CN117100871A - 一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用 - Google Patents
一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用，其包括：吐温‑80、L‑组氨酸和海藻糖，其重量比为1：15～30：50～75。本发明的医用级储存制剂可以减少冷冻和冻干状态下对外泌体生物学活性的破坏，提高其结构的稳定性，有显著提高外泌体生物活性治疗有效性长期保持的能力，大大减低药物制剂量产中转的难度。
Description
技术领域
本发明涉及医疗用品领域，尤其涉及一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂、细胞外囊泡制剂及其制备方法，及它们的应用。
背景技术
细胞外囊泡是一种脂质分子膜包裹的小囊泡，直径约为70～160nm。外泌体来源于细胞核内体系统，由多囊泡体内陷腔化形成并通过多囊泡体与细胞膜融合而释放到细胞外环境中。外泌体包括脂质、膜、胞质蛋白以及microRNA等物质。这些成分使得外泌体成为细胞间通讯的重要途径。外泌体是旁分泌的一个重要组成部分，它提供了一种非传统非接触的长距离细胞间通讯方式，越来越多的实验证实，间充质干细胞通过旁分泌外泌体，促进表皮细胞的迁移和生长。除此以外，外泌体还具有免疫抑制的功能，能调节免疫细胞中各种炎症因子的分泌如白细胞介素IL-6/IL-10、肿瘤坏死因子TNF等，而又因其半衰期较长，可考虑作为临床疾病的无创或微创诊断手段，有效减少患者的痛苦，也可很方便的用于制备化妆品用于美容。
外泌体作为治疗试剂或药物递送载体有广泛的应用前景，但外泌体存储在-80℃将不利于其运输及应用，因此还需要其他存储方法。冻干是一种已用于保存多种类型的生物材料(蛋白质，血浆、活细胞等)的技术。此外，冻干技术已被用于改善药物递送载体脂质体的长期稳定性。因此，冻干技术有可能改善外泌体的保存稳定性，如果冻干的外泌体可以在室温条件下稳定保存，外泌体的应用范围则将会大大提升。
外泌体作为科研与产业转化的研究热点，其分离提取方法得到了相对充分的研发。但直接应用于医药注射、涂抹的外泌体缺乏一种有效保护其理化性质稳定、生物活性持续有效的储存制剂。在-20℃或-80℃冷冻保存用于治疗应用的外泌体保质期最多为一年。这限制了基于外泌体的疗法的可及性。
但如何选用医用级别的储存辅料，以解决临床上外泌体储存困难、活性保存困难、辅料毒性不可考的问题。因此需要一种保存外泌体的方案，使得在环境温度下长期储存时不仅保存其结构和生物化学完整性，还保存外泌体的治疗效力。
发明内容
技术问题
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，如何提供一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂、细胞外囊泡制剂及其制备方法。
本发明的医用级储存制剂可以减少冷冻和冻干状态下对外泌体生物学活性的破坏，提高其结构的稳定性，有显著提高外泌体生物活性治疗有效性长期保持的能力，大大减低药物制剂量产中转的难度，应用本发明的冻干保护制剂的外泌体产品在储存一段时间后仍保持不逊色于新鲜制剂的生发效果，可以有效保持外泌体的生物活性和治疗有效性。
解决方案
为解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂，包括：吐温-80、L-组氨酸和海藻糖，其重量比为1：15～30：50～75。
进一步地，所述吐温-80、L-组氨酸和海藻糖的重量比为1：18～25：60～75，可选地为1：18～22.5：60～75，可选地为2：45：150、1：20：60或3：55：200。
第二方面，提供一种细胞外囊泡制剂，包括外泌体和所述的医用级储存制剂。
进一步地，所述医用级储存制剂在冻干干燥前占体系的4～16.5w/v％，可选地为7～11w/v％，可选地为7.5～10.5w/v％，可选地为7.8～10.4w/v％。
进一步地，所述外泌体可以来源于间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)、HEK293、293T/17细胞、人类唾液、泪液或牛乳、植物茎叶提取物等动植物中的一种或几种；可选地，间充质干细胞为脐带或脂肪来源的间充质干细胞。
进一步地，外泌体在干燥前的体系中浓度为1×104～9×108个/mL，可选地为1×108～9×108个/mL，可选地为4×108～8×108个/mL，可选地为4.5×108～6.5×108个/mL，可选地为6×108～8×108个/mL。
