CN114904043B

CN114904043B - 复合水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114904043B
Application number: CN202210460308.9A
Authority: CN
Inventors: 马廉; 谢中建; 麻晓鹏; 徐唱; 裴悦
Original assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Current assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114904043A

Abstract

本发明公开了复合水凝胶及其制备方法和应用。本申请的第一方面，提供一种复合水凝胶，复合水凝胶包括水凝胶和负载在水凝胶中的外泌体，外泌体来源于包皮间充质干细胞。根据本申请实施例的复合水凝胶，至少具有如下有益效果：申请人在实验过程中发现，包皮间充质干细胞来源的外泌体相比于其它类型的外泌体而言，在促进细胞迁移、促进血管生成、抗炎等方面有非常显著的优势，因此在应用到水凝胶材料中后，能够达到外泌体的持续稳定释放，从而解决糖尿病慢性伤口的诸多问题，实现更好的治愈性和更优秀的治疗效果。

Description

复合水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及高分子材料技术领域，尤其是涉及复合水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病伤口愈合通常会延迟，并导致严重的发病率、生活质量受损，甚至下肢截肢。在高糖条件下，内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞和炎症细胞功能失调，从而延迟伤口愈合过程。糖尿病慢性伤口的传统疗法是保守的，包括优化血糖控制、换药、清创和抗生素给药。然而，这些方法侧重于为伤口愈合或阻止疾病进展(例如截肢)创造更有利的环境。

水凝胶是一类具有三维高分子网络的高分子材料，其具有高药物或细胞包埋率、近似天然细胞外基质等特点，因而常用于生物医学敷料。然而，现有的水凝胶材料对于糖尿病慢性伤口的治疗仍然难以令人满意，原因在于其无法将机械强度匹配，同时抗菌、抗炎、促血管生成等多种治疗效果也难于整合到一个单独的系统中。因此，有必要提供一种能够对糖尿病慢性伤口实现治愈性和更积极的治疗效果的水凝胶。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种能够对糖尿病慢性伤口实现治愈性和更积极的治疗效果的水凝胶。

本申请的第一方面，提供一种复合水凝胶，复合水凝胶包括水凝胶和负载在水凝胶中的外泌体，外泌体来源于包皮间充质干细胞。

根据本申请实施例的复合水凝胶，至少具有如下有益效果：

申请人在实验过程中发现，包皮间充质干细胞来源的外泌体相比于其它类型的外泌体而言，在促进细胞迁移、促进血管生成、抗炎等方面有非常显著的优势，因此在应用到水凝胶材料中后，能够达到外泌体的持续稳定释放，从而解决糖尿病慢性伤口的诸多问题，实现更好的治愈性和更优秀的治疗效果。

在本申请的一些实施方式中，水凝胶的制备原料包括杂多酸和聚合物，聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸(PMAA)中的至少一种。利用杂多酸与上述聚合物形成水凝胶时，可以通过直接搅拌形成而无需进行任何的改性，制备过程更加方便快捷。同时，形成的刚性交联结构域中，上述聚合物作为柔性成分，确保了水凝胶的柔韧性动态交联网络，从而保证了水凝胶的粘弹性和自愈能力。此外，该水凝胶是由多种非共价相互作用而得到的产物，生物相容性良好的原料成分和简单的凝胶形成机制赋予了水凝胶极低的细胞毒性，因而作为治疗器官损伤的止血剂方面具有重要作用。

在本申请的一些实施方式中，杂多酸选自硅钨酸、磷钨酸、磷钼酸、硅钼酸中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，聚合物为聚乙烯吡咯烷酮。相比于其它聚合物材料，采用PVP与杂多酸制备水凝胶时，无需额外加入有机试剂或高浓度的盐或调节pH值即可成胶，制备过程更加方便，此外能够不破坏待包裹的外泌体，从而可以起到更好的治疗效果。

在本申请的一些实施方式中，聚乙烯吡咯烷酮的摩尔质量为10³～10⁷g/mol。通过调节聚乙烯吡咯烷酮的摩尔质量，可以对形成的水凝胶网络的交联程度等方面进行调节，从而获得具有不同机械性能的复合水凝胶。

在本申请的一些实施方式中，聚乙烯吡咯烷酮的摩尔质量为2×10³～5×10⁶g/mol。例如，聚乙烯吡咯烷酮的摩尔质量为2×10³g/mol、5×10³g/mol、8×10³g/mol、1×10⁴g/mol、2×10⁴g/mol、5×10⁴g/mol、8×10⁴g/mol、1×10⁵g/mol、2×10⁵g/mol、5×10⁵g/mol、8×10⁵g/mol、1×10⁶g/mol、2×10⁶g/mol、5×10⁶g/mol。

