CN109641013B - 包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体的皮肤创伤的治疗用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分的皮肤创伤的预防与治疗用药学组合物、含有其的药学制剂及其制备方法。根据本发明的基于外泌体的治疗剂具有如下优点：由于其为无细胞(cell‑free)制剂，因此，致肿瘤性的危险低，不存在移植排斥反应的问题；在全身给药时不存在毛细血管阻塞的顾虑；由于是分离物质而非细胞，能够以成品(off the shelf)的形式开发药剂，从而降低生产成本；且经过凝血酶处理,以低浓度的外泌体获得优秀的血管生成及皮肤创伤的治疗效果。

Description

包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体的皮肤创伤的治疗用组 合物
技术领域
本发明涉及包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分的皮肤创伤(Skin Wound)的预防与治疗用药学组合物、含有其的药学制剂及其制备方法。
背景技术
皮肤是对身体起到保护作用的防御膜，是对于疾病的机体的第一道防线，并且，表皮(epidermis)起到防止微生物侵入的屏障的作用。由此，在创伤、烧伤、擦伤、刮伤以及其他皮肤损伤的治疗过程中，首要目的是迅速缝合以预防感染，以及治疗创伤。
此时，创伤的治疗过程通常是包括炎症(inflammation)、增殖(proliferation)、重塑(remodelling)等三个步骤的复杂过程。第一步骤是凝血(clotting)以实现止血(haemostasis)，然后为破坏细菌及坏死组织而补充中性白血球，之后补充巨噬细胞。第二步骤期间，发生血管生成(angiogenesis)，此时，内皮细胞移动至创伤部位，与此同时，成纤维细胞移动至创伤部位，并帮助肉芽组织(granulation tissue)的生成。肉芽组织的生成带来再上皮化(reepithelialisation)。在最后的步骤期间，胶原蛋白的生成与破坏水平相同，愈合的创伤为实现最大强度而慢慢变化。在治疗创伤的过程中，如果上述步骤中的任一个环节不能适时起到作用，则会发生推迟或损伤从而最终转至慢性状态。
慢性创伤(chronic wound)是指需要进行8周以上治疗的皮肤的开放性损伤(openwound)，受损部位的治疗过程多与糖尿病并发症有关，且可能会导致较高的截肢率甚至死亡等严重结果。约15％的糖尿病患者因无法治愈的慢性创伤遭受痛苦。由此，创伤不仅是个人问题，更是重要的社会性问题，因此应在早期迅速治疗，以减少2次感染的危险。
有效的创伤治疗需要通过包括细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)的沉积、细胞增殖/移动等在内的复杂的分子生物学事件的有组织的统合调整。与慢性创伤的发生有关的一个主要因素是由局部成纤维细胞(local fibroblasts)及炎症细胞(inflammatory cells)分泌的细胞因子分泌系统的损伤，这会导致血管生成(angiogenesis)的降低。
一方面，众所周知，干细胞(包括其多能性)是参与组织的再生、治疗及免疫反应的细胞，因此致力于利用上述特性将间充质干细胞与脐带血、骨髓等进行分离培养，以作为治疗多种疾病、症状的治疗剂的开发处于持续进行当中。
然而，上述利用干细胞自身的治疗方法一直以来具有下述局限性与副作用。
第一，基本上，细胞治疗剂无法排除因DNA转移(DNA transfer)引起的致肿瘤性(tumorogenicity)的可能性，第二，由于干细胞自身尺寸较大，会诱发血管阻塞(vascularobstruction)或心肌梗塞，第三，使用如脐带血的同种细胞进行移植(同种移植)时，存在因细胞表面抗原(surface antigen)而引起排斥反应的问题，第四，通常，细胞治疗剂制备工艺苛刻，在保管运输方面存在许多限制，因此存在生产成本高的局限性。
由于干细胞所具有的先天局限性，作为减少副作用的同时提高治疗效果的方案，开发出了通过基因操作来改善效能的方法，但现实情况中，还未出现明确的解决方案。
外泌体是由多种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径为约30-100nm)，在通过电子显微镜的研究中观察到，其并非直接从原生质膜中分离，而是来源于被称为多泡体(multivesicular bodies,MVBs)的细胞内的特定区域，并向细胞外排出并分泌。即，当产生多泡体与原生质膜的融合时，囊泡向细胞外环境排出，而其被称为外泌体。并没有明确的研究表明这种外泌体是由何种分子机制制成，但所知的是，除了红细胞以外，还存活有包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、树状细胞、血小板、巨噬细胞等在内的多种免疫细胞及肿瘤细胞、干细胞等的状态下，生产并分泌外泌体。