进一步地，外泌体生物活性成分占干燥后体系质量分数的40～60％，可选地为50～55％。
第三方面，提供一种所述的细胞外囊泡制剂的制备方法，将外泌体溶液加入到第一方面所述的医用级储存制剂中。
进一步地，外泌体溶液中的外泌体含量为1×109～9×109个/mL，可选地为4×109～8×109个/mL，可选地为4.5×109～6.5×109个/mL。
进一步地，还包括冻干程序：将含有外泌体的医用级储存制剂进行冻干处理，可选地，可选地，冻干程序设定为-50至-20℃进行冻干处理。
进一步地，所述医用级储存制剂的溶液为水溶液，可选地，所述医用级储存制剂在冻干干燥前占体系的4～16.5w/v％，可选地为7～11w/v％，可选地为7.5～10.5w/v％，可选地为7.8～10.4w/v％。
进一步地，外泌体在干燥前的体系中浓度为1×104～9×108个/mL，可选地为1×108～9×108个/mL，可选地为4×108～8×108个/mL，可选地为4.5×108～6.5×108个/mL，可选地为6×108～8×108个/mL。
进一步地，外泌体生物活性成分占干燥后体系质量分数的40～60％，可选地为50～55％。
第四方面，提供一种第一方面所述的医用级储存制剂、第二方面所述的细胞外囊泡制剂或第四方面所述的制备方法制备的细胞外囊泡制剂在制备外泌体产品中的应用。
有益效果
(1)本发明的医用级储存制剂可以减少冷冻和冻干状态下对外泌体生物学活性的破坏，提高其结构的稳定性，有显著提高外泌体生物活性治疗有效性长期保持的能力，大大减低药物制剂量产中转的难度。
(2)本发明的医用级储存制剂，在外泌体从提取后即可以依照该方案制成可直接临床应用的药剂粉末，其以海藻糖和吐温-80作为外泌体冻干保护剂、L-组氨酸作为冻干缓冲液可以提高囊泡膜通透性，使得冻干保护剂能够快速通过囊泡膜，有利于冻干过程中对囊泡结构的保护可长时间保持其稳定性和生物治疗有效性。制备操作便捷，药理上无潜在致敏或毒素风险。有利于任何活性外泌体的产业研究或应用。
上述说明仅为本发明技术方案的概述，为了能够更清楚地了解本发明的技术手段并可依据说明书的内容予以实施，同时为了使本发明的上述和其他目的、技术特征以及优点更加易懂，以下列举一个或多个优选实施例，并配合附图详细说明如下。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明的测试例2中采用实施例1～5、对比例1～3制剂在外泌体冻干前和冻干储存复溶后的电镜图。其中，A、B分别为实施例1冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；C、D分别为实施例2冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；E、F分别为实施例3冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；G、H分别为实施例4冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；I、J分别为实施例5冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；K、L分别为对比例1冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；M、N分别为对比例2冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；O、P分别为对比例3冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；Q、R分别为对比例3冻干前、冻干复溶后的电镜状态图；
图2为本发明的测试例2中制剂外泌体冻干复溶后的电镜图。A组：添加实施例2外泌体冻干保护剂，冻干后即刻复溶。视野下多数外泌体单个形态完整，整体分布未见凝聚沉积现象。A组保存1周后、1个月后复溶扫描电镜下效果如图，部分出现凝聚形态分布不再均匀出现单体结构出现较大变化，整体仍旧保持均匀。B组：空白对照(未添加保护剂的外泌体溶液冻干后复溶)，显示视野内无完整外泌体结构，均崩解。
图3为本发明的测试例2中制剂应用于外泌体储存1个月后蛋白水平。
图4为本发明的测试例2应用实施例2冻干制剂常温储存第0到8周制剂复溶后粒子数水平变化趋势。
图5为本发明的测试例3中制剂应用于外泌体储存1个月后动物实验有效性效果展示。
