CN117598291B - 一种外泌体保护液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种外泌体保护液及其应用，所述保护液包括：糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆P188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。所述保护液适用于不同来源外泌体，即可作为冻存液也可作为冻干保护剂，适用的温度范围广包括‑80℃~25℃，所述保护液能够降低外泌体储存运输成本，扩大外泌体适用范围；使用上述保护液能够提高外泌体在储存中的稳定性和保持外泌体的完整性功效，还具有减少外泌体聚集的功效，提高EVs上目标蛋白的稳定性。

Description

一种外泌体保护液及其应用

技术领域

本发明属于生物药制剂技术领域，具体涉及一种外泌体保护液及其应用。

背景技术

外泌体是生物细胞分泌的双层脂膜外囊泡（extracellular vesicles，EVs），其中包裹有DNA/RNA、蛋白质、脂类、糖类、各类代谢物质，粒径在30-150 nm范围内。与脂质体、AAV和慢病毒等传统的药物载体相比，外泌体具有低免疫原性和良好的生物兼容性等优势。然而，外泌体具有体外不稳定的显著缺陷，易发生非特异性吸附及长期冷冻储存时生物活性显著降低。因此，开发一种针对于各种外泌体，且储存方式不受限制的同时提高外泌体的体外稳定性的保护液，这对促进外泌体的相关研究及应用具有重要意义。

保护液配方开发一方面是找到能提供稳定的溶液条件以支持外泌体分子及其相关生物大分子的高阶结构，为其在制备、生产、使用过程中受到的各种应激条件提供稳定性支撑，从而维持整个体系稳定。另一方面也是通过各种赋形剂为外泌体在制剂研发过程中提供更多可能性，从而使其具有更广泛的应用价值。

专利SG11202203037SA公开了一种组合物，其成分为外泌体、糖类、氯化钠、磷酸钾和磷酸钠，该组合物处于pH约7.0-7.4的溶液中，糖类的浓度范围在1%-5%，电导率在6 mS/cm±10%~10 mS/cm±10%，NaCl的浓度范围在10 mM-134 mM，磷酸盐缓冲液包含钾磷酸盐和磷酸钠，其比例为1:2-1:5，-80℃~-20℃范围内储存。但是上述组合物适用于-80℃~-20℃范围内储存，对于其他的温度范围难以适用。

专利US20230285302A1公开了关于冻干外泌体组合物及其用途。该专利中组合物成分包括植物来源外泌体、25 mM-100 mM范围内的海藻糖和1%-5%低分子量透明质酸，冻干后主要作为皮肤外用剂。在上述专利中，其主要适用于植物源外泌体，并且制备的产品主要适用于皮肤外用剂，对于其他来源的外泌体和其他剂型的产品该专利的冻干方法并不适用。

专利CN115885980A公开了一种外泌体冷藏保护液及应用，所述保护液包括浓度1%-20%的海藻糖、浓度5%-30%的甘露醇、浓度0.1%-1%的聚乙烯醇、浓度1%-10%的甘油、浓度0.5%-5%的脂质体、浓度3%-30%的大豆油和浓度1%-10%的血清替代物，溶剂采用生理盐水。所述冷藏保护液对人体几乎无毒害作用、且成本较低，能够在非冷冻条件下对外泌体提供长期有效的保护，让外泌体在0℃以上冷藏条件下长期保存。但是上述冷藏保护液对于-80℃~-20℃条件下冷冻却不适用，因此，其使用场景有限。

专利CN115968867A公开了一种外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法，所述外泌体冻干保护剂以10-50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括糖类物质1-5% w/v、醇类物质1-5% w/v、明胶水解物0.1-0.5%w/v和精氨酸50-500 mmol/L。该外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法缓解了现有技术中存在的冻干保护剂无法有效的维持外泌体冻干后生物活性的技术问题。上述冻干保护剂主要应用于冻干，并不适用于外泌体冷藏。

外泌体一类细胞外囊泡，具有在生物体内广泛的分布性和获取的便捷性，作为一种新型细胞间通讯的物质，已经成为疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医疗上也有着光明的前景。外泌体具有天然双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好。与其它纳米药物递送系统如脂质体、腺病毒相比，它穿透性极强、吸收更佳、低免疫原性。常规使用、储存方式是将外泌体长期置于PBS磷酸盐缓冲液中于2~8℃使用，于-80℃冻存。虽然PBS磷酸盐缓冲液可为其提供人体体液类似的渗透压和pH值，但在维持外泌体稳定性方面仍具有一定局限性。首先，无论是冷藏、冻存还是冻干PBS均无法提供更多功效以防止外泌体聚集，生物特性、标志物改变和含量、活性的降低。使得外泌体保存时间短，存储运输成本高，应用范围窄。其次，目前外泌体进展主要处于早期研究阶段，即使为数不多产品已经进入早期临床，也主要用于疾病诊断、预后监测等方面。若能开发一种安全、有效、稳定、适用于外泌体的配方，即可适用于外泌体早期研发，又可形成制剂用于临床。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种外泌体保护液及其应用。本发明提供一种药用级别的外泌体保护液，通过选取满足药用标准的辅料为后期临床研究提供基础；所述保护液适用于不同来源外泌体，即可作为冻存液也可作为冻干保护剂，适用的温度范围广，包括-80℃~25℃（采用所述保护液冻干外泌体后，可稳定保存于5-25℃，采用所述保护液冻存外泌体后，可稳定保存于-80℃~5℃），所述保护液能够降低外泌体储存运输成本，扩大外泌体适用范围；使用上述保护液能够提高外泌体在储存中的稳定性和保持外泌体的完整性功效，还具有减少外泌体聚集的功效，提高EVs上目标蛋白的稳定性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种外泌体保护液，所述保护液包括：糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆P188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。

