CN115885980A - 一种外泌体冷藏保存保护液及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请一方面，保护一种外泌体冷藏保存保护液，所述保护液包括浓度1~20%的海藻糖、浓度5~30%的甘露醇、浓度0.1~1%的聚乙烯醇、浓度1~10%的甘油、浓度0.5~5%的脂质体、浓度3~30%的大豆油和浓度1~10%的血清替代物，溶剂采用生理盐水。本申请另一方面，还保护上述外泌体冷藏保存保护液，在外泌体实验研究和外泌体产品领域的应用。本申请对人体几乎无毒害作用、且成本较低，同时能够在非冷冻条件下对外泌体提供长期有效的保护，让外泌体在0℃以上冷藏条件下长期保存。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种外泌体冷藏保存保护液及应用。
背景技术
细胞外囊泡初始被认为是细胞选择性消除蛋白质、脂质和RNA的手段，现在普遍认为是细胞间的一种通讯方式，一般认为其功能是通过转移其内功能性蛋白、代谢物、核酸等物质在细胞间发挥通讯作用。根据细胞外囊泡的大小、形态、组成或生物机制等可以分为不同的亚群，一般称粒径50～150nm的内体为外泌体，外泌体可以由所有细胞分泌，在不同病理生理条件下，细胞选择性分泌含有不同内容物的外泌体。因此，外泌体不但可以反映来源细胞的病理生理状态，而且被证实在免疫应答、蛋白代谢、细胞损伤后转归、肿瘤的发生与转移、耐药性等多种病理生理过程中发挥重要作用。
来自间充质干细胞的外泌体可以在伤口愈合的几乎所有阶段中产生益处，包括控制免疫反应、抑制炎症、促进细胞增殖和血管生成，同时减少伤口愈合过程中的疤痕形成。目前已有的研究均表明，外泌体能够促进脉管系统促进新骨形成，改善形态学、生物力学、组织学等，对细胞存活、增殖和迁移、成骨和血管生成有积极影响。
外泌体具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而保持其完整性和生物活性。目前，外泌体的储存，最常用的储存方法是在-80℃温度下冷冻保存，但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，导致多层囊泡的形成和聚集，外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化等，长期保存，外泌体的完整性和生物活性易受到影响。同时，冷冻保存，外泌体产品化后，储运难度也大幅增加，储运较为困难。
随着外泌体研究的不断深入，外泌体产品化及实际临床应用已经备受关注。临床上已经有极少量的间充质干细胞的外泌体产品推向市场，开始了临床应用。但是外泌体的保存以及其功能的保持难度较高，限制了其临床应用的推广，临床上相关产品的价格也极高。
发明内容
为了解决上述至少一种技术问题，开发一种对人体毒害作用极低、且成本较低，同时能够在非冷冻条件下对外泌体提供有效保存保护的保护剂产品，本申请提供一种外泌体冷藏保存保护液及应用。
一方面，本申请提供的一种外泌体冷藏保存保护液，所述保护液包括浓度1～20％的海藻糖、浓度5～30％的甘露醇、浓度0.1～1％的聚乙烯醇、浓度1～10％的甘油、浓度0.5～5％的脂质体、浓度3～30％的大豆油和浓度1～10％的血清替代物，溶剂采用生理盐水。
通过采用上述技术方案，本申请采用含有海藻糖、甘露醇和其它配合试剂的配方体系，对外泌体具有较好的保护作用，能在外泌体表面形成独特的保护膜，维持外泌体的结构完整和生物活性，有效的保护蛋白质分子完整性和生物活性，维持外泌体生物膜的稳定，避免了蛋白分子失活变形，以及生物膜的氧化损坏；本申请还添加了血清替代物，提供促接触和伸展因子，使外泌体贴壁免受机械损伤，配合本申请的上述组分，进一步避免了外泌体在保存时受损；本申请采用微量的聚乙烯醇这一对人体无毒、无味、无害，与自然环境具有良好的亲和性的组分，能够对海藻糖、甘露醇，以及浓度甘油、脂质体和大豆油的保护体系有极强的促进作用，使本申请能够在0℃以上的保存温度下，对外泌体提供强有力的保护，有效维持外泌体的结构完整和生物活性，维持外泌体生物膜的稳定。
可选的，所述外泌体冷藏保存保护液的使用温度在2～8℃。
进一步可选的，所述外泌体冷藏保存保护液的使用温度在2～4℃。
可选的，所述生理盐水的浓度控制在0.8～1％。
可选的，所述海藻糖的浓度控制在1～10％。
可选的，所述甘露醇的浓度控制在10～20％。
可选的，所述甘油的浓度控制在2～5％，所述脂质体的浓度控制在1～4％，所述大豆油的浓度控制在5～10％。
可选的，所述保护液包括浓度4～8％的海藻糖、浓度12～18％的甘露醇、浓度0.4～0.8％的聚乙烯醇、浓度2～4％的甘油、浓度1～2％的脂质体、浓度6～8％的大豆油和浓度6～8％的血清替代物，溶剂采用0.9～1％的生理盐水。
可选的，所述外泌体冷藏保存保护液使用时，保护液使用体积与需保护的外泌体的体积之比为7～10:3。
另一方面，本申请还保护上述外泌体冷藏保存保护液，在外泌体实验研究和外泌体产品领域的应用。