图6为本发明的测试例5中使用经典的Western Blot对细胞外囊泡表面标志蛋白进行鉴定的鉴定结果。其中，A为采用实施例2的冻干保护剂对外泌体进行冻干保存复溶后与新鲜提取外泌体溶液的对比，使用Western Blot技术检测Hsp70、Tsg101和CD81(外泌体表面标志物)蛋白含量；B为实施例1、2、3中冻干制剂常温储存1个月后复溶标志蛋白检测情况，使用Western Blot检测不同储存制剂中Tsg101、CD9和CD81对(外泌体表面标志物)蛋白含量，以完整UC-MSC细胞为对照。
图7为本发明的测试例5中使用不同糖类的实施例2和对比例3冻干制剂外观形态。
图8为本发明的测试例5中使用不同糖类的实施例2和对比例3冻干外泌体制剂复溶后的电镜下形态；其中，A为使用实施例2制备的外泌体冻干制剂复溶后的电镜下形态；B为使用对比例3制备的外泌体冻干制剂复溶后的电镜下形态。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
上述医用级储存制剂为外泌体的储存和运输提供了新的选择。下面通过实施例来进一步说明本发明，但是本发明并不因此而受到任何限制。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
以下实施例中，各原料均为商购。
以下实施例中，一些生物材料均是商购，脐带来源间充质干细胞购自济南万泉生物技术有限公司。
一、外泌体提取
1.1细胞培养
1)取脐带来源间充质干细胞细胞P2复苏并使用专门细胞培养基(NuwacellncMission hMSC Medium V30，中盛溯源RP02010)进行培养；
2)稳定传代培养，同时观察细胞状态。待p4代细胞融合度达到目标要求(85％～95％)时对细胞培养上清进行以下处理：
1.2预处理
1)取1.1步骤2)的培养上清，300g离心10min，收集上清液，弃沉淀；
2)取1.2步骤1)的上清液，2000g离心20min，收集上清液，弃沉淀；
3)取1.2步骤2)的上清液，10000g离心30min，收集上清液，弃沉淀；
4)使用1.2步骤3)的上清液使用0.88微米滤杯进行负压过滤，获得过滤液。
1.3外泌体浓缩提取
1)取1.2的步骤4)的过滤液进行TFF浓缩并进一步去除杂质；
2)取1.3步骤1)的预处理的过滤液，300g 4℃离心10min；
3)取1.3的步骤2)的上清，2000g 4℃离心10min；
4)取1.3的步骤3)的上清，10000g 4℃离心30min；
5)取1.3的步骤4)的上清于0.22μm滤膜过滤后过滤液中加入PEG溶液(PEG终浓度8％+0.5M NaCl)，4℃孵育过夜；
6)取1.3的步骤5)的过滤液浓缩液，10000g 4℃离心30min，弃上清，用DPBS重悬外泌体。
二、外泌体储存液的制备
实施例1
按如下比例配制实施例1外泌体储存液体：
表1实施例1冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、L-组氨酸、海藻糖的重量比例为2：45：150。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
实施例2
按如下比例配制实施例2外泌体储存液体：
表2实施例2冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、L-组氨酸、海藻糖的重量比例为1：20：60。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
实施例3
按如下比例配制实施例3外泌体储存液体：
表3实施例3冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、L-组氨酸、海藻糖的重量比例为3：55：200。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
实施例4
按如下比例配制实施例4外泌体储存液体：
表4实施例4冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、L-组氨酸、海藻糖的重量比例为1：25：75。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
实施例5
按如下比例配制实施例5外泌体储存液体：
表5实施例5冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、L-组氨酸、海藻糖的重量比例为1：20：60。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
对比例1
按如下比例配制对比例1外泌体储存液体：
表6对比例1冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、甘氨酸、海藻糖的重量比例为1：20：60。