优选地，所述糖类赋形剂选自海藻糖和/或蔗糖。

本发明中，所述保护液中各组分按功能分包括赋形剂、表面活性剂、胞内渗透压调节剂、渗透压调节剂、缓冲体系和稳定剂。按组成类型分包括糖类、多元醇、表面活性剂类、盐和氨基酸等。其中糖类、多元醇、表面活性剂类、氨基酸可以统称为低温保护剂。

其中，低温保护剂之所以能维持外泌体的稳定性，一是在水溶液中，水分子与外泌体表面的某些极性基团相互作用，使外泌体优先水合。在冷冻过程的初始阶段，低温保护剂被选择性地排除在外泌体附近。这种溶质分子的排除增加了展开的自由能，从而有利于维持稳定的自然状态。二是低温保护剂的存在导致冷冻浓缩物的粘度增加，从而降低了分子的流动性，从而减缓了所有的动态过程。若外部条件不利于外泌体稳定性时，蛋白表面结合的低温保护剂更容易先被除去，这有利于天然蛋白构象的维持。

在本发明中，由于所述保护液既要在-80℃~5℃条件下冻存，又要适用于冻干，故玻璃化转变温度低的山梨糖醇和低温条件下易结晶的甘露醇被优先排除。此外，考虑到还原性糖易与外泌体中蛋白质上的伯胺基团发生美拉德反应，故乳糖排除在外。蔗糖、海藻糖是一种天然的、无毒的糖，被生物医药行业广泛用作蛋白质稳定剂和低温保护剂。并且其高的玻璃化转变温度可最大程度地降低分子的迁移率，同时通过充当良好的“水代用品”，从而保持干燥状态下的自然状态是冻干保护剂的两个关键属性。故本发明采用海藻糖或蔗糖作为低温保护剂。

本发明中，所述糖类赋形剂更优选为海藻糖，相比于蔗糖，海藻糖在不同的干燥或失水过程中，包括冷冻干燥，海藻糖可轻易地干燥为非晶体材料，并具有高玻璃态转变温度（Tg＞100°C），有利于提供体系的玻璃化转变温度，从而提供产品储存过程中的稳定性；海藻糖在pH＜5环境下不易发生水解；海藻糖低吸湿性，有利于冻干后样品的稳定；结合本发明中保护液即要用于冻存又要用于冻干，故优选海藻糖为低温保护剂。

本发明中，所述保护液中还包括氨基酸，氨基酸可以通过与外泌体上蛋白间的相互作用或水化作用稳定外泌体，具体情况需要根据氨基酸种类以及外泌体本身的特性决定。氨基酸通常与蔗糖或海藻糖一起使用，很少单独在冻干配方中使用。已有文献报导氨基酸的稳定作用低于传统的糖低温保护剂，且大量文献报道，氨基酸的加入可以增强糖的稳定作用，从而使其成为配方中合适的二级稳定剂；因此，本发明采用脯氨酸和盐酸精氨酸作为二级稳定剂。

在冻存或冻干产品的配方设计期间，必须考虑由于缓冲剂结晶引起的pH值变化。组氨酸在水溶液中呈碱性，可以作为pH调节剂。此外，组氨酸能结合如Cu²⁺和Fe²⁺等易催化抗体蛋白发生氧化修饰的离子，因此组氨酸还能起到抗氧化剂的作用，本发明选择组氨酸作为pH调节剂。

外泌体的吸附或结合可以发生在不同的界面上，例如，由于液体配方成分的混合而发生在气-液界面上，以及在冻存或冻干过程中的冰-液或冰-空气界面上。在这种情况下，在配方中添加表面活性剂可以通过两种可能的机制来稳定外泌体：（1）表面活性剂分子在界面上的优先结合。因此，较小的表面活性剂分子竞争超过较大的外泌体，并结合到疏水表面。被吸附的表面活性剂分子在界面上形成一层涂层，防止了外泌体的吸附。（2）表面活性剂与外泌体上蛋白或糖基相互作用，形成表面活性剂-外泌体复合物，阻止外泌体进一步的相互作用。制剂中常用的表面活性剂是非离子型表面活性剂，因此该类表面活性剂低毒性且对电解质不敏感，有利于外泌体的稳定。因此本发明采用波洛沙姆P188作为表面活性剂。

