CN115399312A

CN115399312A - 间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法

Info

Publication number: CN115399312A
Application number: CN202211072589.7A
Authority: CN
Inventors: 王嘉祥; 张寒冰; 王宏科; 郭红斌; 张鹏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2022-11-29

Abstract

本发明涉及生物与新医药技术领域，尤其涉及间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法。保护剂的活性成分包括甘油、维生素B、海藻糖和干细胞培养上清液。干细胞培养上清液来源与人源脐带间充质干细胞。本发明将甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液按比例混合。使干细胞外泌体可以在常温(18℃‑26℃)、无菌等环境下存放一年以上，且保持其结构稳定。大大提高了外泌体的保存时间，降低了外泌体的结构降解风险，放宽了外泌体对保存和运输温度的限制，使干细胞外泌体大范围的商业化应用成为可能。

Description

间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，尤其涉及间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法。

背景技术

间充质干细胞是一类具有自我复制与多向分化能力的一种多能干细胞，具有强大的组织修复能力和免疫调节能力，目前在多种难治性疾病如神经损伤、退行性疾病、自身免疫性疾病等方面获得不错的临床效果。间充质干细胞来源很广泛，从脐带、胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等组织中均可分离获得间充质干细胞。

干细胞上清是通过培养脐带间充质干细胞，富集得到干细胞集落，经过体外专业处理，制成精华悬液，干细胞上清中含有大量的细胞外泌体，细胞活性因子、调控因子、抑炎因子等，在组织受到损伤和炎症刺激的时候，这些因子通过包裹在外泌体中进行运输到达病灶以减轻组织炎症，加速伤口的愈合，减少疤痕的形成。

外泌体(Exosomes)产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30-150nm的膜性囊泡，密度为1.13-1.19g/ml，有典型的“杯盘”形态。人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，近乎于平均每个人体细胞产生1000-10000个。通常1ml血液中存在1×10^12个外泌体。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

综上所述，间充质干细胞培养上清中外泌体存在极大的研究和应用价值。但干细胞外泌体存在结构不稳定，受温度、洁净度等条件影响较大的结构降解风险。在4℃无菌环境中保存一周完全降解，-20℃无菌环境中保存6个月完全降解，-80℃无菌环境中保存3-5年完全降解，因此苛刻的保存条件导致外泌体的运输与应用受到了极大的限制。

发明内容

针对背景技术中存在的问题，提出间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法。本发明将甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液按比例混合。使干细胞外泌体可以在常温(18℃-26℃)、无菌等环境下存放一年以上，且保持其结构稳定。大大提高了外泌体的保存时间，降低了外泌体的结构降解风险，放宽了外泌体对保存和运输温度的限制，使干细胞外泌体大范围的商业化应用成为可能。

本发明提出间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，活性成分包括甘油、维生素B、海藻糖和干细胞培养上清液；干细胞培养上清液来源与人源脐带间充质干细胞。

优选的，活性组合物中甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量比为2-6：0.1-2：2-10：80-90。

优选的，活性组合物中甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量百分比为2-6％：0.1-2％：2-10％，80-90％，其余为医用生理盐水。