制剂配制完成后充分混匀，以1ml/支分装于3ml容积西林瓶中。置于-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
对比例2
按如下比例配制对比例2外泌体储存液体：
表7对比例2冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、海藻糖的重量比例为1：60。
对比例3
按如下比例配制对比例3外泌体储存液体：
表8对比例3冻干保护剂配制方案
其中，有效冻干保护剂中的吐温-80、甘氨酸、海藻糖的重量比例为1：20：60。
外泌体储存液的制备：
1)将1.3中提取的外泌体提取液100μl，加入900μl无菌超纯水中，充分混匀为1ml试剂B，使得终溶液中外泌体粒子数约为6×109个/mL；
2)将上述(实施例或对比例)的试剂A在无菌超纯水中溶解，随后定容至9ml；
3)将1ml步骤1)的试剂B加入至步骤2)的试剂A中，总体积为10ml，充分混匀标本以1ml/瓶分装至西林瓶中。
将上述外泌体储存液进行冻干，冻干程序见下表9：
表9临床级保护剂冻干程序
| 段号 | 目标温度 | 升温分钟 | 目标真空 | 恒温小时 |
| 1 | -45 | 2 | N/A | 5 |
| 2 | -35 | 20 | 0 | 4 |
| 3 | -20 | 30 | 0 | 8 |
| 4 | -10 | 0 | 0 | 5 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 6 | 10 | 0 | 15 | 3 |
| 7 | 20 | 0 | 15 | 99 |
复溶方法为：1ml/支外泌体冻干粉末可在使用前使用1ml无菌超纯水进行复溶，尽量保证该步骤在治疗前进行，现用现配。
测试例2、外泌体镜下形态、蛋白及粒子保存率检测
1、取实施例、对比例冻干制剂样品各5份，按下述步骤处理后1份用于镜下形态观察、1份用于粒子保存率检测，其余3份作为技术重复进行蛋白保存率检测样品。
2、避光干燥密封储存，使用扫描电镜进行放大倍数下拍照观察形态，观察储存前和冻干储存一个月复溶后的外泌体的形态，结果如表10、图1、2所示，结果表明，采用本发明实施例2的冻干保护剂能够保持外泌体整体均为完整。
3、冰上操作。每份制剂加入1ml蛋白裂解液进行蛋白定量(BCA)检测，检测储存前和冻干储存一个月复溶后的的外泌体的外泌体内的蛋白含量，结果如表10、图3所示。
4、使用Nano FCM对冻干制剂复溶液进行粒子数检测，检测方法参考福流生物纳米流式检测仪说明书，检测储存前和冻干储存复溶后的的外泌体的外泌体内的外泌体粒子数，结果如表10、图4所示。
表10各实施例的外泌体镜下形态、蛋白及粒子保存率检测结果
结果表明，实施例1～3储存前后的蛋白含量差异较小，外泌体粒子数的差异较小，说明在冻干程序中有效保护了外泌体的活性，优于实施例4、5和对比例1～3。
测试例3、生物活性检测结果
生物活性检测方法：以实施例2制备的外泌体冻干制剂复溶进行生发效果检测，检测方法为，将雄性激素型脱发模型小鼠背部毛发在生发周期开始前剔除，随后每天给予1支应用实施例2的外泌体冻干制剂复溶液进行5点位皮内注射，通过连续观察拍照背部毛发验证产品生发效果,结果如图5所示，结果表明应用实施例2的外泌体冻干制剂在货架期内(4℃储存3个月)保持良好的生物有效性。
测试例4、治疗有效性长期保持的能力
干细胞来源外泌体储存于冻干保护剂后，储存于4℃、3个月后进行脱发小鼠治疗。小鼠以小鼠背部毛发新生面积作为检测指标，以休止期背部皮肤颜色去除背景干扰后，统计深染区域占脱发区域百分比具体实验设计思路及统计方法可参考文献Fu D,Huang J,LiK,Chen Y,He Y,Sun Y,Guo Y,Du L,Qu Q,Miao Y,Hu Z.Dihydrotestosterone-inducedhair regrowth inhibition by activating androgen receptor in C57BL6 micesimulates androgenetic alopecia.Biomed Pharmacother.2021May；137:111247.doi:10.1016/j.biopha.2021.111247.Epub 2021Jan 29.PMID:33517191。
表11各实施例的治疗有效性长期保持的能力
结果表明，相对实施例4、5和对比例，实施例1～3制备的外泌体冻干制剂具有更好的治疗有效性长期保持的能力。
测试例5.冻干制剂中长期稳定性检测及配伍效果：
