 Pro Leu Gly Ser Glu Glu Ala Glu Glu Asp Val Pro Pro Val Leu 1205 1210 1215 Val Ser Pro Ser Pro Thr Tyr Thr Pro Ile Leu Glu Asp Ala Pro 1220 1225 1230 Gly Pro Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Gln Glu Ala Ser Trp Gly 1235 1240 1245 Val Gln Gly Arg Ala Glu Ala Leu Gly Lys Val Glu Ser Glu Gln 1250 1255 1260 Glu Glu Leu Gly Ser Gly Glu Ile Pro Glu Gly Pro Gln Glu Glu 1265 1270 1275 Gly Glu Glu Ser Arg Glu Glu Ser Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu 1280 1285 1290 Thr Leu Pro Asp Ser Thr Pro Leu Gly Phe Tyr Leu Arg Ser Pro 1295 1300 1305 Thr Ser Pro Arg Trp Asp Pro Thr Gly Glu Gln Arg Pro Pro Pro 1310 1315 1320 Gln Gly Glu Thr Gly Lys Glu Gly Trp Asp Pro Ala Val Leu Ala 1325 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Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile 35 40 45 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 110 Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp 115 120 125 Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala 130 135 140 Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met 145 150 155 160 Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu 165 170 175 Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp 180 185 190 Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys 195 200 205 Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn 210 215 220 Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr 225 230 235 240 Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly 245 250 255 Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 260 265 <210> 7 <211> 153 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> IL4 human <400> 7 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150

Claims

CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 제조하는 방법으로서, 미분화 MSC의 집단을 적어도 2종의 전-염증성 성장 인자(pro-inflammatory growth factor)를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전-염증성 성장 인자가 TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18, 및 IFNγ 중에서 선택된, 바람직하게는 IL1, IL4, IL12, 및 IL18로부터 선택된 것인 방법.　
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 전-염증성 성장 인자가 IL1과 IL4의, 바람직하게는 IL1β와 IL4의 혼합물인 방법.　
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 태반, 제대 또는 태반 막 (융모막, 양막) 또는 그의 구성요소로부터 선택된 생물학적 조직으로부터, 또는 생물학적 유체, 예컨대 제대혈, 태반 혈액 또는 양수로부터 유래된 것인 방법.　
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 체외이식 조직으로부터의 세포 단리에 의해 수득된 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 제대로부터, 바람직하게는 제대 단편의 체외이식편(explant)으로부터의 세포 단리에 의해 유래된 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 태반으로부터, 바람직하게는 태반 조직 단편으로부터의 세포 단리에 의해 유래된 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 1 내지 100 ng/ml의 인터루킨 1, 바람직하게는 인터루킨 1β를　함유하는 것인 방법
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 1 내지 100 ng/ml의 인터루킨 4를　함유하는 것인 방법.
미분화 MSC의 집단을 적어도 2종의 전-염증성 성장 인자를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 미분화 MSC의 CD106 발현 수준을 향상시키는 방법.
제10항에 있어서, 상기 전-염증성 성장 인자가 TNFα, IL1, IL4, IL12, IL18, 및 IFNγ 중에서 선택된, 바람직하게는 IL1, IL4, IL12, 및 IL18로부터 선택된 것인 방법.　
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 전-염증성 성장 인자가 IL1과 IL4의, 바람직하게는 IL1β와 IL4의 혼합물인 방법.　
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 태반, 제대 또는 태반 막 (융모막, 양막) 또는 그의 구성요소로부터 선택된 생물학적 조직으로부터, 또는 생물학적 유체, 예컨대 제대혈, 태반 혈액 또는 양수로부터 유래된 것인 방법.　
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 체외이식 조직으로부터의 세포 단리에 의해 수득된 것인 방법.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 제대로부터, 바람직하게는 제대 단편의 체외이식편으로부터의 세포 단리에 의해 유래된 것인 방법.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 MSC가 태반으로부터, 바람직하게는 태반 조직 단편으로부터의 세포 단리에 의해 유래된 것인 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 1 내지 100 ng/ml의 인터루킨 1, 바람직하게는 인터루킨 1β를 함유하는 것인 방법.　