通过采用上述技术方案，本申请为外泌体医学应用的相关实验研究提供了效果极佳的保护剂，能够有效降低实验研究的保存设备投入和保存成本投入；同时，本申请还能为外泌体产品提供效果极佳的保护剂，无需冻存保存，实现了外泌体产品稳定的冷藏运输和冷藏保存，极大的降低了外泌体产品储运的难度和成本，为外泌体产品临床推广应用提供了先决条件。
综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：
1.本申请的外泌体冷藏保存保护液，能够让外泌体在0℃以上冷藏条件下长期保存，且能在保存期间对外泌体提供较好的保护，能维持外泌体的结构完整和生物活性，维持外泌体生物膜的稳定，有效避免蛋白分子失活变形，以及生物膜的氧化损坏。
2.本申请为外泌体医学应用的相关实验研究提供了效果极佳的保护剂，能够有效降低实验研究的保存设备投入和保存成本投入；同时，本申请还能为外泌体产品提供效果极佳的保护剂，无需冻存保存，实现了外泌体产品稳定的冷藏运输和冷藏保存，极大的降低了外泌体产品储运的难度和成本，为外泌体产品临床推广应用提供了先决条件。
3.本申请保护液原料均来源于药典，设计出的保护液对人体细胞、组织、器官的损害能够降到最小，具有安全、无毒、方便、高效的效果。
4.本申请保护液中所有组分的构成明确，便于工业化量产，原材料价格便宜、易获取，成本低廉。
附图说明
图1是本申请对照实验1的样本外泌体典型形态示意图；
图2是本申请对照实验1的样本总蛋白变化情况示意图；
图3是本申请对照实验1的样本蛋白检测图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请设计了一种外泌体冷藏保存保护液，所述保护液包括浓度1～20％的海藻糖、浓度5～30％的甘露醇、浓度0.1～1％的聚乙烯醇、浓度1～10％的甘油、浓度0.5～5％的脂质体、浓度3～30％的大豆油和浓度1～10％的血清替代物，溶剂采用生理盐水。
在本申请之前，本领域对于外泌体的保存，均采用低温冻存的方式，一般采用-80℃温度下冷冻保存。在冻存时，为了维持外泌体在一定保存时间内的结构完整和生物活性，同时避免保存带来的外泌体凋亡损耗，通常会在冻存时添加保护剂，以对外泌体提供保护。然而，现有的保护剂均无法实现在非冻存条件下对外泌体的有效保护。
申请人详细研究了外泌体的特性，外泌体是具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而一定程度的保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。
申请人还对现有外泌体的保存条件及现存的各种保护剂进行了详细的实验研究。申请人发现冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，导致多层囊泡的形成和聚集，外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化等，并不能保证长期有效的保存，并且外泌体的完整性和生物活性也易受到影响。目前现有的各种保护剂，只能在一定程度上缓解上述问题，并不能从根本上解决外泌体冻存时，凋亡和失活的问题。然而，不采用冻存方式，在低温冷藏条件下，外泌体凋亡和失活的问题更为严重。申请人推测，可能是由于现有保护液的组分中，存在对外泌体产生不利影响的组分，或是配比不适当，从而导致上述问题。
申请人经过实验研究，从药典中筛选出安全、无毒的组分，经过不断配比研究，设计了本申请的保护液。能够让外泌体在0℃以上冷藏条件下长期保存，且能在保存期间对外泌体提供较好的保护。
以下为本申请的实施例1～14。各组分及浓度配比见表1。
表1实施例1～14配比表
检测：
采用本申请实施例1～14的外泌体冷藏保存保护液，对纯化后的间充质干细胞外泌体，按照外泌体与保护剂以3:7(v/v)混合，分别分装至14支支1.8mL冻存管内，每支封装1mL，于4℃冷藏保存，保存1月以后，检测保存的外泌体的浓度、粒径和对CD9、CD63、CD81的表达情况。
使用BCA法检测外泌体总蛋白含量。
采用Western blot(WB)检测外泌体跨膜蛋白CD9、CD63、CD81的表达情况。
初始封装后检测，对分装于14支冻存管内的间充质干细胞外泌体进行初始检测，浓度在18～19×1010，而平均粒径在100nm左右。保存一个月时检测的具体检测结果见表2。
表2实施例1～14检测结果表
通过表2的数据可以看出，本申请制备的外泌体冷藏保存保护液保护下，在冷藏条件下对纯化后的外泌体保存1个月后，外泌体的浓度并没有大幅度的下降，而粒径基本保持完好。通过检测外泌体跨膜蛋白CD9、CD63、CD81的表达情况显示，14支冻存管内的外泌体表达均为阳性。由此可以看出，本申请的外泌体冷藏保存保护液能够在长时间冷藏保存时，对外泌体的结构完整和生物活性提供有效保护，且能够较好保证外泌体在保存时不会大幅凋亡。
通过表2的数据还可以看出，本申请中，所述保护液中，海藻糖浓度4～8％、甘露醇浓度12～18％、聚乙烯醇浓度0.4～0.8％、甘油的浓度控制在2～5％，脂质体的浓度控制在1～4％，大豆油的浓度控制在5～10％，血清替代物浓度6～8％，并采用0.9的生理盐水时，保护效果能够有进一步的明显提升。
对照实验1
