ES2906849T3 - Proceso para aislar y liofilizar vesículas extracelulares - Google Patents

Abstract

Un proceso de producción de microvesículas y/o exosomas, caracterizado por que comprende las siguientes etapas: (i) recoger un líquido biológico que comprende microvesículas y/o exosomas, (ii) dializar o ultrafiltrar dicho líquido biológico utilizando una membrana que tenga un valor liminar (valor de corte) igual o menor a 5.000 dalton y un líquido de diálisis o ultrafiltración, (iii) añadir un crioprotector a la solución dializada o ultrafiltrada obtenida de la etapa (ii) y (iv) liofilizar la solución resultante de la etapa (iii) obteniendo un polvo liofilizado que comprende microvesículas y/o exosomas en una cantidad igual o superior al 20 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado; y al menos un crioprotector en una cantidad igual o inferior al 80 % p/p.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para aislar y liofilizar vesículas extracelulares

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para aislar y liofilizar vesículas extracelulares presentes en líquidos biológicos. En particular, la invención se refiere a un proceso combinado de diálisis o ultrafiltración y liofilización de líquidos biológicos que comprenden microvesículas y/o exosomas que permite obtener un producto en polvo que contiene microvesículas y/o exosomas. Por otra parte, de acuerdo con un aspecto preferido, la invención se refiere a un proceso para la obtención de un producto en polvo de microvesículas y/o exosomas que contienen a su vez nanopartículas cargadas con una o más sustancias biológicamente activas.

Técnica anterior

Las células se comunican e intercambian información de dos maneras fundamentales: a través del contacto directo entre células y a través de la secreción de sustancias biológicamente activas (mecanismos paracrinos); el producto de la secreción celular en su conjunto puede denominarse secretoma. El secretoma consiste en factores solubles (tales como citocinas) y estructuras insolubles tales como exosomas y microvesículas.

Los exosomas y las microvesículas son partículas nanométricas con un diámetro promedio generalmente entre 30 y 1000 nm, delimitados por una membrana lipídica generalmente de dos capas.

Las microvesículas y los exosomas contienen biomoléculas, incluidas proteínas, ARN mensajero y micro-ARN y, debido a su composición, se han propuesto como terapia innovadora como alternativa a las células fuente ya que tienen muchas ventajas, incluida una menor propensión a estimular el sistema inmunitario, la disminución del riesgo de tumorigénesis, la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica y una tendencia menor a la obstrucción vascular.

El secretoma se ha propuesto en terapias de medicina regenerativa para el tratamiento de diversas enfermedades tales como la artrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurológicas, enfermedad pulmonar, diabetes y muchos otras (Lener T., et al., "Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials - an ISEV position paper", J Extracell Vesicles., Vol. 4, 2015, 30087). En estudios informados en la bibliografía, la tasa de éxito y la duración del efecto fueron de manera significativa incoherentes, debido principalmente a la cantidad a veces insuficiente de sustancias biológicamente activas (proteínas, glucoproteínas, ácidos nucleicos) que llegan sin cambios al sitio de acción.

Aunque hasta la fecha todavía no existe una legislación específica, el secretoma, que incluye microvesículas y exosomas, se puede considerar como un fármaco biotecnológico y deben establecerse preparaciones para uso clínico que cumplan con las buenas prácticas de fabricación (GMP, del inglés "Good Manufacturing Practice") para garantizar la seguridad y la eficacia terapéutica, mediante el control de la calidad del producto (tal como, por ejemplo, pero sin limitación, uniformidad cuantitativa/cualitativa) y del proceso de producción (tal como, pero sin limitación, fiabilidad y reproducibilidad).

Se han descrito varios métodos para el aislamiento de microvesículas y/o exosomas, pero todo a escala de laboratorio solamente y hasta la fecha, ninguno ha sido implementado a escala industrial/semi-industrial siguiendo las GMP.

El método más utilizado es la ultracentrifugación, en la que los líquidos corporales se someten a centrifugación a velocidad elevada. Sin embargo, el rendimiento de las microvesículas y/o exosomas, así como la calidad del producto final, pueden verse influidos por las propiedades del instrumento (por ejemplo, tipo de rotor, ángulo de sedimentación del rotor y/o radio de la fuerza centrífuga) y por el operador. Por otra parte, la ultracentrifugación puede provocar la agregación o ruptura de las microvesículas y/o exosomas debido a las fuerzas centrífugas elevadas, perdiendo así la integridad de las estructuras vesiculares.

Se han investigado nuevas técnicas de aislamiento para la fabricación a gran escala de microvesículas y/o exosomas, tales como la cromatografía de exclusión molecular y la filtración de flujo tangencial. Recientemente, algunos investigadores han demostrado que la combinación de ultrafiltración y cromatografía de exclusión molecular permite obtener un rendimiento significativamente mayor de microvesículas y/o exosomas en comparación con la ultracentrifugación, sin cambiar las propiedades biofísicas y el contenido de proteínas del material de origen (Nordin J. Z., et al., "Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties", Nanomedicine, Vol. 11, número 4, mayo de 2015, 879-883).

Las técnicas de aislamiento de microvesículas y/o exosomas se describieron en patentes y solicitudes de patente publicadas recientemente, tales como US9347087, US8901284, US9005888, WO2016033695, WO2016022654, WO2015131153 y WO2012087241.

En particular, el documento WO2016090183 divulga procesos para producir formulaciones de exosomas estables en forma liofilizada, por ejemplo, mediante ultrafiltración y diafiltración.

El documento CN104488850 divulga un método para preparar un polvo liofilizado de exosomas de células madre mesenquimatosas amnióticas humanas: el método comprende las etapas siguientes: mezclar trehalosa con exosomas de las células madre mesenquimatosas amnióticas humanas como crioprotector; filtrar y eliminar bacterias en virtud de una membrana de filtro; y en primer lugar llevar a cabo una congelación previa a temperatura ultrabaja y después llevar a cabo una congelación a baja temperatura a un determinado grado de vacío.

M. Faustini et al, "Non-expanded mesenchymal stem cells for regenerative medicine: yield in stromal vascular fraction from adipose tissues", Tissue Engineering, 2010, Vol. 16, número 6, 1515-21, analiza la optimización de la terapia basada en SVF adiposa y el efecto del sitio de recogida, el procedimiento quirúrgico y las técnicas de procesamiento de tejidos en el rendimiento de SVF. El documento también divulga métodos para recuperar muestras de tejido adiposo, que después se digieren en diferentes condiciones con colagenasa.

Otro problema conocido en la materia consiste en la conservación de microvesículas y/o exosomas. Hasta la fecha, el único método de conservación de microvesículas y/o exosomas es la crioconservación a una temperatura igual o inferior a -20 °C, en ausencia de crioprotectores (Zhou H., et al., "Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery", Kidney Int., Vol. 69, número 8, 2006, 1471-1476). La falta de crioconservantes es una limitación considerable ya que los cristales de agua formados durante el proceso de congelación rompen fácilmente las membranas biológicas que forman las microvesículas y los exosomas. Además, el marcado estrés osmótico al que se somete el secretoma durante la congelación y descongelación puede dañar de manera irreversible las membranas, la carga contenida en el mismo, así como las proteínas de membrana, las moléculas de adhesión y asentamiento y los receptores (Ohno S., et al., "Focus on extracellular vesicles: development of extracellular vesicle-based therapeutic systems", Int. J. Mol. Sci., Vol. 17, 2016, 172).

Por lo tanto, a pesar de los progresos realizados, aún existe una necesidad de desarrollar un proceso de aislamiento y conservación de microvesículas y/o exosomas que sea factible y económicamente viable en las GMP, fácilmente escalable, reproducible y, sobre todo, una preparación farmacéutica estable en el tiempo.

Sumario de la invención

El solicitante ha encontrado un proceso de aislamiento y conservación de microvesículas y/o exosomas que supera los inconvenientes de los métodos descritos en la bibliografía.