尤其，干细胞来源的外泌体不仅含有受体及蛋白质，还含有核成分，因此能够起到细胞间交流的作用。并且，上述干细胞来源的外泌体与干细胞相比，所含有的动物血清相对较少，从而还能够排除由于动物血清感染的症状(动物病,zoonosis)的危险性。考虑上述外泌体的特性，可以期待利用外泌体的细胞治疗法能够成为克服现有的干细胞治疗方法的局限性的新模式。
与此相关地，韩国公开专利第2012-0133709号中对由皮肤细胞获得的外泌体的皮肤再生效果进行了公开，然而直到目前，没有任何公开内容表明凝血酶处理干细胞来源的外泌体相比现有技术对治疗皮肤创伤具有优秀的治疗效果。
发明的内容
技术问题
为此，本发明人对于皮肤创伤，为克服干细胞治疗剂所具有的限制，同时改善治疗效果而进行研究的结果，确认干细胞来源的外泌体、尤其是经过凝血酶处理的干细胞来源的外泌体能够显著提高血管生成及皮肤创伤的治疗治疗效果的事实，从而完成了本发明。
由此，本发明的目的在于提供一种包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体的皮肤创伤的预防或治疗用药学组合物。
然而，本发明所要实现的技术方案并非限于上述言及的课题，未言及的其他课题也能够通过下述内容由本领域普通技术人员所明确理解。
技术方案
本发明提供一种皮肤创伤的预防或治疗用药学组合物，包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分。
根据本发明的一实施方式，所述干细胞是由间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞(mesenchymal stromal cell)、人组织来源间充质干细胞及多能干细胞组成的组中选择的干细胞。
根据本发明的另一实施方式，所述间充质干细胞来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。
根据本发明的又一实施方式，通过促进血管内皮细胞的生长实现的血管生成(angiogenesis)进行皮肤创伤的治疗。
根据本发明的又一实施方式，所述皮肤创伤是由表皮、真皮或皮下组织的缺损引起。
根据本发明的又一实施方式，所述药学组合物以口服或非口服的方式给药。
根据本发明的又一实施方式，所述药学组合物还包括由培养基、细胞因子、生长因子及基因组成的组中选择的辅助成分。
根据本发明的又一实施方式，所述外泌体的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或血管生成因子的表达得到提高。
根据本发明的又一实施方式，所述生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF，brain-derived neurotropic factor)、成纤维细胞生长因子(FGF，fibroblast growth factor)、肝细胞生长因子(HGF，hepatocyte growth factor)、神经生长因子(NGF，nerve growthfactor)或血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)。
另外，本发明提供一种含有上述组合物的皮肤创伤的预防或治疗用药学制剂。
根据本发明的一实施方式，所述制剂为注射剂型、输液剂型、喷雾剂型，液体剂型或贴剂型。
根据本发明的另一实施方式，所述制剂还包括在药学上可接受的载体。
而且，本发明提供一种包含凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分的皮肤创伤改善用医药外用制剂。
根据本发明的一实施方式，通过血管生成(angiogenesis)实现皮肤创伤的改善。
根据本发明的另一实施方式，所述外泌体的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或血管生成因子的表达得到提高。
根据本发明的又一实施方式，所述医药外用制剂为由液体剂、软膏剂、乳剂，喷雾剂、贴剂、凝胶剂及气雾剂组成的组中选择的皮肤外用制剂形态。
另外，本发明提供一种上述药学组合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：步骤(a)，培养干细胞后处理凝血酶；步骤(b)，从所述步骤(a)的培养液中分离外泌体；及步骤(c)，制备含有从所述步骤(b)中分离的外泌体作为有效成分的组合物。
根据本发明的一实施方式，所述步骤(a)的凝血酶以1-1000单位/ml的浓度包含于培养基内。
根据本发明的另一种实施方式，所述步骤(c)的外泌体利用离心分离。