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 1 내지 100 ng/ml의 인터루킨 4를 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 CD106^고CD151⁺네스틴⁺ 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 함유하는 세포 배양물.
제19항에 있어서, 다음을 함유하는 세포 배양물:
- 검출 가능한 수준에서 CD106을 발현하는 세포의 60% 초과,
- 검출 가능한 수준에서 CD151을 발현하는 세포의 98% 초과,
- 검출 가능한 수준에서 네스틴을 발현하는 세포의 98% 초과,
- 검출 가능한 수준에서 마커 CD73, CD90, CD 105 및 CD 166을 발현하는 세포의 95% 초과, 및
- 검출 가능한 수준에서 마커 CD45, CD34 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 2% 미만.
제19항 또는 제20항에 있어서, 검출 가능한 수준에서 마커 CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104 및 CD133을 발현하지 않는 MSC의 98% 초과를 함유함을 특징으로 하는 세포 배양물.　
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈성 질환, 순환계의 장애, 면역 질환, 장기 손상 또는 장애, 또는 장기 기능 부전을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 세포 배양물.
제22항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, GVHD, 재생불량성 빈혈, 다발성 경화증, 뒤시엔느 근위축증, 류마티스성 관절염, 뇌졸중, 특발성 폐 섬유증, 확장성 심근병증, 골관절염, 간경변증, 간부전, 신부전, 말초 동맥 폐쇄 질환,　중증 사지 허혈, 말초 혈관 질환, 심부전, 당뇨병성 궤양, 섬유증 장애, 유착증 및 자궁내막 장애로 이루어진 군에서 선택된 것인 세포 배양물.
제22항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 피부 또는 점막 질환 또는 장애, 바람직하게는 당뇨병성 궤양, 궤양, 외상, 화상, 열탕화상, 상처 또는 상처 치유 문제, 욕창성 궤양, 사마귀, 유착증, 자궁내막 장애 또는 위장관의 섬유증 장애, 예컨대 치루인 것인 세포 배양물.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양물을 함유하는 제약 또는 수의학적 조성물.
제25항에 있어서, 히드로겔 또는 다른 생체적합성 물질을 추가로 함유하는 제약 또는 수의학적 조성물.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양물을 함유하는 국소 제제.
허혈성 질환, 순환계의 장애, 면역 질환, 섬유증 장애, 장기 손상 또는 장기 기능 부전을 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 제25항 또는 제26항의 제약 조성물 또는 제27항의 국소 제제.
1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, GVHD, 재생불량성 빈혈, 다발성 경화증, 뒤시엔느 근위축증, 류마티스성 관절염, 뇌졸중, 특발성 폐 섬유증, 확장성 심근병증, 골관절염, 간경변증, 간부전, 신부전, 말초 동맥 폐쇄 질환,　중증 사지 허혈, 말초 혈관 질환, 심부전, 당뇨병성 궤양, 섬유증 장애, 유착증 및 자궁내막 장애로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 제25항 또는 제26항의 제약 조성물 또는 제27항의 국소 제제.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양물을 함유하는 피부과적 또는 화장품 조성물.
피부 또는 점막 세포를 재생하거나, 피부 또는 점막 양태(aspect)를 개선시키거나, 피부 또는 점막 결함, 예컨대 검은 반점, 점, 여드름, 주름, 건조증을 보정하기 위한, 제30항의 피부과적 또는 화장품 조성물의 용도.
피부 손상 또는 장애, 예컨대 화상, 흉터, 혈관종, 검은 점(mole), 또는 사마귀를 치유하기 위한, 제30항의 피부과적 또는 화장품 조성물의 용도.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양물을 함유하는 의료 장치.
제33항에 있어서, 붕대, 패치, 스텐트(stent), 내시경, 또는 주사기인 의료 장치.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세포 배양물을 함유하는 전달 시스템.
제35항에 있어서, 생체중합체의 마이크로 또는 나노-소포, 지질 또는 나노입자인 전달 시스템.