En particular, el solicitante ha optimizado un proceso combinado de diálisis o ultrafiltración y liofilización aplicable a líquidos biológicos que comprenden microvesículas y/o exosomas (como el sobrenadante de células cultivadas o líquidos corporales) que permite obtener un material sólido en forma de polvo liofilizado.

El polvo liofilizado obtenido mediante el proceso de la invención se puede preparar de manera fácil en instalaciones adecuadas para la producción farmacéutica de productos estériles o se puede envasar y esterilizar (por ejemplo, pero sin limitación, utilizando radiación), obteniendo un producto farmacéutico sólido acabado (listo para usar o destinado a una preparación extemporánea) o un producto semiacabado para la preparación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas o semisólidas (soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, pastas o geles, gránulos, cápsulas, comprimidos) para la administración de microvesículas y/o exosomas.

El polvo liofilizado obtenido mediante el proceso de la invención se puede caracterizar de manera fácil siguiendo procedimientos certificables en las GMP, tales como (I) valoración en proteínas y fosfolípidos, (II) distribución de tamaño de microvesículas o exosomas, (III) citotoxicidad in vitro, (IV) actividad biológica in vitro (actividad inmunomoduladora y antinflamatoria).

El solicitante señaló que al llevar a cabo la diálisis o la ultrafiltración en presencia de determinadas soluciones tampón, se podría obtener una mayor concentración de microvesículas y/o exosomas conservando la integridad de las mismas.

El solicitante también señaló que al llevar a cabo la liofilización en presencia de un agente crioprotector adecuado, era posible obtener un producto sólido y estable con un contenido elevado de proteínas, mientras que carece de citotoxicidad y eficaz para reducir la inflamación en un modelo celular in vitro, mediante la estimulación de los condrocitos articulares.

El solicitante finalmente señaló que la adición de nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa durante la etapa de cultivo celular permitió obtener inicialmente células cargadas con dichas nanopartículas y, por lo tanto, microvesículas y/o exosomas a su vez cargados con dichas nanopartículas.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de producción de microvesículas y/o exosomas como se define en la reivindicación 1, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

(i) recoger un líquido biológico que comprende microvesículas y/o exosomas,

(ii) dializar o ultrafiltrar dicho líquido biológico utilizando una membrana que tenga un valor liminar (valor de corte) igual o menor a 5000 dalton y un líquido de diálisis o ultrafiltración,

(iii) añadir un crioprotector a la solución dializada o ultrafiltrada obtenida de la etapa (ii) y

(iv) liofilizar la solución resultante de la etapa (iii) obteniendo un polvo liofilizado que comprende microvesículas y/o exosomas en una cantidad igual o superior al 20 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado; y al menos un crioprotector en una cantidad igual o inferior al 80 % p/p.

Preferentemente, el líquido biológico es el sobrenadante de células cultivadas, de manera ventajosa células madre o un líquido corporal, tal como, pero sin limitación, plasma, suero o líquido amniótico.

De acuerdo con un aspecto preferido, el sobrenadante se recoge de las células cultivadas en un medio de cultivo durante al menos 4 horas.

De acuerdo con un aspecto adicional preferido, las células se cultivan en un medio de cultivo que contiene nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un producto en forma de polvo liofilizado obtenido mediante el proceso anterior, como se define en la reivindicación 13.

De acuerdo con un aspecto preferido, las microvesículas y/o los exosomas comprenden nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el gráfico de la distribución de tamaños de las microvesículas y/o exosomas descritos en el ejemplo 4.

La figura 2 muestra una fotografía con SEM (12.000*) de las microvesículas y/o exosomas descritos en el ejemplo 4.

Las figuras 3a y 3b muestran dos fotografías con TEM de las microvesículas y/o exosomas descritos en el ejemplo 4.

La figura 4 muestra los resultados del ensayo de inmunomodulación descrito en el ejemplo 5.

La figura 5 muestra los resultados del ensayo de captación de nanopartículas descrito en el ejemplo 6.

La figura 6 muestra las puntuaciones medias de inflamación aguda y la respectiva desviación típica a los 3, 7 y 21 días que se muestran en la tabla 8 del ejemplo 9.

La figura 7 muestra las puntuaciones medias de inflamación crónica y la respectiva desviación típica a los 3, 7 y 21 días que se muestran en la tabla 8 del ejemplo 9.

La figura 8 muestra las puntuaciones medias de la deposición de tejido de granulación y la desviación típica relativa a los 3, 7 y 21 días que se muestran en la tabla 8 del ejemplo 9.

Descripción detallada de la invención

La expresión "microvesículas y/o exosomas" significa partículas rodeadas por una membrana lipídica de una o dos capas que tienen un tamaño de entre 20 nm y 1.000 nm secretadas por células y presentes en un líquido biológico. La expresión "líquido biológico" significa un sobrenadante de células cultivadas o un líquido corporal.

La expresión "medio de cultivo mínimo" significa un medio de cultivo que comprende el mínimo de nutrientes posibles cuando dichos nutrientes, generalmente limitados a una fuente de energía de carbono (por ejemplo, azúcares) y algunas sales, se definen en términos tanto cualitativos como cuantitativos, y carecen de suero.

El término "trastorno" se refiere a cualquier alteración de la función normal de un órgano, aparato o sistema de un animal o ser humano vivo provocado por agentes patógenos y/o traumáticos externos, por agentes internos y/o por fenómenos degenerativos provocados por el envejecimiento.

Las microvesículas y/o exosomas pueden estar presentes en diferentes líquidos corporales (tales como, pero sin limitación, plasma, saliva, orina, suero, líquido sinovial, líquido folicular, líquido amniótico o líquido cefalorraquídeo) o pueden estar presentes en el sobrenadante de cultivo de diferentes estirpes celulares (tales como, pero sin limitación, adipocitos, astrocitos, células p, linfocitos, células endoteliales, células cancerosas, cardiomiocitos, células dendríticas, células madre, células epiteliales, eritrocitos, hepatocitos, queratinocitos, macrófagos, monocitos, oligodendrocitos, plaquetas y linfocitos T).

El líquido biológico preferentemente utilizado en el proceso de la presente invención está representado por el sobrenadante de células cultivadas, particularmente de células madre. Las células útiles en la presente invención son preferentemente células madre mesenquimatosas.

Las células madre mesenquimatosas (MSC, del inglés "Mesenchymal stem cells") se originan a partir del mesodermo, la capa germinal del blastocisto entre el ectodermo y el endodermo. Las MSC son células madre multipotentes autorrenovables capaces de diferenciarse en diferentes estirpes celulares, entre las que se encuentran los osteoblastos, condrocitos, miocitos y adipocitos, lo que origina diversos tejidos celulares tales como huesos, cartílago, tendones, músculo y tejido adiposo. Las MSC se distribuyen por todo el cuerpo en los mamíferos y son responsables de la regeneración de tejidos. El aislamiento de MSC se ha realizado a partir de múltiples regiones de tejido, incluida la médula ósea, el cordón umbilical y recientemente y cada vez más, del tejido adiposo, que contiene una gran cantidad de MSC.

Además de su capacidad de diferenciación, se ha demostrado que las MSC modulan la respuesta inmunitaria y la inflamación y promueven la curación de los tejidos y los mecanismos de protección, lo que las hace utilizables en el tratamiento de varias enfermedades (Caplan A. I., "What's in a name?" Tissue Engineering Part A. August 2010, Vol.

16, N.° 8: 2415-2417). Los fármacos basados en MCS sometidos a una manipulación importante se denominan medicamentos de terapia avanzada.

Las MSC se pueden aislar del componente estromal de la médula ósea (donde representan aproximadamente un 0,01 % de todas las células nucleadas), de la sangre del cordón umbilical, de la placenta, de la sangre periférica y del tejido adiposo (tejido graso).

Preferentemente, las MSC se aíslan del tejido adiposo. El tejido adiposo contiene una fracción vascular estromal a partir de la cual se pueden aislar células madre mesenquimatosas procedentes del tejido adiposo (AD-MSC). Las AD-MCS tienen un fenotipo y un perfil de expresión génica similar al de las células madre de la médula ósea. Las AD-MSC tienen la capacidad de autorrenovación y crecimiento a largo plazo y son capaces de diferenciarse en diferentes tipos de células tales como adipocitos, osteoblastos y condrocitos.