外泌体在保存过程中维持一定的渗透压，不仅是外泌体生存所必需，而且与保持外泌体内外水分平衡有关。在冻干产品的配方设计期间，必须考虑由于外界温度变化造成的制剂产品内部水分变化，引起外泌体内部渗透压的突然升高对其活性的影响。NaCl作为常用的渗透压调节剂之一，有研究表明甘油可调节细胞内外的渗透压，故本发明将NaCl和甘油合用作为渗透压调节剂。

基于上述分析，本发明根据外泌体的储存需求和产品本身特性出发，设计了一种适用于外泌体的多组分保护液，其中包括糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠。经过设计调整各个辅料的浓度和比例，使其在保存外泌体中能够发挥稳定保存的功效。

优选地，所述保护液中各组分按浓度计包括：5-8% w/v糖类赋形剂、0.1-0.4% w/v泊洛沙姆P188、0.01-0.15% w/v甘油、0.1-1.0 mg/mL组氨酸、5-20 mg/mL盐酸精氨酸、5-25mg/mL脯氨酸和0.1-1.5 mg/mL氯化钠。

其中，“5-8% w/v糖类赋形剂”例如可以是5% w/v、6% w/v、7% w/v或8% w/v等。

“0.1-0.4% w/v泊洛沙姆P188”例如可以是0.1% w/v、0.2% w/v、0.3% w/v或0.4%w/v等。

“0.01-0.15% w/v甘油”例如可以是0.01% w/v、0.03% w/v、0.05% w/v、0.07% w/v、0.09% w/v、0.1% w/v、0.13% w/v或0.15% w/v等。

“0.1-1.0 mg/mL组氨酸”例如可以是0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL等。

“5-20 mg/mL盐酸精氨酸”例如可以是5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL或20 mg/mL等。

“5-25 mg/mL脯氨酸”例如可以是5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL或25mg/mL等。

“0.1-1.5 mg/mL氯化钠”例如可以是0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.3 mg/mL或1.5 mg/mL等。

优选地，所述保护液中各组分按浓度计包括：6-7% w/v糖类赋形剂、0.2-0.3% w/v泊洛沙姆P188、0.05-0.1% w/v甘油、0.2-0.8 mg/mL组氨酸、10-15 mg/mL盐酸精氨酸、10-15 mg/mL脯氨酸和0.5-1 mg/mL氯化钠。

优选地，所述保护液的pH为6.5-8.0，例如可以是6.5、7、7.5或8等，优选为7-7.5。

优选地，所述保护液的渗透压为250-500 mOsm/kg，例如可以是250 mOsm/kg、300mOsm/kg、350 mOsm/kg、400 mOsm/kg、450 mOsm/kg或500 mOsm/kg等，优选为280-400mOsm/kg。

优选地，所述保护液的使用温度为-80℃~25℃，例如可以是-80℃、-50℃、-20℃、0℃或25℃等。

本发明中，所述保护液可作为冻存液（-80℃~5℃）也可作为冻干保护剂（5℃~25℃），并且温度适用范围广，无论是在冷藏、冻存还是冻干中，均可以对外泌体起到保护作用。

第二方面，本发明提供一种外泌体组合物，所述组合物中包括第一方面所述的外泌体保护液和外泌体。

本发明中，所述外泌体保护液可用于制备外泌体药物，采用所述外泌体保护液对外泌体原液进行超滤换液，获得外泌体药物组合物；相比于其他的保护液，本发明所述外泌体保护液具有更广的适用温度和稳定性。

本发明中，所述保护液可适用于对不同来源外泌体样品进行冻存或者冻干，包括不仅限于：HEK293表达外泌体、干细胞来源外泌体或工程化外泌体等。

第三方面，本发明提供第一方面所述的外泌体保护液在制备含外泌体的药物中的应用。

本发明中，所述外泌体保护液中各项辅料均具有药用资质，不仅局限于实验室科学研究，还可用于药学研究进行临床申报。

第四方面，本发明提供第一方面所述的外泌体保护液在外泌体储存中的应用。

本发明中，所述保护液能提高外泌体的稳定性和完整性，减少外泌体聚集，提高EV上目标蛋白的稳定性，且所用的各项辅料均具有药用资质，在临床上具有重要的应用价值。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种药用级别的外泌体保护液，所述保护液适用于不同来源外泌体，即可作为冻存液也可作为冻干保护剂，适用的温度范围广，包括-80℃~25℃，所述保护液能够降低外泌体储存运输成本，扩大外泌体适用范围；使用上述体保护液能够提高外泌体在储存中的稳定性和保持外泌体的完整性功效，还具有减少外泌体聚集的功效，提高EVs上目标蛋白的稳定性。