外泌体粒子数检测，结合Western Blot检测外泌体表面标志蛋白(Hsp70、Tsg101和CD81，或者Tsg101、CD9和CD81)比较应用各实施例常温储存1个月后外泌体储存水平：
该方案的衡量指标为冻干粉剂获取常温储存1个月后使用去离子水重悬，使用NanoFCM进行粒子数检测并读取固定区间内细胞外囊泡粒子数有效范围。该数值越高即细胞外囊泡得以完整保存的数量越多，结果如表12。生物学标志使用经典的Western Blot对细胞外囊泡表面标志蛋白进行鉴定，结果如图6，结果显示3个生物重复的细胞外囊泡均显示鉴定结果阳性，图6A结果外泌体标志性蛋白(Hsp70、Tsg101和CD81)表达水平可直接代表外泌体含量，结果表明加入本发明的冻干保护剂保持外泌体含量与新鲜提取外泌体水平接近；图6B结果表明，实施例1、2、3中外泌体标志性蛋白(Tsg101、CD9和CD81)检出水平较高，细胞对照检出阴性，表示此次实验结果可信。据此我们得知细胞外囊泡从结构、数量、生物活性上得以稳定保存。
表12各实施例的中长期稳定性检测结果(单位：个/毫升)
| 储存1周 | 储存2周 | 储存4周 | |
| 实施例1 | 4.49×108 | 4.47×108 | 4.39×108 |
| 实施例2 | 4.41×108 | 4.29×108 | 4.17×108 |
| 实施例3 | 4.52×108 | 4.33×108 | 4.13×108 |
| 实施例4 | 3.92×108 | 2.67×108 | 2.43×108 |
| 实施例5 | 3.89×108 | 2.87×108 | 2.41×108 |
| 对比例1 | 3.61×108 | 3.07×107 | 2.64×107 |
| 对比例2 | 9.33×106 | 6.51×104 | 6.27×104 |
| 对比例3 | 7.41×106 | 4.39×104 | 2.23×104 |
| 生理盐水组 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
上述测试结果表明：
与其他经典添加氨基酸相比：甘氨酸与L-组氨酸的对比，L-组氨酸相对甘氨酸相比，可以显著提升细胞外囊泡的数量及结构完整性。
1)与其他经典保护剂(糖类)相比：同浓度蔗糖添加组(对比例3的冻干保护剂)与海藻糖添加组(实施例2的冻干保护剂)的对比。
2)我们首先筛选了几种常用于作为注射辅料的糖类进行预实验，使用同等浓度保护剂冻干并复溶检测有效成分的手段作为初筛，结果表明，蔗糖与海藻糖可以在一定程度上对蛋白成分形成赋形稳定作用，获得冻干后的制剂外观形态如图7，冻干制剂即刻复溶扫描电镜如图8，结果表明蔗糖保护剂的外泌体部分得以留存但出现塌陷崩解，而适宜浓度的海藻糖溶液可以有效保证外泌体形态完整，数量显著较多。
3)针对海藻糖溶液我们进行了浓度0％至10％的不同浓度的配伍，最终结果以即刻复溶的冻干制剂测定NanoFCM粒子数为标准进行比较结果表明添加量8.0％为最优选择。
本发明的冻干程序从样品预处理开始至获取新鲜溶液及配制为制剂均可在GMP实验室中进行，过程简易，涉及仪器少，易于操作。同时由于程序及流程的优化，整体过程可由单人操作在2个工作日内即可获得产品。与其他方式提取细胞外囊泡或冻干制剂的制取过程相比，通过直接向外泌体产品中添加保护制剂并进行冻干，大大减少开盖步骤及暴露时间，避免过程中活性成分的损失及污染几率。
与此同时，该程序制备出的冻干制剂形态完整干燥，可生成优美的蛋糕形态冻干粉，形态完整美观，如图7所示，本发明的冻干保护制剂提高了最低冷冻温度并延长升华阶段时间后进行冻干的产品。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。针对上述示例性实施方案所做的任何简单修改、等同变化与修饰，都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂，其特征在于，包括：吐温-80、L-组氨酸和海藻糖，其重量比为1：15～30：50～75。
2.根据权利要求1所述的医用级储存制剂，其特征在于，所述吐温-80、L-组氨酸和海藻糖的重量比为1：18～25：60～75，可选地为1：18～22.5：60～75，可选地为2：45：150、1：20：60或3：55：200。
3.一种细胞外囊泡制剂，其特征在于，包括外泌体和权利要求1或2所述的医用级储存制剂。
4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡制剂，其特征在于，所述医用级储存制剂在冻干干燥前占体系的4～16.5w/v％，可选地为7～11w/v％，可选地为7.5～10.5w/v％，可选地为7.8～10.4w/v％；