Las AD-MSC se aíslan del tejido adiposo mediante lavado con solución tampón y digestión enzimática.

El lavado y/o la digestión pueden llevarse a cabo utilizando cualquier solución tampón conocida en la materia, tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina tamponada con borato (BBS) y solución salina tamponada con TRIS (TBS-TRIS).

La digestión puede llevarse a cabo mediante cualquier enzima conocida en la materia capaz de degradar y separar de manera progresiva las células de la matriz extracelular mediante la rotura de los enlaces peptídicos presentes en el colágeno. Normalmente, para esta operación se utilizan colagenasas tales como la colagenasa AFA, colagenasa de tipo I, colagenasa de tipo II, colagenasa de tipo III, colagenasa de tipo IV y colagenasa CLSPA.

De manera ventajosa, la digestión se lleva a cabo en presencia de antibióticos tales como la penicilina, estreptomicina y anfotericina, en una concentración inferior al 5 % p/v, preferentemente inferior al 3 % p/v.

La fracción vascular estromal, que contiene las MSC, se puede separar del medio de digestión mediante filtración y/o centrifugación y, después, colocarse en un medio de cultivo, preferentemente en condiciones de una sola capa, hasta lograr la subconfluencia.

El cultivo celular se realiza en placas de adhesión de medio de cultivo mínimo tal como DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), IMDM (Medios de Dulbecco modificados por Iscove), F10 de Ham, F12 de Ham, MEM (Medio Esencial Mínimo), G-MEM (medio esencial mínimo de Glasgow), BME (Medio Eagle basal) o medios mixtos tales como DMEM/F12 de Ham (proporción 1:1), DMEM/F12 de Ham avanzado e IMDM/MEM.

Preferentemente, el medio de cultivo mínimo se complementa con suero de origen animal tal como suero bovino fetal (FBS), suero de ternera fetal (FCS) o sustitutos de suero artificial disponibles en el mercado, tal como el suero Knockout™ SR (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), X-Vivo™10 y X-Vivo™20 (Lonza Walkersville, Inc, Walkersville, MD, EE. UU.), Lipumin™ 10x y SerEx 10x (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), SR3 (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.), suplemento sustituto de suero (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, EE. UU.) y Plasmanate (Bayer Healthcare, West Haven, CT, EE. UU.) o lisado de plaquetas comercialmente disponible (Lyset™, Reactivos Carlo Erba, Italia).

A continuación, las MSC se tratan con una solución de separación de células, normalmente tripsina-EDTA y se siembran de nuevo a 37 °C y en una atmósfera de dióxido de carbono al 5 % en condiciones de una sola capa. El proceso (expansión celular) se repite varias veces, preferentemente de 1 a 12 veces, más preferentemente de 1 a 3 veces.

Después, las MSC adheridas se cultivan en un medio de cultivo mínimo durante al menos 4 horas, preferentemente al menos 12 horas y preferentemente al menos 18 horas. De acuerdo con un aspecto más preferido, el cultivo tiene lugar durante menos de 96 horas, preferentemente menos de 48 horas. De manera ventajosa, el cultivo tiene lugar durante aproximadamente 24 horas.

El solicitante señaló que, en estas condiciones, las MSC producen una cantidad considerable y reproducible de microvesículas y/o exosomas que se liberan al medio de cultivo.

El solicitante señaló además que la adición de nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa durante la etapa de cultivo de las MSC permitió obtener inicialmente células cargadas con dichas nanopartículas y, a continuación, después del cultivo en medio mínimo, microvesículas y/o exosomas cargados a su vez con dichas nanopartículas.

El sobrenadante del cultivo, que contiene microvesículas y/o exosomas, se recoge y las MSC se tratan de nuevo con una solución de separación de células, normalmente tripsina-EDTA.

En los procesos de la presente invención, el líquido biológico (sobrenadante o líquido corporal) se somete a un proceso de diálisis o ultrafiltración utilizando una membrana que tiene un valor liminar (valor de corte) igual o inferior a 5000 dalton.

Las membranas de diálisis están disponibles comercialmente de varios fabricantes, tales como las membranas Spectra/Por® (Spectrum Laboratories, Inc, Rancho Dominguez, CA, EE. UU.), Visking (Medicell Membranes LTD, Londres, Reino Unido), SnakeSkin® (TermoFisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.).

El equipo de ultrafiltración está disponible comercialmente del mismo fabricante, tal como, por ejemplo, el sistema de ultrafiltración TFF (Filtración de flujo tangencial) de Spectrum Laboratories o las unidades de ultrafiltración para centrifugación Amicon™ (Merk Millipore).

El líquido biológico (sobrenadante o líquido corporal) se encierra dentro de un recipiente (bolsa o tubo de diálisis) fabricado con una membrana que tiene poros de un tamaño igual o inferior a 5000 dalton y el recipiente se coloca en un líquido de diálisis o ultrafiltración adecuado.

El líquido de ultrafiltración o diálisis puede ser agua o solución tampón con una concentración de sales inferior a la concentración de sales del líquido biológico, es decir, con una presión osmótica inferior a la presión osmótica del líquido biológico.

Preferentemente, la solución tampón se selecciona del grupo que comprende soluciones de sales inorgánicas, tales como fosfato de sodio, cloruro de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, o soluciones de sales orgánicas, tales como clorhidrato de trometamina (HCI-TRIS), MOPS, MES, HEPES y TES. Se pueden utilizar de manera ventajosa mezclas de tampones tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS) que comprenden cloruro de sodio y potasio, fosfato disódico y fosfato monopotásico.

Ejemplos de soluciones tampón útiles en el proceso de la presente invención son una solución de Na²HPO⁴ x ⁷ H²O (10 mM), una solución de clorhidrato de trometamina (TRIZMA 1,28 M), una solución de NaCl (0,54 M) y PBS carente de iones de Ca2+ y Mg2+.

De manera ventajosa, el líquido de diálisis comprende polioxialquileno que tiene un peso molecular promedio igual o superior a 100 g/mol.

Preferentemente, el polioxialquileno es un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular promedio igual o superior a 100 g/mol, preferentemente igual o superior a 300 g/mol, más preferentemente igual o superior a 500 g/mol.

Preferentemente, el polioxialquileno útil en la presente invención es un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular promedio igual o inferior a 4000 g/mol, preferentemente igual o inferior a 3000 g/mol, más preferentemente igual o inferior a 2500 g/mol.

De manera ventajosa, el polioxialquileno útil en la presente invención es un polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 1000 y 2000 g/mol.

La solución obtenida mediante el proceso de ultrafiltración o diálisis comprende una mayor concentración de microvesículas y/o exosomas y un bajo contenido en sales y/o impurezas. La solución dializada o ultrafiltrada se somete entonces a un proceso de liofilización por medio de técnicas de liofilización convencionales para proporcionar un material en polvo que se adapta para un almacenamiento prolongado a temperatura ambiente o a temperaturas inferiores.

De acuerdo con el proceso de la presente invención, la solución dializada o solución ultrafiltrada se complementa con un crioprotector.

Normalmente, el crioprotector está representado por un azúcar, aminoácidos, polioles o mezclas de los mismos. Ejemplos de azúcares útiles como crioprotectores en el proceso de la presente invención son: manitol, lactosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, glucosa, maltosa, fructosa y rafinosa. Ejemplos de aminoácidos útiles como crioprotectores en el proceso de la presente invención son: arginina, alanina, glicina e histidina. Ejemplos de polioles útiles como crioprotectores en el proceso de la presente invención son: etilenglicol, 1,3-propanodiol, glicerol y ciclodextrinas. Preferentemente, manitol, glicina y mezclas de los mismos se utilizan como crioprotectores en la presente invención. La adición de crioprotector se puede realizar mediante la disolución del crioprotector directamente en el sobrenadante dializado o ultrafiltrado o mediante la adición de una solución acuosa de crioprotector previamente preparada.