附图说明

图1是外泌体在PBS溶液中颗粒浓度变化情况。

图2是外泌体在PBS溶液中总蛋白变化情况。

图3是不同pH下的HPLC结果。

图4是不同pH下的Zeta电位结果。

图5是不同pH下的PSD结果。

图6是冻干前后样品的渗透压。

图7是冻干前后样品的颗粒浓度。

图8是冻干前后样品有膜颗粒占比。

图9是冻干前后样品HPLC-SEC。

图10是冻融后颗粒浓度和HPLC-SEC收率。

图11是EVs的颗粒浓度检测结果。

图12是EVs的阳性占比检测结果。

图13是EVs的HPLC-SEC检测结果。

图14是IL12 EVs的颗粒浓度检测结果。

图15是IL12 EVs的BCA检测结果。

图16是IL12 EVs的HPLC-SEC检测结果。

图17是IL12 EVs的含量检测结果。

图18是IL12 EVs的活性检测结果。

图19为IL12 EVs的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱。

图20为IL12 EVs的260 nm紫外吸收光谱。

图21为IL12 EVs的280 nm紫外吸收光谱。

图22是IL12 EVs在-80℃~5℃条件下冻存3个月的检测结果。

图23是IL12 EVs冻存3个月的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱。

图24是IL12 EVs冻存3个月的260 nm紫外吸收光谱。

图25是IL12 EVs冻存3个月的280 nm紫外吸收光谱。

图26是IL12 EVs冻存3个月的电镜图。

图27是IL12 EVs冻干前后的颗粒浓度、阳性率和膜完整性。

图28是IL12 EVs冻干前后的含量和活性。

图29是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的阳性率和膜完整性检测结果。

图30是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的含量和活性检测结果。

图31是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱。

图32是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的260 nm紫外吸收光谱。

图33是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的280 nm紫外吸收光谱。

图34是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的电镜图。

图35是低中高浓度IL12 EVs的冻干外观图。

图36是低中高浓度IL12 EVs冻干前后颗粒浓度。

图37是低中高浓度IL12 EVs冻干前后粒径分布。

图38是低中高浓度IL12 EVs冻干前后阳性率和膜完整性检测结果。

图39是低中高浓度IL12 EVs冻干前后含量和活性。

图40是中高浓度IL12 EVs冻干前后的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱。

图41是中高浓度IL12 EVs冻干前后的260 nm紫外吸收光谱。

图42是中高浓度IL12 EVs冻干前后的280 nm紫外吸收光谱。

图43是低浓度IL12 EVs冻干前后电镜。

图44是中浓度IL12 EVs冻干前后电镜。

图45是高浓度IL12 EVs冻干前后电镜。

图46是huMSC Evs在-80℃~5℃存放6个月的检测结果。

图47是huMSC EVs冻干5℃~25℃存放6个月的检测结果。

图48是293F EVs冻融后样品收率。

图49是不同粒径的颗粒浓度分布图。

图50是冻融后粒径分布图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

保存液中组分种类及用量考察

本实施例提供一种外泌体保存液，并对所述保存液中各组分的用量进行考察。保存液中各组分的来源和药用资质如表1所示：

表1

所述外泌体保存液的组成配方如表2所示，外泌体保存液的pH、渗透压结果如表3所示。

表2

表3

通过表3的数据可以看出，本发明制备的外泌体保存液的pH、渗透压均在可接受范围内（pH为6.5-8、渗透压在250 mOsm/kg-500 mOsm/kg）。综上所述，保存液组分和用量分别为：海藻糖或蔗糖用量为5-8%w/v，优先选择海藻糖，泊洛沙姆用量为0.1-0.4% w/v、甘油用量为0.01-0.15% w/v、氯化钠用量为0.1-1.5 mg/mL、组氨酸用量为0.1-1.0 mg/mL、脯氨酸用量为5-25 mg/mL、盐酸氨酸用量为5-20 mg/mL。

对比例1

外泌体（EVs）在PBS溶液中-80℃条件下的稳定性考察

本对比例考察外泌体（EVs）在PBS溶液中-80℃条件下储存3个月的稳定性。以颗粒浓度、总蛋白含量（BCA）为检测指标，考察样品放置3个月的变化情况。结果见图1、图2；图1是外泌体在PBS溶液中颗粒浓度变化情况，图2是外泌体在PBS溶液中总蛋白变化情况。

图1、图2的结果表明：外泌体在PBS溶液中-80℃放置7天，颗粒浓度收率为19%，总蛋白浓度为36%，继续放置至3个月，颗粒浓度呈继续下降趋势，总蛋白浓度无显著变化。说明外泌体在PBS溶液中-80℃条件下放置7天不稳定。

实施例2

保存液pH范围的筛选

本实施例对外泌体保存液的pH范围进行考察，考察不同pH值对外泌体（EVs）影响。以HPLC-SEC、粒径分布（PSD）、Zeta电位为检测指标。

具体实验方法如下所示：

1）配制外泌体溶液（外泌体原液与保存液采用超滤换液方式配制而成，置换率95%），使用NaOH/HCl调节外泌体溶液中pH在6.5-8.0范围内。

2）检测不同pH条件下的荧光吸光度（HPLC-SEC检测）、Zeta电位和粒径分布（PSD，NAT测）。

3）考察不同pH条件下外泌体冻融前后稳定性。

结果见图3、图4、图5。图3是不同pH下的HPLC结果，图4是不同pH下的Zeta电位结果、图5是不同pH下的PSD结果。

以上结果表明：pH值在6.5-8.0范围内的外泌体的HPLC-SEC结果冻融前后无显著变化。Zeta电位均在-14mV~-13mV范围内，颗粒粒径D10、D50、D90无显著区别。故选择保存液的pH范围为6.5-8.0。