和/或，所述外泌体来源于选自间充质干细胞、诱导性多能干细胞、HEK293、293T/17细胞、人类唾液、泪液或牛乳、植物茎叶提取物中的一种或几种；可选地，间充质干细胞为脐带或脂肪来源的间充质干细胞。
5.根据权利要求3或4所述的细胞外囊泡制剂，其特征在于，外泌体在干燥前的体系中浓度为1×104～9×108个/mL，可选地为1×108～9×108个/mL，可选地为4×108～8×108个/mL，可选地为4.5×108～6.5×108个/mL，可选地为6×108～8×108个/mL；
和/或，外泌体生物活性成分占干燥后体系质量分数的40～60％，可选地为50～55％。
6.一种权利要求3至5任一所述的细胞外囊泡制剂的制备方法，其特征在于，将外泌体溶液加入到权利要求1或2所述的医用级储存制剂的溶液中。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，外泌体溶液中的外泌体含量为1×105～9×109个/mL，可选地为1×109～9×109个/mL，可选地为4×109～8×109个/mL，可选地为4.5×109～6.5×109个/mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，还包括冻干程序：将含有外泌体的医用级储存制剂进行冻干处理，可选地，冻干程序设定为-50至-20℃进行冻干处理。
9.根据权利要求6至8任一所述的制备方法，其特征在于，所述医用级储存制剂的溶液为水溶液，可选地，所述医用级储存制剂在冻干干燥前占体系的4～16.5w/v％，可选地为7～11w/v％，可选地为7.5～10.5w/v％，可选地为7.8～10.4w/v％；
和/或，外泌体在干燥前的体系中浓度为1×104～9×108个/mL，可选地为1×108～9×108个/mL，可选地为4×108～8×108个/mL，可选地为4.5×108～6.5×108个/mL，可选地为6×108～8×108个/mL；
和/或，外泌体生物活性成分占干燥后体系质量分数的40～60％，可选地为50～55％。
10.一种权利要求1或2所述的医用级储存制剂、权利要求3至5任一所述的细胞外囊泡制剂或权利要求6至9任一所述的制备方法制备的细胞外囊泡制剂在制备外泌体产品中的应用。
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| CN202310464563.5A CN117100871A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用 |
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|---|---|---|---|
| CN202310464563.5A CN117100871A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用 |
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| CN117100871A true CN117100871A (zh) | 2023-11-24 |
Family
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| CN202310464563.5A Pending CN117100871A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种用于保护生物来源的细胞外囊泡的医用级储存制剂及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN117598291A (zh) * | 2024-01-15 | 2024-02-27 | 北京恩康医药有限公司 | 一种外泌体保护液及其应用 |
-
2023
- 2023-04-26 CN CN202310464563.5A patent/CN117100871A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117598291A (zh) * | 2024-01-15 | 2024-02-27 | 北京恩康医药有限公司 | 一种外泌体保护液及其应用 |
| CN117598291B (zh) * | 2024-01-15 | 2024-04-09 | 北京恩康医药有限公司 | 一种外泌体保护液及其应用 |
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