De manera ventajosa, el crioprotector o la mezcla de crioprotectores se añaden a la solución dializada o ultrafiltrada en cantidades comprendidas entre el 0,25 y el 25% p/v, preferentemente entre el 0,5 y el 10% p/v, más preferentemente entre el 0,5 y el 5 % p/v.

La congelación de la solución dializada o ultrafiltrada se realiza a temperaturas inferiores a -50 °C, preferentemente inferiores a -70 °C, con la ayuda de hielo seco o nitrógeno líquido. La solución dializada o ultrafiltrada y congelada se transfiere a un liofilizador, donde se aplica vacío para bajar la presión atmosférica y permitir la sublimación del hielo (es decir, la transición del agua de la fase sólida a la fase de vapor sin pasar por la fase líquida).

Los equipos de liofilización (liofilizadores) están ampliamente disponibles en el mercado. Un liofilizador consiste esencialmente en una cámara de secado, un condensador para recoger el vapor sublimado del producto, un sistema de enfriamiento para la cámara de secado y el condensador, y una bomba de vacío para reducir la presión en la cámara de secado y el condensador.

La liofilización es ventajosa ya que proporciona un producto en forma de polvo, estable y listo para envasar o ya envasado, que contiene microvesículas y/o exosomas desprovistos de células o microbios residuales.

El proceso de la presente invención permite obtener un producto en forma de polvo liofilizado que comprende microvesículas y/o exosomas que tienen un diámetro entre 20 y 5000 nm y un diámetro promedio entre 50 y 200 nm. El contenido de microvesículas y/o exosomas en el polvo liofilizado de la presente invención consiste en al menos un 20 % p/p con respecto al peso total del polvo liofilizado, preferentemente al menos un 30 % p/p con respecto al peso total del polvo liofilizado, y más preferentemente al menos un 40 % p/p con respecto al peso total del polvo liofilizado. El contenido restante igual o inferior al 80 % p/p, preferentemente igual o inferior al 70 % p/p, más preferentemente igual o inferior al 60 % p/p, está representado por el crioprotector o mezcla de crioprotectores.

Preferentemente, el polvo liofilizado de la presente invención contiene microvesículas y/o exosomas en una cantidad de entre el 20 % y el 60 % p/p, más preferentemente entre el 25 % y el 55 % p/p, y crioprotector o una mezcla de crioprotectores en una cantidad de entre el 80 % y el 40 % p/p, más preferentemente entre el 75 % y el 45 % p/p. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, las microvesículas y/o los exosomas comprenden nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa.

Al igual que las MSC, el producto obtenido de acuerdo con la presente invención puede ser útil en terapias de medicina regenerativa, para el tratamiento de varias enfermedades tales como (pero sin limitación) artrosis, enfermedades cardiovasculares, tales como insuficiencia cardíaca, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas, tales como la enfermedad de Parkinson o de Alzheimer, dolor, tal como dolor crónico y/o neuropático, insuficiencia medular, diabetes y cáncer, en tratamientos de medicina estética de tejidos blandos y cosmética antienvejecimiento de la piel.

El producto obtenido de acuerdo con la presente invención ha demostrado ser particularmente útil en el tratamiento de heridas y lesiones agudas y crónicas en un modelo animal, como se describe en el ejemplo 9.

Al mismo tiempo, la introducción de nanopartículas cargadas con sustancias biológicamente activas permite dirigir mediante microvesículas y/o exosomas directamente hacia el órgano y/o aparato afectado por el efecto de la sustancia biológicamente activa.

Los órganos y/o aparatos principalmente afectados comprenden, por ejemplo (pero sin limitación), los del sistema cardiovascular, sistema respiratorio, sistema gastrointestinal, sistema tegumentario, sistema muscular, sistema esquelético y sistema nervioso central y periférico.

La elección de la sustancia biológicamente activa no está particularmente limitada. Cualquier sustancia capaz de cargarse en nanopartículas y eficaz en un trastorno de uno de los sistemas mencionados anteriormente puede estar comprendida en las microvesículas y/o exosomas obtenidos por el proceso de la presente invención.

A modo de ejemplo, pueden mencionarse fármacos cardiovasculares (tales como antihipertensivos, fármacos antiarrítmicos, diuréticos), fármacos del sistema nervioso central y periférico (tales como anestésicos, hipnóticos, sedantes, ansiolíticos, fármacos contra el Parkinson), fármacos analgésicos (tales como antinflamatorios y analgésicos), fármacos antimicrobianos (tales como fármacos sulfamídicos, antibióticos, antivíricos y fármacos antifúngicos), fármacos para quimioterapia, fármacos antitumorales, fármacos de inmunoterapia antitumoral, vacunas (tales como vacunas contra tumores o vacunas contra la gripe), hormonas, fármacos peptídicos y proteicos, vitaminas, extractos de plantas y fitocomplejos.

El producto que comprende microvesículas y/o exosomas obtenido mediante el proceso de acuerdo con la presente invención puede administrarse a un animal o a un ser humano vivo mediante cualquier vía de administración adecuada, tal como parenteral, inhalación, tópica, oftálmica, auricular y transmucosa (tal como, pero no solo, rectal, vaginal y bucal).

En el caso de la administración parenteral, el producto se reconstituye mediante la adición de una solución salina inyectable adecuada y se administra por vía parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea o venosa, a través de inyección, infusión, catéter o infusor intratecal. En el caso de la administración por vía respiratoria, el producto se puede formular en forma de polvo para inhalación o solubilizar para aerosoles. En el caso de la administración por vía oftálmica, auricular y transmucosa, el producto se puede formular en forma de solución, pomada, gel o crema. En el caso de la administración tópica, también para el tratamiento de heridas y úlceras cutáneas, el producto se puede formular en forma de membrana para apósitos avanzados, por ejemplo, a base de alginato de sodio, alginato de calcio, derivados de la celulosa (tal como la carboximetilcelulosa), ésteres de ácido hialurónico, proteínas de seda (tales como fibroína y sericina), tela no tejida y similares.

En el caso de uso cosmético, los productos se pueden formular en forma de una pomada, crema, crema-gel, gel, loción, pasta o solución para aplicación tópica u oftálmica o para irrigación.

El producto que comprende microvesículas y/o exosomas obtenido mediante el proceso de acuerdo con la presente invención se puede envasar y esterilizar de manera fácil (tal como, pero no solo, mediante irradiación como se describe en Sakar F. et al., "Nano drug delivery systems and gamma radiation sterilization", Pharmaceutical Development and Technology), obteniendo un producto farmacéutico sólido para la administración de microvesículas y/o exosomas.

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Aislamiento de células madre mesenquimatosas (MSC) a partir de tejido adiposo humano

Los tejidos adiposos se obtuvieron de donantes informados. Las muestras se lavaron repetidamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin iones de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) (Euroclone, Milán, Italia) y finamente picadas con tijeras quirúrgicas. La digestión de los tejidos se realizó en un baño a 37 °C provisto de agitador utilizando la enzima colagenasa de tipo II (Sigma-Aldrich, Milán, Italia) disueltos en PBS que contiene iones de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg ) (Euroclone, Milán, Italia), complementado con penicilina/estreptomicina al 1 % (Euroclone, Milán, Italia) y anfotericina B al 1 % (Euroclone).

Después de una hora, a la suspensión celular se le añadió el medio DMEM (Medio de Eagle modificado de Dulbecco) y el medio F12 de Ham en proporción 1:1 (Euroclone, Milán, Italia) complementado con suero fetal bovino ^{al 10 %} (FB^s, ^{Gibco, Thermo Fisher Scientific, Milán, Italia).}

El tejido digerido se filtró a través de un tamiz celular de 70 pm (Greiner Bio-One, Milán, Italia) y se centrifugó a 600g durante 5 minutos (M. Faustini et al, "Non-expanded mesenchymal stem cells for regenerative medicine: yield in stromal vascular fraction from adipose tissues", Tissue Engineering, 2010, Vol. 16, número 6, 1515-21). La fracción vascular estromal así recuperada se cultivó en condiciones de monocapa (100.000 células/cm2) en medio DMEM/F12 en proporción 1:1 complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1 % y anfotericina B al 1 %.