以本申请实施例14的保护液作为样品1保护液，以海藻糖和氯化钠的混合液作为样品2的保护液，样品2的保护液中海藻糖和氯化钠的浓度分别为5％和0.9％。
选取两支1.8mL的冻存管，灭菌处理。取纯化后的间充质干细胞外泌体，在无菌实验台进行分装；样品1和样品2均按照保护液和外泌体7:3(v/v)混合，配置成混合液，两支无菌冻存管内分别分装1mL的样品1混合液和1mL的样品2混合液，而后在无菌条件下在4℃温度下冷藏保存。
分别于0天、1周、2周、1月、2月、3月共6个时间点，对两组样品进行检测，检测样品的外泌体的浓度、粒径和对CD9、CD63、CD81的表达情况，并用电镜观测外泌体的形貌。
具体检测结果见表3。
表3对照实验1检测结果表
对两份样品的电镜观测结果见图1所示，外泌体浓度变化监测曲线见图2所述，外泌体跨膜蛋白CD9、CD63、CD81表达结果见图3所示。
通过表3和图1～3的结果可以看出，样品1与样品2总蛋白有显著性差异(p＝0.048＜0.05)，而本申请实施例14的保护液的保护效果远优于海藻糖和氯化钠的混合液。二本申请实施例14的保护液在4℃冷藏条件下对外泌体有较优保护作用，能够保证外泌体存储3个月仍具有较完整的结构和较好的分散度，并且就外泌体浓度、跨膜蛋白、总蛋白情况而言，也可以维持相对稳定。
对照实验2
以本申请实施例14的保护液作为标准样品保护液。
以本申请实施例14的保护液，配比中去除聚乙烯醇作为对照样品1的保护液。
以本申请实施例14的保护液，配比中去除甘露醇作为对照样品2的保护液。
以本申请实施例14的保护液，配比中将聚乙烯醇浓度调整至1.2％，作为对照样品3的保护液。
选取四支1.8mL的冻存管，灭菌处理。取纯化后的间充质干细胞外泌体，在无菌实验台进行分装；样品均按照保护液和外泌体7:3(v/v)混合，配置成混合液。在四支无菌冻存管内分别分装1mL的四组样品混合液，而后在无菌条件下在4℃温度下冷藏保存。
分别于0天、1周、2周、1月、2月、3月共6个时间点，分别对四组样品进行检测，检测四组样品的外泌体的浓度、粒径和对CD9、CD63、CD81的表达情况。具体检测结果见表4。
表4对照实验2检测结果表
通过表4的数据可以看出，在未添加聚乙烯醇，或聚乙烯醇的浓度超过本申请限定的浓度时，保护液的保护效果有十分明显的下降。而仅仅去除甘露醇后，保护液的保护效果也有十分明显的下降，但是仍然具有一定的保护效果。由此可以看出，特定浓度的聚乙烯醇的添加对本申请的保护液的各组分产生的保护效果有十分明显的促进作用，不添加聚乙烯醇或浓度控制不精确，均无法实现本申请冷藏保存外泌体的技术效果。
申请人还对保存温度、保护液使用量和采用的生理盐水的浓度等均进行了梯度实验，本申请的外泌体保护液在2～8℃的保存温度，选用0.8～1％的生理盐水时，具有较为优异的保护效果。而使用时，保护液与需保护的外泌体的体积之比控制在7～10:3为宜。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述保护液包括浓度1~20%的海藻糖、浓度5~30%的甘露醇、浓度0.1~1%的聚乙烯醇、浓度1~10%的甘油、浓度0.5~5%的脂质体、浓度3~30%的大豆油和浓度1~10%的血清替代物，溶剂采用生理盐水。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述外泌体冷藏保存保护液的使用温度在2~8℃。
3.根据权利要求2所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述外泌体冷藏保存保护液的使用温度在2~4℃。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述生理盐水的浓度控制在0.8~1%。
5.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述海藻糖的浓度控制在1~10%。
6.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述甘露醇的浓度控制在10~20%。
7.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述甘油的浓度控制在2~5%，所述脂质体的浓度控制在1~4%，所述大豆油的浓度控制在5~10%。
8.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述保护液包括浓度4~8%的海藻糖、浓度12~18%的甘露醇、浓度0.4~0.8%的聚乙烯醇、浓度2~4%的甘油、浓度1~2%的脂质体、浓度6~8%的大豆油和浓度6~8%的血清替代物，溶剂采用0.9~1%的生理盐水。
9.根据权利要求1所述的一种外泌体冷藏保存保护液，其特征在于，所述外泌体冷藏保存保护液使用时，保护液使用体积与需保护的外泌体的体积之比为7~10:3。
10.如权利要求1~9任意一项所述的外泌体冷藏保存保护液，在外泌体实验研究和外泌体产品领域的应用。
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