根据本发明的又一种实施方式，所述离心分离是以5000-500000g执行10分钟至5个小时
并且，本发明提供一种皮肤创伤的治疗方法，所述方法包括将凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)向个体给药的步骤。
而且，本发明提供一种凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)的皮肤创伤的预防或治疗用途。
发明的效果
根据本发明的基于外泌体的治疗剂，由于其为无细胞(cell-free)制剂而不包含DNA，因此，致肿瘤性的危险低，并且，不存在细胞表面抗原从而不存在移植排斥反应的问题。
另外，与细胞相比尺寸非常小，在全身给药时不存在毛细血管阻塞的顾虑，而且，由于是分离物质而非细胞，因此能够以成品(off the shelf)的形式开发药剂，从而降低生产成本。
而且，与未处理干细胞相比，经过凝血酶处理的干细胞来源的外泌体即使在少量的情况下也具有优秀的皮肤创伤治疗效果，因此，能够显著减少用于生成治疗剂量的外泌体而所需的干细胞的需求量，从而具有显著降低治疗剂生产成本的优点。
由此，根据本发明，在解决现有干细胞治疗剂所具有的问题的同时，还能够显著改善治疗效能，可以有效使用于皮肤创伤的治疗中。
附图说明
图1为确认对干细胞进行凝血酶处理时外泌体的分泌被激活的过程的TEM图像分析结果。
图2为确认在凝血酶处理干细胞来源的外泌体中作为外泌体标志物的CD63及CD9是否正常表达的西方墨点法结果。
图3为显示通过凝血酶处理使外泌体内生长因子(BDNF、FGF、HGF、NGF、VEGF)、抗炎性细胞因子(IL-6)等的表达得到提高的免疫分析结果。
图4a为显示凝血酶处理干细胞来源的外泌体依赖于浓度而发挥血管生成效果的小管形成实验(tube formation assay)的结果，且图4b为对此进行量化的图表。
图5a为显示血管生成效果根据外泌体的来源细胞的种类而呈现差异的小管形成实验(tube formation assay)结果，且图5b为对此进行量化的图表。
图6a为显示凝血酶处理干细胞来源的外泌体在体内(in vivo)皮肤创伤动物模型中的皮肤创伤治疗效果的结果，且图6b为对此进行量化的图表。
图7为显示对成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体(fibroblast exosome)、未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(naive MSC exosome)、经过凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(thrombin MSC exosome)以及缺氧(hypoxia)预处理干细胞来源的外泌体(hypoxia MSC exosome)在体内(in vivo)皮肤创伤动物模型中的皮肤创伤治疗效果的比较结果。
具体实施方式
本发明提供一种包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分的皮肤创伤的预防与治疗用药学组合物。
本发明中“干细胞”是指未分化的细胞，其具有自我复制能力的同时，具有能够分化为两个以上的不同种类的细胞的能力。本发明的干细胞可以是自体或同种来源干细胞，且可来源于包括人类及除人类以外的哺乳动物在内的任意种类的动物，而无论上述干细胞来源于成体或胚胎都并非限定于此。
本发明的干细胞包括胚胎干细胞或成体干细胞，优选为成体干细胞。所述成体干细胞可以是间充质干细胞、人组织来源间充质基质细胞(mesenchymal stromal cell)、人组织来源间充质干细胞或多能干细胞，优选为间充质干细胞，但并非限定于此。所述间充质干细胞能够来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜及胎盘等，但并非限定于此。
本发明中“脐带血”是指由连接胎盘与胎儿的脐静脉中采集的血液。脐带血是分娩时自然产生的附带产物，相比要求多次手术的骨髓等一般的间叶组织采集更加容易，且相比骨髓移植，脐带血的保管产业活跃，已经搭建有基础设施，因此更容易寻找捐献者。进一步地，由于脐带血来源细胞是作为在组织或器官移植中引发排斥反应的最主要原因的组织相容性抗原HLA-DR(II类)尚未表达的细胞，其能够避免或最小化现有的移植手术过程中诱发的排斥反应等免疫反应，因此，不仅能够使用自体脐带血还能够使用他体脐带血。
本发明中“外泌体(exosome)”是指由多种细胞分泌的膜结构的小囊泡(直径约30-100nm)，是因多泡体与原生质膜进行融合而向细胞外环境排出的小囊泡。所述外泌体包括自然分泌的外泌体或人工分泌的外泌体。
本发明中的“皮肤创伤”的含义包括表皮、真皮或皮下组织的缺损。