Al alcanzar la subconfluencia, las MSC se eliminaron mediante tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05 % (Euroclone, Milán, Italia) y se sembraron de nuevo en el matraz en condiciones de monocapa (10.000 células/cm2) a 37 °C en una atmósfera de CO² al 5 %.

Aislamiento y liofilización de microvesículas y/o exosomas

Cuando las MSC alcanzaron la subconfluencia, se transfirieron y cultivaron en medio mínimo DMEM/F12 durante 4 o 24 horas. A continuación, se recogió el sobrenadante y se eliminaron las MSC mediante tratamiento con EDTA-tripsina al 0,05 % (Euroclone, Milán, Italia) para evaluar el número de células y su viabilidad. El sobrenadante se dializó durante tres días utilizando membranas de diálisis con un valor de corte de 3500 dalton (Spectra/Por, Spectrum Laboratories, Milán, Italia) en presencia de diferentes tipos de soluciones tampón (agua destilada ultrapura, Na²HPO⁴ x ⁷ H²O 10 mM, TRIZmA 1,28 M, NaCl 0,54 M y PBS desprovisto de iones de Ca2+ y Mg2+) como se muestra en las siguientes tablas de los ejemplos 2 y 3.

Para concentrar el producto, el proceso de diálisis se llevó a cabo en presencia de una solución tampón que contenía polietilenglicol al 5 % p/v (PEG 1500, Merck Millipore, Milán, Italia).

El producto dializado se complementó con un agente crioprotector (glicina, manitol) solo o en combinación, en las cantidades que se muestran en las siguientes tablas de los ejemplos 2 y 3, se congeló a -20 °C y, a continuación, se sometió al proceso de liofilización con vacío por debajo de 1,33 mbar.

Ejemplo 2

Las muestras obtenidas de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1 se sometieron al ensayo BCA con el Protein Assay Kit de Thermo Scientific (Milán, Italia) para la cuantificación de las proteínas contenidas en el producto dializado y liofilizado, y al ensayo MTT para evaluar la citotoxicidad en fibroblastos humanos.

Ensayo BCA

El contenido total de proteína de las muestras de microvesículas y/o exosomas dializadas y liofilizadas obtenidas con el procedimiento del ejemplo 1 utilizando el tampón y el crioprotector de la siguiente tabla 1 se determinó utilizando el BCA-Protein Assay kit (Thermo Scientific, Milán, Italia), de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

La curva de calibración de absorbencia y concentración se generó utilizando seroalbúmina bovina habitual (BSA, Sigma-Aldrich). La solución de reactivo de trabajo se añadió a cada muestra o patrón (proporción 1:1) y después los conjuntos se incubaron a 37 °C durante 2 horas antes de medir la absorbencia a 562 nm con un lector de microplacas (Synergy HT, BioTek, Reino Unido). La concentración de proteína se extrapoló a partir de un gráfico de concentración frente a la absorbencia obtenida a partir de soluciones habituales de proteína, utilizando una ecuación polinomial de tercer grado, con r20,99 para cada ensayo.

Los resultados se muestran en la tabla 1 a continuación.

TABLA 1

Los resultados de la tabla 1 mostraron que el tiempo de cultivo de las MSC en el medio mínimo influyó, con el mismo tampón y agente crioprotector, en la cantidad de proteínas resultantes, aunque los datos obtenidos a las 4 horas mostraron valores con una dispersión elevada, síntoma de variabilidad elevada entre las muestras analizadas. Con el mismo tipo y cantidad de agente crioprotector, la cantidad de proteínas resultantes está influenciada por el tipo de tampón utilizado, con valores más elevados para los tampones de NaCl y PBS y valores más bajos para los tampones de Na²HPO⁴ y TRIZMA. Sorprendentemente, el uso de agua mostró el mejor valor.

Con el mismo tampón, utilizando NaCl, el manitol solo dio mejores resultados que la combinación de glicina y manitol.

Ensayo MTT

Se sembraron fibroblastos humanos (10.000 células/cm2) en una placa de 96 pocilios (Greiner Bio-One, Milán, Italia) y se cultivaron durante 24 horas a 37 °C en atmósfera de CO² al 5 %, en medio DMEM HG (glucosa elevada) complementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y anfotericina B al 1 %.

Las muestras dializadas y liofilizadas de microvesículas y/o exosomas obtenidas con el procedimiento del ejemplo 1 utilizando el tampón y el crioprotector de la siguiente tabla 2 se incubaron con las células a tres concentraciones (2,5, 1,25 y 0,6 mg/pocillo) durante 24 y 48 horas. A continuación, se retiraron las muestras y se añadieron a cada pocillo 100 |jl de una solución que contenía 0,5 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, Sigma-Aldrich). Después de tres horas, se eliminó la solución de MTT y se añadieron 100 j l de DMSO (Sigma-Aldrich).

La densidad óptica (DO) se midió con el instrumento Synergy HT (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.) a una longitud de onda de 570 nm y a una longitud de onda de referencia de 670 nm. La viabilidad celular se expresó como porcentaje (%) de la relación DOs/DOc, donde DOs es el valor medio de la densidad óptica de las muestras objeto del ensayo, y DOc es el valor promedio de las células no tratadas.

Los resultados se muestran en la tabla 2 a continuación.

TABLA 2

continuación

Los resultados de la tabla 2 mostraron que la viabilidad celular está influenciada por el tipo de tampón utilizado, con valores más elevados para los tampones de TRIZMA y Na²HPO⁴ y valores más bajos para los tampones de NaCl y PBS. También en este caso, el uso de agua mostró sorprendentemente el mejor valor.

Además, con el mismo tampón, utilizando NaCl, el manitol dio mejores resultados que la glicina, y comparables con los de la combinación de glicina y manitol.

Ejemplo 3

Para la evaluación de la integridad de las microvesículas y/o exosomas, las muestras obtenidas se sometieron al ensayo de fluorescencia con la tinción Nile Red.

Las muestras liofilizadas obtenidas con el procedimiento del ejemplo 1 (con y sin diálisis) utilizando el tampón y el crioprotector de la siguiente tabla 3 se trataron con la tinción Nile Red (90 pl de muestra a una concentración de 9 mg/ml en PBS y 10 pl de una solución de Nile Red) y se examinaron con el lector de placas Synergy HT (BioTek, Milán, Italia) a longitudes de onda de excitación y emisión fijas (excitación 530/25; emisión 645/40).

TABLA 3

Los resultados de la tabla 3 mostraron una mayor intensidad de fluorescencia para las muestras sometidas a diálisis, lo que demuestra una mayor integridad de las microvesículas y/o exosomas.

Además, la intensidad de fluorescencia estuvo influenciada de manera sustancial, con el mismo crioprotector, por el tipo de tampón utilizado. Los mejores resultados se obtuvieron con los tampones NaCl y PBS, mientras que en este caso el uso de agua proporcionó los resultados menos satisfactorios.

Por el contrario, con el mismo tampón, no se observaron diferencias significativas en el uso de manitol o glicina o mezclas de los mismos mediante el uso de NaCl.

Finalmente, las muestras obtenidas con cultivo en medio sin suero durante 24 horas produjeron una mayor intensidad de fluorescencia y, por tanto, una mayor integridad de las microvesículas y/o exosomas, con respecto a las muestras obtenidas con cultivo en medio sin suero durante 4 horas solamente.

Ejemplo 4

Las muestras obtenidas de acuerdo con el ejemplo 2 se analizaron para determinar sus dimensiones mediante dispersión de luz, utilizando un analizador DelsaMax CORE (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania), con un microscopio electrónico de barrido (SEM, del inglés "scanning electron microscope"), el microscopio electrónico de transmisión (TEM, del inglés "transmission electron microscope") JEOL JEM 1200EX (Jeol, Tokio, Japón) y el escáner láser confocal TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).