优选的，干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养2-6代时收集的上清液。

本发明又提出间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，步骤如下：

S1、将2-6％的甘油、0.1-2％的维生素B、2-10％的海藻糖、80-90％干细胞培养上清液计算称量，其余用医用生理盐水补足至100％；

S2、将上述组分充分混合，无菌灌装至2ml无菌无热源的管中。

优选的，干细胞培养上清液的制备方法如下：

a：将脐带用75％的酒精消毒、生理盐水冲洗后，剪成1-2cm的小段，用生理盐水排血，弃去废液；

b：将脐带小段剪成1-2mm³的脐带块，均匀接种于细胞培养瓶中，加入含10％胎牛血清的gibco培养基，放于5％CO₂、37℃培养箱内进行培养；

c：至上述需要传代的细胞的细胞融合度达到80％-90％时，进行传代培养；

d：收集第2代至第6代的培养上清，用滤膜过滤后存放在4℃环境下备用。

优选的，传代培养过程为：在含有符合细胞融合度要求的细胞培养瓶中加入0.25％浓度的胰酶消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮时，加入与胰酶同体积的胎牛血清终止消化；加生理盐水将得到的细胞悬浮液置于离心管中离心，吸弃上清液；向离心管内加入含10％胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为1.5×10⁶/ml；在培养瓶加入上述细胞悬液，补足含10％胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为体积相同的完全培养液；置于5％CO₂、饱和湿度、37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代；每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清。

优选的，gibbon培养基为DMEM/F12培养基。

优选的，所述第2-6代的细胞培养上清，要求符合间充质干细胞的国际标准CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。

与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

本发明将甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液按比例混合。使干细胞外泌体可以在常温(18℃-26℃)、无菌等环境下存放一年以上，且保持其结构稳定。大大提高了外泌体的保存时间，降低了外泌体的结构降解风险，放宽了外泌体对保存和运输温度的限制，使干细胞外泌体大范围的商业化应用成为可能。

附图说明

图1为本发明一种实施例中样品外泌体电镜图(a为第1天，b为第180天，c为第365天)；

图2为本发明一种实施例中样品外泌体平均粒径、浓度的示意图；

图3为本发明一种实施例中样品外泌体粒径和浓度的分析图(第1天)；

图4为本发明一种实施例中样品外泌体粒径和浓度的分析图(第180天)；

图5为本发明一种实施例中样品外泌体粒径和浓度的分析图(第365天)；

图6为本发明一种实施例中BCA测定外泌体蛋白浓度的标准曲线示意图；

图7为本发明一种实施例中BCA测定外泌体蛋白浓度及总质量示意图。

具体实施方式

实施例一

本发明提出的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，活性成分包括甘油、维生素B、海藻糖和干细胞培养上清液；干细胞培养上清液来源与人源脐带间充质干细胞。

实施例二

进一步的，活性组合物中甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量比为2-6：0.1-2：2-10：80-90。

进一步的，活性组合物中甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量百分比为2-6％：0.1-2％：2-10％，80-90％，其余为医用生理盐水。

进一步的，干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养2-6代时收集的上清液，所述干细胞培养上清液含有干细胞分泌的细胞因子、生长因子、趋化因子、抑炎因子等。

实施例三

本发明提出的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，步骤如下：

第1步：制备干细胞培养上清液：通过脐带制备干细胞培养上清液，脐带取自产妇，对产妇的具体要求为：(1)妊娠36-42周，发育、营养正常；(2)无传染性疾病，需提供1管5mL母血，进行母血检测，EBV、HCMV、HIV、HBV、HCV、梅毒应为阴性；(3)无恶性肿瘤；(4)妊娠期内无严重合并症；(5)无遗传性疾病家族史。

本发明得到的脐带外观颜色均匀，表面光滑无透明胶质，无褶皱或水肿，有弹性。按照无菌技术的管理规程清洁、消毒生物安全柜，准备实验所需的试剂及材料，瓶子的外表面用75％酒精由瓶盖向下擦拭后立即放入生物安全柜。

第2步：将脐带放入装有50ml75％酒精的烧杯中，消毒20-30s，用100ml生理盐水冲洗3-5次。

第3步：在平皿中加入20ml生理盐水，将上述用生理盐水冲洗后的脐带放入平皿中去除表面血污，然后用手术剪将脐带剪成1-2cm的小段，进一步排血，弃去废液。

第4步：将脐带小段放入盛有50ml生理盐水的烧杯中，反复冲洗3-5次。

第5步：用止血钳挤掉脐带小段内的水分，置于干燥无菌的玻璃烧杯中，用手术剪将其剪成约1-2mm3的小块。

第6步：使用双头药匙将烧杯中的脐带块均匀接种于细胞培养瓶中，每个细胞培养瓶约接种脐带组织200-300块，加入4-15ml含10％胎牛血清的gibco培养基，放于5％CO₂、37℃培养箱内进行培养。