本发明的“皮肤创伤的预防或治疗”包括皮肤创伤的减轻、缓解及症状的改善，并且包括降低出现皮肤创伤的可能性的含义。在本发明中，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中进行本发明的“凝血酶(thrombin)处理干细胞”处理的结果，确认到人脐静脉内皮细胞的生长得到促进，从而引发血管生成。
血管生成(angiogenesis)是指已有的血管内皮细胞分解、迁移、分裂及分化细胞外基质，从而形成新的毛细血管的现象，其必然出现在创伤治疗的生理过程中，因此能够通过确认血管生成效果来验证创伤治疗的效果。即，血管生成必然出现在受损的皮肤组织再生所必须的创伤恢复过程中。在创伤的初期阶段，由于细胞的坏死与血管的破坏会发生炎症反应，在此炎症反应之后，与血液成分脱离血管现象，血小板活性化及血液凝固一起，将经历生成激肽释放酶、凝血酶及溶血酶等生物学介质的一系列过程。
本发明的由“凝血酶(thrombin)处理的干细胞”与未处理干细胞相比，在对细胞活力(cell viability)、氧化功能(oxidative function)等细胞稳定性上未产生变化的情况下，提高作为干细胞的主要作用机制的旁分泌性质(paracrine property)，从而能够强化干细胞的功能/效能。进一步地，通过凝血酶处理，不仅能够加强干细胞来源的外泌体的治疗效能，还能够增加外泌体的分泌量。
此时，就旁分泌(paracrine)而言，可以是生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或再生因子的增加，且生长因子是促进细胞的分裂或生长、分化的蛋白质性质的生理活性物质，其可包括脑源性神经营养因子(BDNF，brain-derived neurotropic factor)、成纤维细胞生长因子(FGF，fibroblast growth factor)、肝细胞生长因子(HGF，hepatocyte growthfactor)、神经生长因子(NGF，nerve growth factor)、血管内皮生长因子(VEGF，vascularendothelial growth factor)，白细胞介素-6(IL-6，Interleukin-6)等。尤其，血管内皮生长因子(VEGF)是调节血管形成的代表性蛋白质。血管内皮生长因子(VEGF)与血管内皮细胞内的VEGF受体1、2或3(VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3)结合，诱导VEGF受体(VEGFR)的酪氨酸磷酸化，引发血管内皮细胞的活性化，最终，对血管生成过程带来重要的影响。
本发明的药学组合物能够在不受特别限制的条件下对个体以多种途径进行给药，例如，能够以口服或非口服的方式给药。
本发明的药学组合物除了干细胞来源的外泌体以外，还能够包括一种以上具有皮肤创伤治疗效果的公知的辅助成分。例如，还可包括有效治疗皮肤创伤的基因[例如，抗炎性细胞因子(anti-inflammatory cytokine)基因、对于炎性细胞因子(inflammatorycytokine)的siRNA或反义引物(antisense primer)]或包含其的表达载体、或者提供自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)效果的细胞因子[例如，白细胞介素-10(interleukin-10)]、生长因子[例如角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor)]及它们的组合组成的组中选择的一种以上的辅助成分。
本发明的药学组合物的优选的给药量根据个体的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及期间而不同，且能够由本领域技术人员适当选择。上述组合物的给药可以是一天一次，或分为数次，并非限定于此。
为治疗皮肤创伤，能够单独使用本发明的药学组合物，也能够与手术、放射治疗、激素治疗、化学治疗及使用生物学反应调节剂的方法一同并用。
本发明的组合物还能够适当包括通常用于药学组合物制备的载体。例如，对于注射剂而言，还能够包括保存剂、无痛剂、可溶剂或稳定剂等；对于局部给药用制剂而言，还能够包括基料(base)、赋形剂、润滑剂或保存剂等。
本发明的组合物能够通过药学领域的一般方法以适合向个体身体内给药的单位给药型制剂进行剂型而实现给药。符合上述目的的剂型，对于非口服给药制剂而言，优选为例如注射用安瓿的注射剂、例如输液袋的输液剂，及例如气雾剂的喷雾剂等。上述注射用安瓿瓶能够在使用前与注射液进行混合而调制，其中注射液能够使用生理盐水、葡萄糖、林格氏液等。并且，输液袋能够使用聚氯乙烯或聚乙烯材料。本发明的给药是指以任意适合的方法向个体提供既定量的本发明的组合物。