实施例3

保存液摩尔渗透压范围的筛选

本实施例对外泌体保存液的渗透压范围进行考察。考察250 mOsm/kg-620 mOsm/kg渗透压对外泌体（EVs）影响，以摩尔渗透压、颗粒浓度、有膜颗粒占比、HPLC-SEC为检测指标。

具体实验方法如下所示：

1）配制外泌体溶液（外泌体原液与保存液以1：10体积比混合而成），在外泌体溶液中添加不同浓度NaCl调整料液渗透压作为实验组，3个实验组分别为250 mOsm/kg、480mOsm/kg、620 mOsm/kg，1个对照组为480 mOsm/kg（不添加NaCl）。

2）对上述样品进行冻干。

3）检测冻干前后样品的渗透压、颗粒浓度、有膜颗粒占比、HPLC-SEC。

结果见图6、图7、图8、图9。图6是冻干前后样品的渗透压，图7是冻干前后样品的颗粒浓度，图8是冻干前后样品有膜颗粒占比，图9是冻干前后样品Ex 556 nm/ Em 573 nm荧光吸光度（HPLC-SEC测）。

以上结果表明：虽然组内冻干前后的样品的渗透压、有膜颗粒、颗粒浓度、HPLC-SEC有显著差异，但是组间不同渗透压对样品的影响没有显著区别。考虑所述外泌体保护液也可用于静脉注射，从安全角度考察，故选择保存液的渗透压范围为250 mOsm/kg-500mOsm/kg。

实施例4

本实施例提供了一系列不同组分配比的外泌体保存液，并对所述外泌体保存液的渗透压、pH进行检测，并验证其是否适合于外泌体储存。表4为保存液12-22的组分配比，表5为保存液12-22的检测结果。

表4

表5

通过表5的数据可以看出，即使单一组分用量在上述保护液的范围内，但是最终配方的pH和渗透压也并非在可接受范围内（pH为6.5-8、渗透压在250 mOsm/kg-500 mOsm/kg）。说明本发明中的保存液并非单一成分在起到维持pH和渗透压的作用，而是多个组分共同作用的结果。

通过保存液1和保存液13-22的对比可知，缺少糖类赋形剂、泊洛沙姆P188、甘油、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸或氯化钠中任意一种或其组合，得到的保存液均难以满足pH和渗透压的要求。

本实施例还对超出本专利组合物保护范围的用量进行了考察，检测渗透压和pH，并验证其是否适合于外泌体储存。表6为保存液23-28的组分配比，表7为保存液23-28的检测结果。

表6

表7

通过表6和表7的数据可以看出，外泌体保存液中各组分的用量范围对pH和渗透压的具有较大的影响，当其使用量超过一定的范围，其pH和渗透压不能满足保存外泌体的要求。

测试例1

根据上述实施例确定的各组分及用量，设计不同配比的处方制备保存液29-30，不同组分的配比见表8，考察各保存液的渗透压、pH，结果见表9。

表8

表9

并使用上述2种保存液分别对EVs超滤换液，换液之后进行冻融考察。冻融实验参数：-40℃放置2小时冻存，20℃放置1小时融化，循环6次。考察该冻融条件下不同保存液对EVs的颗粒浓度和HPLC-SEC的影响，结果见图10，图10是冻融后颗粒浓度和HPLC-SEC（Ex280 nm/ Em 573 nm）收率。

通过表9和图10的数据可以看出，保存液29和30均在本发明要求的pH、渗透压的可接受范围内（pH为6.5-8、渗透压在250 mOsm/kg-500 mOsm/kg），进一步对比样品冻融前后颗粒浓度和HPLC-SEC收率可以看出，保存液29的颗粒浓度和HPLC-SEC收率均优于保存液30。通过上述实验表明，即使pH、渗透压在可接受范围内，但是相比于保存液30，保存液29在储存外泌体的过程中更具有优势，进一步说明本发明中各组分缺一不可。

测试例2

根据上述确定的各组分及用量，制备保存液31-33，不同组分的配比见表10，考察各保存液的渗透压、pH，结果见表11。

表10

表11

使用上述3种保存液分别对EVs超滤换液，换液之后进行冻融考察。冻融实验参数：-40℃放置2小时冻存，20℃放置1小时融化，循环6次。考察冻融条件下不同保存液对EVs的颗粒浓度、阳性率和HPLC-SEC的影响，结果见图11-13。图11是EVs的颗粒浓度检测结果，图12是EVs的阳性占比检测结果，图13是EVs的HPLC-SEC（Ex 280 nm/ Em 573 nm）检测结果。

通过表11和图11-13的数据可以看出，保存液31、32、33均在本发明要求的pH、渗透压的可接受范围内（pH为6.5-8、渗透压在250 mOsm/kg-500 mOsm/kg），进一步对比样品冻融前后颗粒浓度、阳性率和HPLC-SEC收率可以看出，保存液31样品冻融前后的颗粒浓度、阳性率和HPLC-SEC收率最高，均优于原液、保存液32、保存液33。上述结果表明保存液的组分之间具有协调增效作用，在缺少其中任意一种后，其保存效果减弱。