第7步：取需要传代的细胞，在显微镜下观察细胞形态，确定细胞融合度是否达到80％-90％，将符合要求的细胞进行传代培养。

第8步：弃培养瓶中原有培养上清，向培养瓶内缓缓加入20-30ml生理盐水清洗(注意不要将细胞吹打起来)，弃生理盐水。重复上述步骤一次。

第9步：每个T175培养瓶加入2-5ml0.25％胰酶，轻轻摇匀，使溶液铺满整个瓶底，静置消化2-5分钟，之后若仍有贴壁细胞，可轻轻拍打或左右摇晃帮助细胞消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮即可，加入2-5ml胎牛血清终止消化。注意：加液和混匀操作要迅速，以保证各培养瓶消化过程同步进行，避免细胞消化过度。

第10步：每个T175培养瓶加入10-20ml生理盐水适度吹打至细胞完全悬浮后将各培养瓶中的细胞悬液加入到50ml离心管中，再以10-20ml生理盐水依次冲洗培养瓶后加入到50ml离心管中。

第11步：平衡后室温条件下，300G离心5-8分钟。

第12步：离心结束，吸弃上清液。向离心管内加入含10％胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为1.5×106/ml。本发明选用的gibco培养基为DMEM/F12培养基，该培养基的组分、各组分含量及配置方法均为已知技术。

第13步：将每个T175培养瓶加入2-5ml上述细胞悬液，补足含10％胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为35ml完全培养基。

第14步：置于5％CO₂，饱和湿度，37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代。

第15步：每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清，以备后用，取4.5*10^6个细胞，1200rpm离心5min。弃上清，2ml1XPBS重悬。取10支试管，标记为1～10管，分别依次加入MouseIgG1-FITC、CD19-FITC、CD34-FITC、MouseIgG1-PE、CD11b-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE。抗体加入量均为5μL，分别加入间充质细胞悬液80μL，震荡混匀，室温避光孵育20min。

第16步：每管加3ml1XPBS洗涤，1200rpm离心5min。弃上清，200μL1XPBS重悬，混匀后，使用BDFACSCalibur流式细胞仪上机检测。MouseIgG1-FITC、MouseIgG1-PE作为标准对照，得到的间充质干细胞表面标志物数据如表1所示。

表1间充质干细胞表面标志物数据

从表1可以看出，测量结果符合间充质干细胞的标准规定：CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95％；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2％。

第17步：收集第2代至第6代的培养上清，用0.22微米的滤膜进行过滤，去掉细胞碎片，存放在4度环境备用。

第18步：在A级洁净度的环境下将甘油、维生素B、海藻糖、干细胞培养上清液分别按照质量百分含量为2-6％、0.1-2％、2-10％、80-90％计算称量，医用生理盐水补足100％。然后将上述组分充分混合后，进行无菌灌装入2ml无菌无热源的管中。

实施例四

对本发明提出的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂进行测试，实验内容如下：

1、材料与仪器

1.1样本情况

1.2主要试剂与仪器

名称	品牌	货号
			PBS	Beyotime
0.45μm过滤膜	Millipore	R6BA09493
			CD9	Abcam	ab92726
CD63	Abclonal	A5271
			CD81	Abcam	ab109201
TSG101	Abcam	ab125011
			名称	品牌	型号
移液器	Eppendorf	ResearchPlus
			小型冷冻离心机	Beckman	Microfuge20R
超低温冰箱	Thermo	905
			超速离心机	Hitachi	CP100MX
透射电镜	Hitachi	HT-7700
			粒径分析仪	NanoFCM	N30E
多功能酶标仪	Thermo	VarioskanLUX
			化学发光凝胶成像系统	CLINX	ChemiScope3000mini