本发明的药学组合物的优选的给药量根据个体的状态及体重、疾病程度、药物形态、给药途径及期间而不同，且能够由本领域技术人员适当选择。上述组合物的给药可以是一天一次，或分为数次，并非限定于此。
另外，本发明提供一种将凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)作为有效成分的皮肤创伤改善用医药外用制剂。
本发明所提供的医药外用制剂是从液体剂、软膏剂、乳剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂及气雾剂等构成的组中选择的皮肤外用制剂形态，具体能够作为消毒清洁剂、沐浴泡沫、漱口水、湿巾、香皂、洗手液、加湿器填充剂、口罩、软膏剂或过滤器填充剂组成物进行使用。
另外，本发明提供上述药学组合物的制备方法，所述方法包括：步骤a，培养干细胞后进行凝血酶处理的步骤；步骤b，从所述步骤a的培养液中分离外泌体；及步骤c，制备含有从所述步骤b中分离的外泌体作为有效成分的组合物。
在本发明中，凝血酶处理浓度是加强干细胞/外泌体的效能的适当浓度即可，并无特别限制，但优选地，以1-1000单位/ml的浓度包含于培养基。
本发明对于分离外泌体的方法没有限制，例如，可以是在培养液中通过离心分离、超高速离心分离、过滤器过滤、凝胶过滤层析法、自由流电泳、毛细管电泳及利用聚合物的分离等方法及上述方法的组合进行分离，优选为离心分离/超高速离心分离。此时，离心分离/超高速离心分离优选为在4℃，3000-100000g中执行10分钟至5个小时。
在本发明中，用于细胞培养的培养基是指包含糖、氨基酸、各种营养物质、血清、生长因子、无机质等细胞生长及增殖等所需的必要因素且用于在体外(in vitro)使干细胞等细胞生长及增殖的混合物。本发明中能够使用的培养基为杜氏改良Eagle培养基(DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、最小必需培养基(MEM，Minimal EssentialMedium)、基础Eagle培养基(BME,Basal Medium Eagle)、RPMI1640、杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-10(DMEM/F-10，Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient MixtureF-10)、杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12(DMEM/F-12，Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture F-12)、α-最小必需培养基(α-MEM，α-Minimal essentialMedium)、格拉斯哥最小必需培养基(G-MEM,Glasgow's Minimal Essential Medium)、伊格尔改良杜氏培养基(IMDM，Isocove's Modified Dulbecco's Medium)及敲除DMEM(KnockOut DMEM)等商业化制备的培养基或人为合成的培养基，但并非限定于此。
并且，本发明提供一种皮肤创伤治疗方法，所述方法包括将凝血酶处理干细胞来源的外泌体(exosome)给药至个体的步骤。
本发明的“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地，指人类或除人类以外的灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马，以及牛等哺乳类。
下面，为增进对本发明的理解，提出实施例。但，下述实施例仅用于更容易地理解本发明，本发明的内容并非由实施例所限定。
[实施例]
实施例1:对干干细胞通过凝血酶处理诱导外泌体分泌及增强效能
1-1.通过凝血酶诱导外泌体分泌
将人类脐带血来源间充质干细胞(3×105个)分注至100mm培养皿(orangescientific cat#4450200)后培养了一周。确认细胞在培养皿饱和增殖后，替换为稀释有50单位/ml凝血酶(REYON Pharmaceutical.Co.,LTD)的无血清-培养基(MEMα培养基)，再次培养了6个小时。
此时，为确认是否通过凝血酶处理使得外泌体由间充质干细胞活跃地分泌，通过透射电子显微镜(TEM,Transmission Electronic Microscopy)图像观察了外泌体的分泌过程。其结果，如图1所示，能够得知通过凝血酶的刺激能够诱导外泌体的分泌。
之后，将所述培养液分装至离心分离试管，在4℃，6000rpm条件下离心分离30分钟，并将上清液移至新的试管，去除了细胞碎片(debris)。再次，将所述上清液在4℃，100000rpm条件下超高速离心分离2小时至4小时后，进一步去除上清液后，获得了外泌体。(最终浓度:15μg/ml).