La figura 1 muestra el gráfico de distribución de tamaño de las microvesículas obtenidas con la técnica de dispersión de luz. Se encontró que el tamaño de partícula promedio era de 115 nm con un índice de polidispersión (PDI, del inglés "polydispersity index") igual a 0,255.

La caracterización morfológica realizada con microscopio electrónico de barrido (SEM) y el microscopio electrónico de transmisión (TEM) confirmó que las microvesículas conservaron su estructura esférica con una superficie lisa, como se muestra en la figura 2 (SEM) y en las figuras 3a y 3b (TEM).

Las imágenes obtenidas con el microscopio de barrido láser confocal en muestras tratadas con la tinción Nile Red confirmaron la integridad de las microvesículas y/o exosomas mostrando una fluorescencia bien definida.

Ejemplo 5

Finalmente, las muestras obtenidas se evaluaron en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células mononucleares de sangre periférica humana inducida por fitohemaglutinina (PHA) y para inhibir la inflamación en un modelo de inflamación inducida por IL-1 p en condrocitos humanos.

Ensayo de inmunomodulación

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de sangre venosa heparinizada de voluntarios sanos mediante centrifugación en un gradiente de densidad (Ficoll-Paque Plus). Las PBMC se contaron y colocaron en una placa de 96 pocillos (Corning Costar, Celbio) en una cantidad de 100.000 células por pocillo, en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Euroclone) con o sin muestra de microvesículas y/o exosomas obtenidos mediante el procedimiento del ejemplo 1, utilizando agua como tampón de diálisis y glicina/manitol como crioprotector (0 a 30 mg/ml) y/o fitohemaglutinina (PHA, 10|jg/ml) por duplicado.

Después de 72 horas, se recogieron las muestras y se evaluó la proliferación, la viabilidad celular y la producción de IL-6 de las mismas.

La proliferación se evaluó con el ensayo de proliferación con bromodesoxiuridina (ELISA BrdU - Life Science Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la figura 4, que muestra un efecto inhibidor significativo de la proliferación de PBMC por parte de la muestra que contiene microvesículas y/o exosomas dializados y liofilizados.

La viabilidad celular se evaluó mediante la adición del colorante resazurina (Alamar Blue) y la medición de la fluorescencia, después de 4 horas de incubación a 37 °C, con un espectrofotómetro (Victor X3, Perkin Elmer) con longitud de onda de excitación igual a 540 nm y longitud de onda de emisión igual a 590 nm.

Los resultados confirmaron que la exposición de PBMC a diferentes dosis de microvesículas y/o exosomas liofilizados no tuvo efectos tóxicos sobre las células, conservando el valor de viabilidad por encima del 90 % en todas las muestras analizadas.

La producción de IL-6 se evaluó mediante ELISA (Mabtech, límite de detección de 2 pg/ml, 5% de variación intraensayo) en muestras de PBMC activadas con fitohemaglutinina (PHA) en presencia y ausencia de microvesículas y/o exosomas liofilizados.

La activación con PHA dio como resultado un aumento significativo en la concentración de IL-6 en comparación con el control, alcanzando valores superiores a 3000 pg/ml. Después de la adición al medio de cultivo de microvesículas y/o exosomas liofilizados, este valor se redujo significativamente, situándose la concentración de IL-6 alrededor de 1740 pg/ml (-58%).

Ensayo de IL-1B en cultivos de condrocitos

Se aislaron células de condrocitos articulares (ACC, del inglés "articular chondrocyte cells") humanas a partir de fragmentos de cartílago de desecho resultantes de una artroplastia total de cadera mediante digestión enzimática con colagenasa de tipo II. Las ACC se cultivaron mediante unos pocos pases en cultivo antes del tratamiento con la citocina proinflamatoria IL-1p, en ausencia o presencia de microvesículas y/o exosomas obtenidos mediante el procedimiento del ejemplo 1, utilizando agua como tampón de diálisis y glicina/manitol como crioprotector (0 a 30 mg/ml).

Las células y los sobrenadantes se recogieron después de 48 horas de tratamiento. La expresión génica se evaluó mediante RT-PCR y la producción de marcadores catabólicos proinflamatorios y antinflamatorios se analizó mediante ensayo ELISA.

Los resultados mostraron una fuerte actividad inhibidora de la inflamación, observando una disminución de MMP-1, VEGF y TNFa y un aumento de TMP-1, TGFp e IL-1Ra.

Ejemplo 6

Se repitió el procedimiento descrito en el ejemplo 1 para aislar las células madre mesenquimatosas del tejido adiposo.

Las MSC así obtenidas se sembraron en una placa de 96 pocillos en una sola capa con una densidad de 10.000 células/cm2 y se incubaron en el medio de cultivo DMEM/F12 (relación 1:1) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % durante 24 horas a 37 °C en una atmósfera de CO² al 5 %.

A continuación, a cada pocillo se le añadieron 200 pg/ml de nanopartículas cargadas con curcumina de acuerdo con la siguiente tabla 4, preparadas con el método de desolvatación en acetona (Seib F. P. et al., "pH-Dependent anticancer drug release from silk nanoparticles", Adv Healthc Mater. Diciembre de 2013; 2/12), continuando la incubación durante 30, 60 o 120 minutos.

TABLA 4

En los tiempos predeterminados, las MSC se lavaron con PBS y se evaluó la captación celular de las nanopartículas en términos de intensidad de fluorescencia, aprovechando las propiedades fluorescentes de la curcumina, medida con un lector de microplacas (Synergy HT, BioTek, Reino Unido) equipado con un filtro de excitación a 485 nm y un filtro de emisión a 528 nm. Los resultados se muestran en la figura 2.

Los resultados obtenidos para los mismos tiempos de incubación demostraron la proporcionalidad directa entre la intensidad de la fluorescencia y la cantidad de curcumina presente en las nanopartículas, con valores crecientes pasando de Np1 a Np4, mientras que la fluorescencia fue mínima en MSC no tratadas o MSC tratadas con Np0. Los resultados obtenidos con las mismas nanopartículas mostraron que la máxima captación se obtuvo después de 60 minutos. De hecho, a los 30 minutos la intensidad de la fluorescencia fue inferior a la obtenida a los 60 minutos, mientras que a los 120 minutos no se obtuvo ningún aumento significativo adicional en la intensidad de la fluorescencia.

Las MSC cargadas con nanopartículas Np3 e incubadas durante 60 minutos se cultivaron con medio mínimo durante la noche y, a continuación, se separó el sobrenadante para evaluar la presencia de microvesículas y/o exosomas cargados con nanopartículas, aprovechando de nuevo las propiedades fluorescentes de la curcumina.

Los resultados confirmaron la presencia de nanopartículas Np3 en las microvesículas y/o exosomas liberados en el sobrenadante por las MSC.

Ejemplo 7

Para probar el efecto del crioprotector en la calidad y la estabilidad del producto después de la liofilización, se prepararon cuatro muestras a diferentes concentraciones de manitol (0,0 %, 0,5 %, 1,5 % y 3 % p/v). Las muestras se prepararon como sigue.

Se aislaron células madre mesenquimatosas (MSC) a partir de tejido adiposo humano como se describe en el ejemplo 1.

Al alcanzar la subconfluencia, las MSC se transfirieron y cultivaron en medio mínimo DMEM/F12 durante 9 y 24 horas. Después de 9 horas, el sobrenadante se eliminó y se reemplazó con medio mínimo DMEM/F12 nuevo. Después de 24 horas desde el inicio del proceso, se recogió el sobrenadante y se añadió al recogido previamente. Las MSC se eliminaron mediante tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05 % (Euroclone, Milán, Italia) para evaluar el número de células y su viabilidad. El sobrenadante se ultrafiltró con el método de ultrafiltración tangencial con un módulo de filtrado con un valor de corte de 5000 dalton (Spectrum Laboratories, Milán, Italia).

Se utilizó agua como medio de diálisis. El producto ultrafiltrado se dividió en cuatro alícuotas: la primera alícuota se utilizó como tal (y, por lo tanto, sin crioprotector) mientras que las otras tres alícuotas se mezclaron con concentraciones crecientes de crioprotector (0,5 %, 1,5 % y 3 % p/v de manitol). Todas las muestras se congelaron a -20 °C y después se sometieron al proceso de liofilización con vacío por debajo de 1,33 mbar.