在本申请的一些实施方式中，聚乙烯吡咯烷酮的摩尔质量为8×10³～2×10⁶g/mol。

在本申请的一些实施方式中，杂多酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：(1～4)。例如，杂多酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1：1、1：2、1：4。

在本申请的一些实施方式中，杂多酸与聚乙烯吡咯烷酮的质量比约为1：2。

在本申请的一些实施方式中，基于水凝胶的总质量，杂多酸的质量分数为3～9wt％，聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为5～20wt％。

在本申请的一些实施方式中，基于水凝胶的总质量，聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为5～15wt％。

在本申请的一些实施方式中，基于水凝胶的总质量，杂多酸的质量分数为5～7wt％。

在本申请的一些实施方式中，基于水凝胶的总质量，杂多酸的质量分数为5～7wt％，聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为12wt％。

在本申请的一些实施方式中，基于水凝胶的总质量，外泌体的浓度为100～200μg/mL。

本申请的第二方面，提供前述复合水凝胶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

取杂多酸、聚乙烯吡咯烷酮与外泌体混合反应，形成复合水凝胶。

在本申请的一些实施方式中，复合水凝胶的制备方法包括以下步骤：

取含有杂多酸的溶液与外泌体混合，得到混合液；

将混合液与含有聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合，搅拌均匀，得到复合水凝胶。

其中，溶液是指任选的水溶液，为了提高水凝胶作为生物材料与人体的相容程度，溶液优选为任意不影响最终形成的水凝胶的生物相容性的缓冲液，具体包括但不限于磷酸盐缓冲液如PBS缓冲液。可以理解的是，为了进一步提高水凝胶使用效果，缓冲液中还可以加入其它一些辅助成分，如生长因子等。

在本申请的一些实施方式中，复合水凝胶中外泌体的提取方法可以是超速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、PEG-base沉淀法、色谱法等其中至少一种。

在本申请的一些实施方式中，混合液中外泌体的浓度为200～400μg/mL。

在本申请的一些实施方式中，混合液与含有聚乙烯吡咯烷酮的溶液的体积比为2：(1～4)。在本申请的一些实施方式中，混合液与含有聚乙烯吡咯烷酮的溶液的体积比为1：1。

在本申请的一些实施方式中，复合水凝胶中外泌体的制备方法包括以下步骤：获取间充质干细胞样本，通过上述任一种方法提取得到间充质干细胞外泌体。

在本申请的一些实施方式中，复合水凝胶中外泌体的制备方法包括以下步骤：获取间充质干细胞样本，1000～3000×g离心去除死细胞，上清液继续10000～20000×g离心去除细胞碎片及囊泡，上清液重悬过滤收集滤液；100000～150000×g离心收集沉淀，重悬后再次100000～150000×g离心收集沉淀，即得间充质干细胞外泌体。

在本申请的一些实施方式中，复合水凝胶中外泌体的制备方法包括以下步骤：获取间充质干细胞样本，1000～3000×g离心10～40min去除死细胞，上清液继续10000～20000×g离心30～60min去除细胞碎片及囊泡，上清液重悬过滤收集滤液；100000～150000×g离心1～3h收集沉淀，重悬后再次100000～150000×g离心1～3h收集沉淀，即得间充质干细胞外泌体。

在本申请的一些实施方式中，间充质干细胞样本中的间充质干细胞来源于包皮，优选为儿童包皮。

在本申请的一些实施方式中，间充质干细胞样本的制备方法包括以下步骤：

将经包皮环切术切割下来的包皮清洗后分离出真皮，形成组织匀浆，接种于培养容器中进行原代培养，培养至亚融合状态时传代培养，建立间充质干细胞库，从中得到间充质干细胞样本。

在本申请的一些实施方式中，传代至第3代时建立间充质干细胞库。

本申请的第三方面，提供来源于包皮间充质干细胞的外泌体在制备治疗慢性伤口的产品中的应用。

其中，慢性伤口是指愈合速度较慢，无法通过正常有序及时的修复过程达到解剖和功能上的完整状态的伤口，临床上通常指超过1个月未能愈合，或者没有愈合倾向的难治性伤口。根据伤口的成因等因素，一般将慢性伤口分为静脉性溃疡伤口、动脉性溃疡伤口、糖尿病慢性伤口、创伤性溃疡伤口、压力性溃疡伤口等若干种。因此，治疗慢性伤口的产品可以是指任选能够治疗上述至少一种慢性伤口的产品。