2、实验方法

2.1超速离心法提取外泌体

在37℃中速融样本。将样本移动至一个新的离心管内，2000×g，4℃，30min离心。小心的将上清液移至新的离心管中，10,000×g，4℃，45min再次离心，以去除较大的囊泡。取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，100,000×g离心70min。去除上清，用10mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4℃，100,000×g，超速离心70min。去除上清，用100μL预冷的1×PBS重悬，取20μL电镜，10μL粒径，剩余外泌体于-80℃保存。

2.2外泌体样品透射电镜观察

将外泌体取出10μL。吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。常温干燥数分钟。100kv进行电镜检测成像。获得透射电镜成像结果(如图1所示)。

2.3外泌体样品粒径分析

将外泌体取出10μL稀释至30μL。先用标准品进行仪器性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。待样本完成检测即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息(如图2-5所示)。

2.4WB

2.4.1外泌体样品蛋白提取及浓度测定

在37℃中速融外泌体，并迅速加入5×的RIPA裂解液。混匀后在冰上裂解30min，期间混匀。配制BCA法测蛋白浓度的标准样品，并取5μL样品加入到BCA混合液中，混匀。7℃孵育30min，酶标仪上在OD562nm处检测吸光值并记录。根据标准曲线(图6所示)算出待测样品蛋白浓度(如图7所示)。

上述实验证明，通过本发明可以使间充质干细胞外泌体在常温(18℃-26℃)、无菌环境下存放一年，并保持其结构稳定。该技术大大提高了外泌体的保存时间，降低了外泌体的结构降解风险，放宽了外泌体对保存和运输温度的限制。

对上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。

Claims

1.间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，其特征在于，活性成分包括甘油、维生素B、海藻糖和干细胞培养上清液；干细胞培养上清液来源与人源脐带间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，其特征在于，活性组合物中甘油、维生素 B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量比为2-6：0.1-2：2-10：80-90。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，其特征在于，活性组合物中甘油、维生素 B、海藻糖、干细胞培养上清液的质量百分比为2-6%：0.1-2%：2-10%，80-90%，其余为医用生理盐水。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂，其特征在于，干细胞培养上清液为人源脐带间充质干细胞培养2-6代时收集的上清液。

5.间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1、将2-6%的甘油、0.1-2%的维生素 B、2-10%的海藻糖、80-90%干细胞培养上清液计算称量，其余用医用生理盐水补足至100%；

6.根据权利要求5所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，其特征在于，干细胞培养上清液的制备方法如下：

a：将脐带用75%的酒精消毒、生理盐水冲洗后，剪成1-2cm的小段，用生理盐水排血，弃去废液；

b：将脐带小段剪成1-2mm³的脐带块，均匀接种于细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的gibco培养基，放于5% CO₂、37℃培养箱内进行培养；

c：至上述需要传代的细胞的细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养；

7.根据权利要求6所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，其特征在于，传代培养过程为：在含有符合细胞融合度要求的细胞培养瓶中加入0.25%浓度的胰酶消化，直至有大片细胞脱离瓶壁，镜下观察细胞呈球状并已基本悬浮时，加入与胰酶同体积的胎牛血清终止消化；加生理盐水将得到的细胞悬浮液置于离心管中离心，吸弃上清液；向离心管内加入含10%胎牛血清的gibco培养基，充分混匀后计数，根据计数结果调整细胞浓度为 1.5×10⁶/ml；在培养瓶加入上述细胞悬液，补足含10%胎牛血清的gibco培养基，保证每个培养瓶培养体系为体积相同的完全培养液；置于5%CO₂、饱和湿度、37℃培养箱培养至细胞长满瓶底后再次传代；每2-3天传代一次，传至2-6代时收集细胞培养上清。

8.根据权利要求7所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，其特征在于，gibbon培养基为DMEM/F12培养基。

9.根据权利要求6所述的间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法，其特征在于，所述第2-6 代的细胞培养上清，要求符合间充质干细胞的国际标准CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2%。