实施例5

hIL12 EVs在保存液中的冻融考察

1）根据上述实施例确定的保存液各组分及用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对hIL12 EVs超滤换液，换液之后对EVs+PBS（对照组）、EVs+保存液两份样品分别进行冻融考察。冻融实验参数：-40℃放置2小时冻存，20℃放置1小时融化，循环6次。考察冻融条件下保存液3对hIL12 EVs的颗粒浓度、BCA、HPLC-SEC的影响。结果见图14-16。图14是IL12 EVs的颗粒浓度检测结果，图15是IL12 EVs的BCA检测结果，图16是IL12 EVs的HPLC-SEC（Ex 280nm/ Em 573 nm）检测结果。

结果表明：hIL12外泌体在PBS溶液中冻融条件下，颗粒浓度、BCA、荧光吸光度均显著降低。hIL12外泌体在保存液3中，颗粒浓度、BCA、荧光吸光度均无显著改变。说明IL12外泌体在保存液3中冻融更稳定。

2）另外对EVs+保存液3的样品进行冻融前后IL12含量和细胞活性EC50检测。结果见图17-18，图17是IL12 EVs的含量检测结果，图18是IL12 EVs的活性检测结果。

结果表明：hIL12 EVs在冻融后的IL12含量收率为97.6%，活性收率为92%。说明IL12外泌体在保存液3中冻融前后的含量和活性几乎不受影响。

3）EVs+保存液3样品的HPLC-SEC检测的荧光图谱和紫外图谱见图19-21，图19为IL12 EVs在Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱，图20为IL12 EVs在260 nm紫外吸收光谱，图21为IL12 EVs在280 nm紫外吸收光谱。

结果表明：（1）在Ex 280 nm/Em 573 nm荧光图谱中，冻融前后样品主峰面积几乎不变，除主峰外，未有其它显著杂质峰。（2）在280 nm和260 nm紫外图谱中外泌体原液只在9min出现主峰，未见其它杂质峰；冻融前后空白缓冲液均在18 min出峰，无显著区别；含外泌体样品（包括换液后、冻融前、冻融后）均出现9 min主峰，18 min、20 min杂质峰，其中18min峰面积与缓冲液的无显著区别，说明由缓冲液本身引入；与原液对比，20 min峰由换液产生，另外冻融前后峰面积没有显著变化。

综上所述，IL12外泌体在保存液3中冻融前后的荧光和紫外吸收光谱无显著变化。

实施例6

hIL12 EVs在保存液中的冻存稳定性

本实施例对保存液的冻存稳定性进行了验证，方法包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对hIL12 EVs超滤换液。换液之后对EVs+保存液3样品分别进行于5℃、-20℃、-80℃冻存。考察hIL12 EVs在保存液3中冻存3个月的稳定性，以阳性率、膜完整性、含量、活性、HPLC-SEC和电镜为检测指标。结果见图22-26，图22是IL12 EVs在-80℃~5℃条件下冻存3个月的阳性率、膜完整性、含量和活性检测结果；图23是IL12 EVs在5℃条件下冻存3个月的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱；图24是IL12 EVs在5℃条件下冻存3个月的260 nm紫外吸收光谱；图25是IL12 EVs在5℃条件下冻存3个月的280 nm紫外吸收光谱；图26是IL12 EVs在-80℃~5℃条件下冻存3个月的电镜图。

结果表明：（1）IL12 EVs在5℃条件下放置90天，阳性率收率为75%、有膜颗粒占比收率为75%，含量收率为80%，活性收率为95%。（2）HPLCE-SEC检测的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱主峰收率为128%，未出现显著杂质峰；280 nm紫外吸收光谱主峰收率为89%，另外两个杂质峰稍有增长，未出现其它杂质；260 nm与280 nm图谱相似。（3）电镜图中可见许多较为完整、单个、未有明显团聚的外泌体。（4）IL12 EVs在5℃、-20℃、-80℃条件下放置90天的检测结果几乎无显著区别。说明IL12 EVs在保存液3中-80℃~5℃条件下能稳定存放3个月。

实施例7

hIL12 EVs在保存液中的冻干考察

本实施例对保存液冻干稳定性考察，包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对hIL12 EVs超滤换液。换液之后对EVs+保存液3样品分别进行冻干稳定性考察。考察冻干条件下保存液对hIL12 EVs的外观、颗粒浓度、阳性率、膜完整性、含量和活性的影响。结果见图27-28，IL12 EVs冻干后的样品外观为白色蓬松块状固体，外观圆整完好，图27是IL12 EVs冻干前后的颗粒浓度、阳性率和膜完整性，图28是IL12 EVs冻干前后的含量和活性。

结果表明：（1）hIL12 EVs在保存液3中的冻干后样品外观完好。（2）冻干前后的收率，颗粒浓度为99%、阳性率为85%、膜完整性为77%、含量为118%、活性为73%，均无显著下降，说明IL12外泌体可在保存液3中进行冻干保存。