此时，为确认所获得的产物是否为外泌体，通过西方墨点法验证了作为公知的外泌体标志物的CD63及CD9(System Bioscience,Mountain View,CA,USA)的表达。其结果，如图2所示，由凝血酶处理干细胞所获得的外泌体正常表达CD63及CD9，由此确认为外泌体。
1-2.通过凝血酶增强外泌体效能
确认了由所述实施例1-1获得的外泌体，是否通过凝血酶处理提高了生长因子或诸如IL-6的抗炎性细胞因子等的表达。
具体地，利用裂解缓冲液(lysis buffer)溶解所述外泌体膜后，分离外泌体内的蛋白质，进而用Procarta免疫测定试剂盒(Procarta immunoassay kit，affymatrix，美国)测量了外泌体内BDNF、FGF、HGF、NGF、VEGF及IL-6的量。
其结果，如图3所示，通过凝血酶处理，外泌体内BDNF(脑源性神经营养因子；brain-derived neurotropic factor)、FGF(成纤维细胞生长因子；fibroblast growthfactor)、HGF(肝细胞生长因子；hepatocyte growth factor)、NGF(神经生长因子；nervegrowth factor)、VEGF(血管内皮生长因子；vascular endothelial growth factor)，IL-6(白细胞介素-6；Interleukin-6)的表达，相比由未经过凝血酶处理的干细胞获得的外泌体(对照组，正常组(normal))有所增加。
由此，以上结果表示通过凝血酶处理干细胞来源的外泌体的细胞再生、血管再生、抗炎症效果得到了增强。
实施例2:体外(in vitro)血管生成效果：小管形成实验(tube formation assay)
2-1.基于外泌体浓度的效果
进行了利用生长因子减少基质胶(Growth factor-reduced Matrigal，10㎎/ml)的小管形成实验，以确认本发明的“凝血酶处理干细胞来源的外泌体”是否能够通过诱导血管内皮细胞的分化对小管形成(血管生成)产生影响。
具体地，将人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells：HUVECs)在包括低血清生长补充物(Low Serum Growth Supplement，LSGS)的Medium200PRF培养基中培养12小时后，处理胰蛋白酶并进行收集，并在含有5％的牛胎儿血清的M199培养基再悬浮。将生长因子减少基质胶分别以250ml分注至24细胞培养孔内，在37℃及CO2培养基进行聚合。将HUVEC细胞以每孔4×104个细胞(cells)的浓度放入具有聚合的基质胶的孔中，并将从实施例1获得的“凝血酶处理干细胞来源的外泌体”分别按照2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml的浓度进行添加。在37℃及CO2培养基中培养24小时后，对培养物进行拍照(×40)，利用Image J(National Institute of Health；国立卫生研究所)公开软件程序测量形成的小管的长度。
其结果，如图4a及图4b所示，本发明的由凝血酶处理干细胞来源的外泌体相比对照组(未处理组NC)，剂量依赖性(dose-dependent)诱导血管内皮细胞的分化，由此，增加小管的形成。
2-2.外泌体来源细胞别评价
使用未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(MSC ECV)、凝血酶处理干细胞来源的外泌体(MSC throm ECV)、未进行凝血酶处理的成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体((fibroblast ECV)、凝血酶处理的成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体((fibroblast throm ECV)对HUVEC细胞进行处理，处理方式除了分别以10ug/ml浓度处理外，以与上述实施例2-1相同的方式进行实验。
其结果，如图5a及图5b所示，从本发明的凝血酶处理干细胞获得的外泌体(MSCthrom ECV)相比未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(MSC ECV)具有显著提高的血管生成能力。不仅如此，成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体不论是否进行凝血酶处理，完全没有发挥血管生成能力，由此能够确认，治疗效果取决于外泌体的来源细胞的种类/能力。
实施例3:体内(in vivo)皮肤创伤治疗效果
所有动物实验获得了三星生命科学研究所实验动物委员会(Research AnimalLaboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute,韩国)的许可，并遵循机构指导手册。
首先，在成年大鼠(adult rat)的后背部分以活检穿孔器(punch biopsy)穿孔生成皮肤创伤动物模型后，将成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体(fibroblastexosome)、未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(naive MSC exosome)、凝血酶处理干细胞来源的外泌体(thrombin MSC exosome)分别以20ug混合至生理盐水(saline)，并制备成10ul的制剂后涂覆于创伤表面。
其结果，如图6a及图6b所示，本发明的凝血酶处理干细胞来源的外泌体(thrombinMSC exosome)相比未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(naive MSC exosome)具有显著提高的创伤处理效果。不仅如此，成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体与其对照组(生理盐水(saline))类似，完全没有发挥创伤治疗效果。