Las muestras obtenidas (7A-7D) se sometieron al ensayo BCA con el Protein Assay Kit de Thermo Scientific (Milán, Italia) para la cuantificación de las proteínas contenidas en los productos liofilizados.

El contenido total de proteína de las muestras liofilizadas de microvesículas y/o exosomas se determinó mediante el BCA-Protein Assay kit (Thermo Scientific, Milán, Italia), de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

La curva de calibración de absorbencia y concentración se generó utilizando seroalbúmina bovina habitual (BSA, Sigma-Aldrich). La solución de reactivo de trabajo se añadió a cada muestra o patrón (proporción 1:1) y después los conjuntos se incubaron a 37 °C durante 2 horas antes de medir la absorbencia a 562 nm con un lector de microplacas (Synergy HT, BioTek, Reino Unido). La concentración de proteína se extrapoló a partir de un gráfico de concentración frente a la absorbencia obtenida a partir de soluciones habituales de proteína, utilizando una ecuación polinomial de tercer grado, con r20,99 para cada ensayo.

Los resultados se procesaron utilizando el análisis de la varianza bidireccional, que considera la concentración de manitol y el proceso de liofilización (sí/no) como factores fijos. La significación se fijó en 0,05.

Los resultados se muestran en la tabla 5 a continuación.

TABLA 5

El producto liofilizado (7A) sin crioprotector apareció como una masa uniforme de color amarillo claro, no quebradizo, de consistencia pegajosa, fuertemente adherido a las paredes del recipiente, difícilmente extraíble y manipulable, con muy malas propiedades de flujo y fluidez (no cuantificables).

El producto liofilizado (7B-C) con la adición de crioprotector (incluso a la concentración más baja) se presenta como un polvo blanco de aspecto homogéneo, poroso y quebradizo, no adherente a las paredes del recipiente, fácilmente extraíble y manipulable, con buenas propiedades de flujo y fluidez.

Los resultados del análisis cuantitativo del contenido de proteínas que se muestran en la tabla 5 mostraron que la ausencia de crioprotector conduce a una reducción significativa del contenido de proteínas después del proceso de liofilización, mientras que la adición de crioprotector (incluso en una concentración mínima) no conduce a una reducción significativa del contenido de proteínas como resultado del proceso de liofilización.

Ejemplo 8

El procedimiento de preparación de muestras descrito en el ejemplo 7 se repitió utilizando tanto el método de ultrafiltración como el método de diálisis con membranas de diálisis que tenían un valor de corte de 3500 dalton (Spectra/Por, Spectrum Laboratories, Milán, Italia) y utilizando como crioprotector glicina y/o manitol en las cantidades indicadas en la siguiente tabla 7, que también ilustra la composición porcentual de las muestras (8A-8T) obtenidas después de la liofilización.

TABLA 7

La composición porcentual del producto liofilizado tiene un contenido de secretoma que varía entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 48 % p/p. El método de aislamiento influye en la composición porcentual del producto liofilizado, con mayores porcentajes de secretoma para las muestras obtenidas después de la diálisis en comparación con la ultrafiltración.

Ejemplo 9

Se utilizaron membranas elaboradas a partir de alginato de sodio que comprenden el polvo liofilizado obtenido mediante el proceso de la presente invención en un modelo de herida animal para evaluar la eficacia de las mismas en el proceso de regeneración y curación.

Preparación de las membranas

El polvo de alginato de sodio de baja viscosidad (Sigma-Aldrich, Milán, Italia) se disolvió en agua destilada hasta una concentración final del 1 % p/v mediante agitación magnética. A la solución así obtenida se le añadió el secretoma obtenido de acuerdo con la diálisis y/o ultrafiltración, como se describe en el ejemplo 1, utilizando agua desionizada ultrapura como líquido de diálisis/ultrafiltración, antes de su liofilización, a una concentración final de 2 * 106 células equivalentes por membrana. Se transfirieron 500 ml de la mezcla final a cada pocillo de una placa Multiwell 24 (0,5 ml/1 cm2 de superficie) y las preparaciones se liofilizaron a 8 * 10"1 mbar y -50 °C durante 72 h (Liofilizador Modulyo® Edwards, Kingston, Nueva York). Las membranas de solo alginato (1 % p/v) se prepararon de manera similar y se utilizaron como control. De acuerdo con otro procedimiento, a la solución de alginato al 1 % p/v se le añadió el secretoma en polvo, obtenido como se describe en el ejemplo 1, mediante diálisis y/o ultrafiltración, adición del crioprotector (0,5% p/v de manitol) y posterior liofilización, a una concentración final de 2 * 106 células equivalentes por membrana.

Modelo de herida animal

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía internacional NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y las pautas institucionales, después de la aprobación del ICC Ethics Committee para la experimentación con animales (CSEA) del IRCCS AOU San Martino-IST. Se utilizaron nueve ratones C57BL macho de ocho a 12 semanas de edad (Charles River, MA, EE. UU.) para el modelo de generación ulcerosa. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron tras anestesia intraperitoneal inducida con xilazina/ketamina. Durante la anestesia, se eliminó el pelo de la superficie dorsal de cada animal con una crema depilatoria y se limpió la piel desnuda con una solución de povidona yodada. Se utilizó un punzón de biopsia estéril de 6 mm para crear una herida en todo el espesor, extendiéndose a través del panículo carnoso. Las membranas producidas de acuerdo con las diferentes composiciones y procedimientos descritos anteriormente se aplicaron para cubrir toda el área de la herida. Más tarde, las lesiones se cubrieron con un apósito no adherente (Tegaderm). Se adquirieron imágenes digitales para documentar el tamaño de la herida durante el seguimiento del tratamiento. En diferentes momentos, después de sacrificar a los ratones, se recogió la región de la lesión cutánea tratada y se preparó para el análisis histológico.

Las muestras recogidas en tiempos posquirúrgicos predeterminados (3, 7 y 21 días) se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 24 horas antes de la adición de parafina para obtener secciones de tejido. Las secciones de 5 pm de espesor se tiñeron con el uso de hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson. Para cada muestra, se adquirieron imágenes de diferentes áreas mediante un microscopio Zeiss Axiovert 200M (Zeiss, Milán, Italia) con un aumento de 100*. La evaluación del área regenerada se realizó utilizando parámetros para la evaluación del proceso de curación de heridas, como se describe en la bibliografía (Abramov et al., "Histologic characterization of vaginal vs. abdominal surgical wound healing in a rabbit model", Wound Rep Reg (2007) 1580­ 86).

Las puntuaciones tenidas en cuenta estaban relacionadas con la inflamación aguda y crónica y con el depósito de tejido de granulación, de acuerdo con los parámetros de Abramov (2007). Para eliminar la variabilidad entre animales, para cada ratón se calculó la diferencia entre la puntuación asignada a la lesión tratada (con secretoma) y la atribuida a la lesión control (alginato solo). Las puntuaciones obtenidas se trataron mediante ANOVA multifactorial. Los resultados se muestran en la tabla 8 a continuación y en las figuras 6 a 8.

TABLA 8

Los resultados sugieren una mayor eficacia de las membranas de alginato/secretoma con respecto a las membranas de alginato solo en el proceso de curación de heridas. No se encontraron diferencias entre el uso de secretoma fresco y secretoma liofilizado.

La inflamación aguda es un mecanismo de defensa esencial puesto en marcha por el cuerpo para eliminar los desechos celulares formados como resultado del daño tisular, desencadenando así el proceso de curación. Sin embargo, la prolongación de una inflamación aguda puede ser perjudicial. El tratamiento con secretoma indujo un proceso inflamatorio agudo que a los 3 y 7 días fue prevalente en los controles y que disminuyó de manera gradual hasta los 21 días, cuando no hubo diferencias significativas entre los tratados y los controles (Figura 6).