实施例8

hIL12 EVs在保存液中的冻干稳定性

本实施例考察了hIL12 EVs冻干后于5℃~25℃存放情况。包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对hIL12 EVs超滤换液。换液之后进行冻干，对EVs+保存液3样品分别进行于25℃、5℃存放。考察hIL12 EVs在保存液3中冻干3个月的稳定性，以阳性率、膜完整性、含量、活性、HPLC-SEC和电镜为检测指标。结果见图29-34。图29是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的阳性率和膜完整性检测结果；图30是IL12 EVs冻干后5℃~25℃存放3个月的含量和活性检测结果；图31是IL12 EVs冻干后在25℃条件下冻存3个月的Ex 280 nm/Em 573 nm荧光吸收光谱；图32是IL12 EVs冻干后在25℃条件下冻存3个月的260 nm紫外吸收光谱；图33是IL12 EVs冻干后在25℃条件下冻存3个月的280 nm紫外吸收光谱；图34是IL12 EVs在5℃~25℃条件下冻存3个月的电镜图。

结果表明：（1）IL12 EVs冻干后在25℃条件下放置90天，阳性率收率为64%、有膜颗粒占比收率为81%，含量收率为81%，活性收率为94%。（2）HPLCE-SEC检测的Ex 280 nm/Em573 nm荧光吸收光谱主峰收率为129%，未出现显著杂质峰；280 nm紫外吸收光谱主峰收率为98%，另外两个杂质峰稍有增长，未出现其它杂质；260 nm与280 nm图谱相似。（3）电镜图中可见许多较为完整、单个、未有明显团聚的外泌体。（4）IL12 EVs在25℃、5℃条件下放置90天的检测结果几乎无显著区别。说明IL12 EVs在保存液3中冻干后5℃~25℃条件下能稳定存放3个月。

实施例9

不同浓度hIL12 EVs在保存液中的冻干考察

本实施例考察了不同浓度hIL12 EVs在保存液中冻干后外泌体膜完整性。包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对hIL12 EVs超滤换液。换液之后，使用保存液3对其进行稀释，稀释后IL12含量分别为3 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL进行冻干稳定性考察。考察冻干条件下保存液对hIL12 EVs的外观、颗粒浓度、粒径分布、阳性率、膜完整性、含量、活性、电镜的影响。结果见图35-45，图35是低中高浓度IL12 EVs冻干前后的外观图；图36是低中高浓度IL12 EVs冻干前后颗粒浓度，图37是低中高浓度IL12 EVs冻干前后粒径分布，图38是低中高浓度IL12 EVs冻干前后阳性率和膜完整性，图39是低中高浓度IL12 EVs冻干前后含量和活性，图40是中高浓度IL12 EVs冻干前后HPLC-SEC Ex 280nm/Em 573 nm荧光吸收光谱，图41是中高浓度IL12 EVs冻干前后的260 nm紫外吸收光谱，图42是中高浓度IL12 EVs冻干前后的280 nm紫外吸收光谱。图43是低浓度IL12 EVs冻干前后电镜，图44是中浓度IL12 EVs冻干前后电镜，图45是高浓度IL12 EVs冻干前后电镜。

结果表明：（1）低中高浓度hIL12 EVs在保存液3中冻干后外观完好，无显著缺陷。（2）三个浓度的样品冻干后颗粒浓度、粒径分布几乎不变。（3）三个浓度的样品冻干后阳性率收率为85%-97%，膜完整性几乎不变。（4）三个浓度的样品冻干后含量收率为86%-94%，冻干后活性收率为71%-77%。（5）在Ex 280 nm/Em 573 nm荧光图谱中，除9 min主峰外，未有其它显著杂质峰。280 nm、260 nm紫外图谱中，所有样品均在18 min、20 min出现杂质峰，未见其它杂质峰。（6）低中高浓度hIL12 EVs在保存液3中冻干后均可见较为完整外泌体。说明低中高三个浓度的IL12外泌体均可在保存液3中进行冻干保存。

实施例10

huMSC EVs在保存液中的冻存稳定性

本实施例考察了huMSC EVs在-80℃~5℃的冻存效果，包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对huMSC EVs超滤换液。换液之后对EVs+保存液3样品分别进行于5℃、-20℃、-80℃冻存。考察huMSC EVs在保存液3中冻存6个月的稳定性，以颗粒浓度、BCA、pH和渗透压为检测指标。结果见图46。图46是huMSC EVs在-80℃~5℃存放6个月的检测结果。

结果表明：（1）huMSC EVs在5℃条件下放置6个月，颗粒浓度收率为84%、BCA收率为107%；pH较0天的7.16，6个月为7.31；渗透压较0天的392，6个月为412 mOsm/kg。（2）huMSCEVs在5℃、-20℃、-80℃条件下放置6个月的检测结果几乎无显著区别。综上所述，huMSCEVs在保存液3中-80℃~5℃条件下能稳定存放6个月。

实施例11

huMSC EVs在保存液中的冻干稳定性

本实施例考察了huMSC EVs在5℃~25℃冻干的稳定性。包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对huMSC EVs超滤换液。换液之后进行冻干，对EVs+保存液3样品分别进行于25℃、5℃存放。考察huMSC EVs在保存液3中冻干6个月的稳定性，以颗粒浓度、BCA、pH、渗透压、水分和不溶性微粒为检测指标，结果见图47。图47是huMSC EVs 冻干5℃~25℃存放6个月的检测结果。