在本申请的一些实施方式中，慢性伤口为糖尿病慢性伤口。

本申请的第四方面，提供前述的复合水凝胶在制备治疗慢性伤口的产品中的应用。

在本申请的一些实施方式中，慢性伤口为糖尿病慢性伤口。

综上可以看到，本申请提供了一种能够包载外泌体的水凝胶，其可以通过离心的方法从儿童包皮间充质干细胞上清液中分离得到外泌体，并将外泌体、硅钨酸等杂多酸和聚乙烯吡咯烷酮混合后结合形成柔性网络；该复合水凝胶在皮肤创伤修复中具有良好的应用价值。由于凝胶机制的独特结构和动态可逆特性，复合水凝胶表现出良好的韧性和自愈能力。而其中丰富的活性基团和经改善的内聚力使水凝胶对各种基材都具有良好的粘附能力。此外，复合水凝胶表现出优异的生物相容性。而这些特性允许水凝胶作为止血剂成功应用于治疗糖尿病等器官损伤，为可应用于生物材料的多功能复合水凝胶提供了一个新平台。复合水凝胶中凝胶所具有的抗菌性和外泌体在凝胶中所表现出的缓释作用，使得本申请实施例所提供的包载外泌体的自愈合水凝胶具有良好的生物相容性、良好的自愈合性能和降解率。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例1中分离出的儿童包皮间充质干细胞外泌体的透射电子显微成像图，图中标尺为100nm。

图2是本申请的实施例1中分离出的儿童包皮间充质干细胞外泌体进行外泌体标志物CD9和CD81表达的蛋白质印迹检测结果图。其中，M为蛋白标记物(Marker)的条带，对照代表293T细胞。

图3是本申请的实施例2中的复合水凝胶的结构示意图。

图4是本申请的实施例3中不同含量水凝胶样品的流变特性检测结果。

图5是本申请的实施例4中细胞迁移实验的显微结果。

图6是本申请的实施例4中促血管生成实验中的染色结果。

图7是本申请的实施例4中抗炎实验的体外巨噬细胞极化M1型的免疫荧光和PCR结果。

图8是本申请的实施例4中抗炎实验的体外巨噬细胞极化M2型的免疫荧光和PCR结果。

图9是本申请的实施例5中止血实验的结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。约的含义是本数±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％、±0.1％。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

本实施例提供一种来源于包皮间充质干细胞的外泌体，制备过程如下：

一、儿童包皮间充质干细胞的制备

(1)将经过包皮环切术切割下来的包皮用无菌PBS清洗后，放置于培养皿中；

(2)对上述包皮进行纵向切片以扩散组织，分离表皮和真皮，然后将该真皮切成小块形成组织匀浆；

(3)将步骤(2)中的组织匀浆接种于培养瓶中，平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，加入培养基进行原代培养；

(4)原代培养至5-10天全量换液一次，当培养至贴壁细胞达到亚融合状态时，进行传代培养，培养至第3代建立儿童包皮间充质干细胞库。

二、外泌体的提取

(1)将第一步中制备得到的间充质干细胞样本在37℃中速融，移动到新的离心管内，2000×g，4℃，30min离心以去除死细胞。将上清液移至新的离心管中，12000×g，4℃，45min再次离心，以去除细胞碎片以及较大的囊泡。取上清，用20mL预冷的1×PBS重悬后，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。

(2)将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子(超离机型号：Optima XPN-80，转子型号：Type 70Ti)，4℃，110000×g离心2h，使上清液中含有其它细胞器。去除上清，用3mL预冷的1×PBS重悬后，选择水平超速转子，再次4℃，110000×g，超速离心2h，以去除杂蛋白。去除上清，样本用100μL预冷的1×PBS重悬，即得儿童包皮间充质干细胞外泌体。

对分离出的儿童包皮间充质干细胞外泌体通过透射电子显微镜进行鉴定，具体过程为：

(1)取儿童包皮间充质干细胞外泌体5μL，加1×PBS稀释到10μL混匀，滴加于铜网上静置1min，用滤纸吸去浮液，于暖灯下放置直至晾干；

(2)在铜网上再滴加10μL磷酸钨，静置1min，用滤纸吸去浮液，于暖灯下放置直至晾干；电压选择580kv进行透射电子显微镜成像并拍照保存，结果如图1所示。

从图中可以看出，分离的儿童包皮间充质干细胞外泌体呈茶托形态或凹陷饼状形态，中间略暗，边缘有一略亮的圈。

对分离出的儿童包皮间充质干细胞外泌体测量其粒径，具体过程为：

(1)取儿童包皮间充质干细胞外泌体5μL，加1×PBS稀释到300μL混匀，将样品转移至Zetasizer Nano S纳米粒度分析仪(英国Malvem公司)的特定样品槽内，放入检测器进行检测。设置的参数为粒径范围50～200nm，分子量范围1000～20107Da，温度25℃，激光器4.0mV He-Ne激光器，波长633nm。每份样品连续分析3次，使用brookhaven instruments的NanoSight NTA数据分析软件分析数据。