La extinción de la inflamación aguda es fundamental para prevenir la aparición de un proceso inflamatorio crónico que conduce a un retraso en la curación de heridas y a la formación de cicatrices. El tratamiento con secretoma retrasó la aparición de un proceso inflamatorio crónico a corto plazo (a los 3 días prevaleció en los controles respecto a los tratados), mientras que a los 21 días no hubo diferencia significativa entre tratados y controles (Figura 7).

Finalmente, el tratamiento con secretoma condujo a un aumento del depósito de tejido de granulación a los 21 días con respecto al control, mostrando el inicio de la neoangiogénesis, que es un proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos que se produce como consecuencia de la producción masiva de VEGF (Figura 8).

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de producción de microvesículas y/o exosomas, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

(i) recoger un líquido biológico que comprende microvesículas y/o exosomas,

(ii) dializar o ultrafiltrar dicho líquido biológico utilizando una membrana que tenga un valor liminar (valor de corte) igual o menor a 5.000 dalton y un líquido de diálisis o ultrafiltración,

(iii) añadir un crioprotector a la solución dializada o ultrafiltrada obtenida de la etapa (ii) y

(iv) liofilizar la solución resultante de la etapa (iii) obteniendo un polvo liofilizado que comprende microvesículas y/o exosomas en una cantidad igual o superior al 20 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado; y al menos un crioprotector en una cantidad igual o inferior al 80 % p/p.

2. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho líquido biológico es un sobrenadante de células cultivadas, preferentemente recogido de células cultivadas en un medio de cultivo, en particular, un medio de cultivo mínimo, durante al menos 4 horas.

3. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que dichas células son células madre y de manera específica células madre mesenquimatosas.

4. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que dichas células madre son células madre mesenquimatosas aisladas de tejido adiposo mediante lavado con solución tampón y digestión enzimática.

5. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 2 a 4, caracterizado por que dichas células se cultivan en un medio de cultivo que contiene nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa.

6. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho líquido biológico es un líquido corporal.

7. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho líquido de diálisis o ultrafiltración es agua o una solución tampón con una concentración de sales menor que la concentración de sales del líquido biológico.

8. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho líquido de diálisis comprende un polioxialquileno que tiene un peso molecular promedio igual o superior a 100 g/mol, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular promedio igual o superior a 100 g/mol, preferentemente igual o superior a 300 g/mol, más preferentemente igual o superior a 500 g/mol, e igual o inferior a 4000 g/mol, preferentemente igual o inferior a 3000 g/mol, más preferentemente igual o inferior a 2500 g/mol.

9. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en azúcares, aminoácidos, polioles o mezclas de los mismos.

10. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en manitol, lactosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, glucosa, maltosa, fructosa, rafinosa, arginina, alanina, glicina, histidina, etilenglicol, 1,3-propanodiol, glicerol, ciclodextrinas y mezclas de los mismos.

11. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en manitol, glicina o mezclas de los mismos.

12. El proceso de producción de microvesículas y/o exosomas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la etapa de liofilización (iv) comprende las siguientes etapas:

a) congelar la solución dializada o ultrafiltrada obtenida de la etapa (iii) operando a una temperatura inferior a -50 °C, preferentemente inferior a -70 °C,

b) sublimar la solución congelada al vacío en un liofilizador.

13. Producto en forma de polvo liofilizado obtenido mediante el proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende microvesículas y/o exosomas que tienen un diámetro entre 20 y 5.000 nm y un diámetro promedio entre 50 y 200 nm, y al menos un crioprotector; donde dicho polvo liofilizado comprende dichas microvesículas y/o exosomas en una cantidad igual o superior al 20 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado; y dicho al menos un crioprotector en una cantidad igual o inferior al 80 % p/p.

14. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que dicho crioprotector se selecciona del grupo que consiste en azúcares, aminoácidos, polioles o mezclas de los mismos.

15. Producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado por que dicho polvo liofilizado comprende dichas microvesículas y/o exosomas en una cantidad igual o superior al 30 % p/p y preferentemente igual o superior al 40 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado; y dicho al menos un crioprotector en una cantidad igual o inferior al 70 % p/p, preferentemente igual o inferior al 60 % p/p con respecto al peso total de dicho polvo liofilizado.

16. Producto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado por que dicho polvo liofilizado contiene dichas microvesículas y/o exosomas en una cantidad comprendida entre el 20 % y el 60 % p/p, y dicho al menos un crioprotector en una cantidad comprendida entre el 80 % y el 40 % p/p.

17. Producto de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que dichas microvesículas y/o exosomas comprenden nanopartículas cargadas con una sustancia biológicamente activa.

18. Producto de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado por que dicha sustancia biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en fármacos cardiovasculares, fármacos para sistema nervioso central y periférico, fármacos analgésicos, fármacos antimicrobianos, fármacos para quimioterapia, fármacos antitumorales, fármacos de inmunoterapia antitumoral, vacunas, hormonas, fármacos peptídicos y proteicos, vitaminas, extractos de plantas y fitocomplejos.

19. Composición farmacéutica que comprende una sustancia biológicamente activa y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, cargándose dicha sustancia biológicamente activa en nanopartículas comprendidas en microvesículas y/o exosomas liofilizados que tienen un diámetro entre 20 y 5.000 nm y un diámetro promedio entre 50 y 200 nm; caracterizada por que dichas microvesículas y/o exosomas liofilizados están comprendidos en un producto en forma de polvo liofilizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 junto con al menos un crioprotector.

20. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizada por que dicha sustancia biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste en fármacos cardiovasculares, fármacos para sistema nervioso central y periférico, fármacos analgésicos, fármacos antimicrobianos, fármacos para quimioterapia, fármacos antitumorales, fármacos de inmunoterapia antitumoral, vacunas, hormonas, fármacos peptídicos y proteicos, vitaminas, extractos de plantas y fitocomplejos.

21. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada por que dichos fármacos cardiovasculares se seleccionan del grupo que consiste en antihipertensivos, fármacos antiarrítmicos y diuréticos.

22. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada por que dichos fármacos para el sistema nervioso central y periférico se seleccionan del grupo que consiste en anestésicos, hipnóticos, sedantes, ansiolíticos y fármacos antiparkinsonianos.

23. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada por que dichos fármacos analgésicos se seleccionan del grupo que consiste en fármacos antinflamatorios y analgésicos.

24. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada por que dichos fármacos antimicrobianos se seleccionan del grupo que consiste en fármacos sulfamídicos, antibióticos, antivíricos y fármacos antifúngicos.

25. Composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 19 a 24 para su uso en el tratamiento de artrosis, enfermedades cardiovasculares, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas, dolor, insuficiencia medular, diabetes y cáncer.

26. Cosmético o composición cosmética que comprende una sustancia biológicamente activa y al menos un excipiente cosméticamente aceptable, cargándose dicha sustancia biológicamente activa en nanopartículas comprendidas en microvesículas y/o exosomas liofilizados que tienen un diámetro entre 20 y 5.000 nm y un diámetro promedio entre 50 y 200 nm; caracterizada por que dichas microvesículas y/o exosomas liofilizados están comprendidos en un polvo liofilizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 junto con al menos un crioprotector.

27. Cosmético o composición cosmética de acuerdo con la reivindicación 26 para su uso en el tratamiento de antienvejecimiento de la piel.

28. Composición farmacéutica que comprende microvesículas y/o exosomas que tienen un diámetro entre 20 y 5.000 nm y un diámetro promedio entre 50 y 200 nm y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para el tratamiento tópico de lesiones y heridas agudas y crónicas; caracterizada por que dichas microvesículas y/o exosomas liofilizados están comprendidos en un polvo liofilizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 junto con al menos un crioprotector.

29. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicho excipiente farmacéuticamente aceptable comprende una membrana para apósitos avanzados, y dicha membrana para apósitos avanzados comprende opcionalmente alginato de sodio, alginato de calcio, derivados de la celulosa (preferentemente carboximetilcelulosa), ésteres de ácido hialurónico, proteínas de seda y tela no tejida.