结果表明：（1）huMSC EVs冻干后在25℃条件下放置6个月，颗粒浓度收率为95%、BCA收率为100%；pH较0天的7.24，6个月为7.19；渗透压较0天的387 mOsm/kg，6个月为394mOsm/kg；放置6个月样品含水量为1.64%；不溶性微粒无显著增长，远小于药典标准（2020版中国药典<0903不溶性微粒检测法>规定：标示量为100 mL以下的静脉注射液、静脉无菌粉末除另有规定外，每个供试品容器中含10 μm及10 μm以上的微粒数不超过6000粒，含25 μm及25 μm以上的微粒数不超过600粒。）。（2）huMSC EVs在25℃、5℃条件下放置6个月的检测结果几乎无显著区别。综上所述，huMSC EVs在保存液3中冻干后在5℃~25℃条件下能稳定存放6个月。

实施例12

293F EVs在保存液中的冻融考察

本实施例考察了293F EVs在保存液中的冻融情况。包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对293F EVs超滤换液。换液之后对EVs+保存液样品进行冻融考察。冻融实验参数：-40℃放置2小时冻存，20℃放置1小时融化，循环6次。考察冻融条件下保存液3对293F EVs的颗粒浓度、BCA、HPLC-SEC的影响。结果见图48，图48是293F EVs冻融后样品收率。

结果表明：293F外泌体在在保存液3中冻融后颗粒浓度、有膜颗粒占比、HPLC-SEC收率分别为87%、72%、123%，说明293F外泌体在在保存液3中多次冻融稳定。

实施例13

外泌体抗团聚考察1

本实施例考察了EVs的抗团聚吸附情况。包括以下步骤：

1）取2 mL EP管加入1.5 mL反应体系，加入75 μL的1 mg/mL的ConA PBS（凝集素）溶液于1.4 mL EVs中，混合均匀，剩余用PBS补齐。

2）取2 mL EP管加入1.5 mL反应体系，使用保存液3对1.4 mL 293 EVs超滤换液，再加75 μL的1 mg/mL的ConA PBS溶液，剩余用PBS补齐。

3）室温放置30 min，放入5℃冰箱3 h后进行检测。结果见图49和表12。图49是不同粒径的颗粒浓度分布图。

表12

结果表明：1）ConA和保存液本身不影响外泌体原液颗粒浓度检测；2）外泌体原液加入ConA（凝集素）前后不同粒径的颗粒浓度分布和D90均发生显著变化，说明ConA可促进外泌体聚集。3）外泌体原液加入保存液后再加入ConA颗粒浓度分布图和D90无显著变化，说明保存液具有抗团聚作用。

实施例14

外泌体抗团聚考察2

本实施例考察了EVs的抗团聚吸附情况。包括以下步骤：

根据以上组分用量，制备保存液3，调pH至6.5-8.0，对EVs超滤换液。换液之后进行冻融考察。冻融实验参数：-80℃冻存15 min，室温复溶，为冻融1次，循环10次。检测样品粒径分布情况，结果见图50。图50是冻融后粒径分布图。

结果表明：外泌体在PBS中冻融后部分颗粒的粒径由129 nm增长至624 nm，外泌体在保护液中大部分粒径在302 nm，说明该保存液具有一定抗团聚作用。

综上所述，本发明提供了一种药用级别的外泌体保护液，所述保护液适用于不同来源外泌体，并且即可作为冻存液也可作为冻干保护剂，在外泌体储存中具有重要的应用价值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种外泌体保护液，其特征在于，所述保护液由糖类赋形剂、甘油、泊洛沙姆P188、组氨酸、盐酸精氨酸、脯氨酸和氯化钠组成；

所述保护液中各组分按浓度计由5-8% w/v糖类赋形剂、0.1-0.4% w/v泊洛沙姆P188、0.01-0.15% w/v甘油、0.1-1.0 mg/mL组氨酸、5-20 mg/mL盐酸精氨酸、5-25 mg/mL脯氨酸和0.1-1.5 mg/mL氯化钠组成。

2.根据权利要求1所述的外泌体保护液，其特征在于，所述糖类赋形剂选自海藻糖和/或蔗糖。

3.根据权利要求2所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液中各组分按浓度计由6-7% w/v糖类赋形剂、0.2-0.3% w/v泊洛沙姆P188、0.05-0.1% w/v甘油、0.2-0.8 mg/mL组氨酸、10-15 mg/mL盐酸精氨酸、10-15 mg/mL脯氨酸和0.5-1 mg/mL氯化钠组成。

4.根据权利要求3所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液的pH为6.5-8.0。

5.根据权利要求4所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液的渗透压为250-500mOsm/kg。

6.根据权利要求5所述的外泌体保护液，其特征在于，所述保护液的使用温度为-80℃~25℃。

7.一种外泌体组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1-6中任一项所述的外泌体保护液和外泌体。

8.权利要求1-6中任一项所述的外泌体保护液在制备含外泌体的药物中的应用。

9.权利要求1-6中任一项所述的外泌体保护液在外泌体储存中的应用。