进一步地，在SD大鼠(SD-rat)的背部进行除毛后以活检穿孔器(punch biopsy)穿孔而诱导损伤，之后分别涂覆成纤维细胞(fibroblast)来源的外泌体(fibroblastexosome)、未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(naive MSC exosome)、凝血酶处理干细胞来源的外泌体(thrombin MSC exosome)以及缺氧(hypoxia)预处理干细胞来源的外泌体(hypoxia MSC exosome)后，观察皮肤恢复状态。
其结果，如图7所示，相比正常组(Normal)，对皮肤通过活检穿孔器(punchbiopsy)施加损伤的创伤对照(wound control)组(WC)，没有恢复到正常皮肤组织，且在投放成纤维细胞来源的外泌体时其显示出同样的结果。相反，未进行凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(naive MSC exosome)与缺氧(hypoxia)预处理干细胞来源的外泌体(hypoxiaMSC exosome)显示出一定的好转倾向，在凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(thrombinMSC exosome)中，则显示出接近正常组织的皮肤恢复状态，呈现显著提高的创伤治疗效果。
由上述结果可知，治疗效果取决于外泌体的来源细胞的种类/能力。
上述对本发明说明为示例性说明，且在不改变本发明的技术思想与所必须的特征的情况下，本发明所属领域的普通技术人员能够容易地将其改变为其他具体形态。因此，上述叙述的实施例在任何方面仅作为示例，而非用于进行限定。
工业实用性
根据本发明的基于凝血酶处理干细胞来源的外泌体的治疗剂，能够解决现有的干细胞治疗剂所具有的移植排斥反应或生产成本高等问题，同时，能够显著改善治疗效果，能够有益地使用于多种皮肤创伤的治疗。

Claims (15)

1.凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(exosome)在制备用于预防或治疗皮肤创伤的药物组合物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述干细胞是由间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞（mesenchymalstromalcell）、人组织来源间充质干细胞及多能干细胞组成的组中选择的干细胞。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，
所述间充质干细胞来源于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
通过促进血管内皮细胞的生长实现的血管生成(angiogenesis)进行皮肤创伤的治疗。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述药学组合物还包括由培养基、细胞因子、生长因子及基因组成的组中选择的辅助成分。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述外泌体的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或血管生成因子的表达得到提高。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，
所述生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF，brain-derived neurotropic factor)、成纤维细胞生长因子(FGF，fibroblast growth factor)、肝细胞生长因子(HGF，hepatocyte growth factor)、神经生长因子(NGF，nerve growth factor)或血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)。
8.权利要求1中限定的药物组合物在制备用于预防或治疗皮肤创伤的药学制剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，
所述制剂为喷雾剂型、液体剂型或贴剂型。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，
所述制剂为注射剂型或输液剂型。
11.凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(exosome)在制备用于预防或治疗皮肤创伤的改善用医药外用制剂中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，
通过血管生成(angiogenesis)实现皮肤创伤的改善。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，
所述外泌体的生长因子、免疫调节因子、抗氧化因子或血管生成因子的表达得到提高。
14.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，
所述医药外用制剂为由液体剂、软膏剂、乳剂、喷雾剂、贴剂、凝胶剂及气雾剂组成的组中选择的皮肤外用制形态。
15.凝血酶处理的干细胞来源的外泌体(exosome)在制备用于预防或治疗皮肤创伤的药物中的用途。
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