结果显示，儿童包皮间充质干细胞外泌体的粒径在30～150nm之间。

对分离出的儿童包皮间充质干细胞外泌体进行蛋白质印迹法鉴定，检测外泌体标志物CD63、CD81以及钙粘蛋白(Calnexin)的表达，具体过程为：

(1)取儿童包皮间充质干细胞外泌体20μL，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000×g离心15min，取上清液，即得外泌体蛋白样品；

(2)测定蛋白浓度，取20μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜和抗体孵育，采用Typhoon扫描仪(波长473nm，电压485V)成像，拍照保存，结果如图2所示。从图中可以看出，CD63和CD81都有表达。

综合电镜结果、平均粒径大小以及CD9、CD81蛋白的表达情况，本实施例最终制备的产物符合外泌体特征，表明本实施例最终分离到的的确是儿童包皮间充质干细胞外泌体。

实施例2

本实施例提供一种复合水凝胶，该复合水凝胶的制备方法如下：

(1)取0.1g硅钨酸(SiW，H₄[Si(W₃O₁₀)₄])溶解于1mL的1×PBS中，然后加入实施例1制备的儿童包皮间充质干细胞外泌体20μL混匀，得到混合液，混合液中儿童包皮间充质干细胞外泌体的终浓度为200μg/mL；

(2)取质量比为18％的PVP(摩尔质量8×10³g/mol)的1×PBS磷酸盐缓冲液1mL，加入到步骤(1)的混合物内搅拌5min，即由溶液转变为凝胶，得到包载外泌体的复合水凝胶。

最终得到的复合水凝胶中，硅钨酸的含量约为5wt％，聚乙烯吡咯烷酮的含量约为9wt％，外泌体的含量约为0.1wt％。

参考图3，经过剧烈搅拌后，聚乙烯吡咯烷酮和硅钨酸混合后形成柔性网络，由于凝胶的独特结构和动态可逆特性，这种单网络水凝胶(SPC)表现出良好的韧性和自愈能力。

实施例3

不同SiW和PVP比较

参考实施例2，调节原料中SiW和PVP所占比例，以同样方法制备得到复合水凝胶，使用通用拉伸-压缩试验机(SANS，中国)对LPC水凝胶的室温力学性能进行了评估。变形速率设定为50mm/min。根据初始线性区域的斜率计算弹性模量，根据应力-应变曲线检测其断裂应力和断裂应变，结果如表1所示：

表1.机械性能检测

样品编号	SiW(wt％)	PVP(wt％)	断裂应力(KPa)	断裂应变(％)
					SPC-1	5	12	10.7	2173
SPC-2	6	12	16.2	2308
					SPC-3	7	12	5.6	581

从表中可以看出，当SiW和PVP的质量比约为1：2时，其断裂应力最大，拉伸强度更好。

通过振荡频率扫描测试评估上述三个水凝胶样品的流变特性，结果如图4所示。与其他非共价水凝胶类似，SPC水凝胶的机械模量高度依赖于剪切频率(ω)。由于聚合物网络解体引起的应力消散，所有SPC水凝胶在低ω值下表现出粘性流体状特性。而高ω值会引起水凝胶的弹性响应，当应变频率增加时，SPC水凝胶表现得像弹性固体。在上述样品中，PVP固定在12wt％时，当SiW从5wt％增加到7wt％，参考图4，形成了更坚固的结构。上述结果表明，较高的SiW相对含量提高了SPC水凝胶的交联密度，并导致结构更紧凑。

实施例4

细胞实验

以下实验中对照组为PBS缓冲液，包皮外泌体(FP)为实施例1制备的儿童包皮间充质干细胞外泌体，脐带外泌体为以与实施例1类似方式获得的儿童脐带间充质干细胞外泌体。

a、细胞迁移

HaCaT细胞在含有5％FBS和1％青链霉素的DMEM培养基中培养，待细胞生长数量足够，准备细胞悬液，将细胞悬液调节至细胞浓度约为3×10⁵细胞/mL，将70μL细胞悬液应用于Culture-Insert 2(ibidi)孔的每个孔中置于μ-dish中培养，同时设置对照组以及加入脐带外泌体(HP)或包皮外泌体(FP)的实验组。

将细胞在37℃含5％二氧化碳培养箱中孵育24h后，待细胞汇合度铺满2个小孔，用无菌镊子取出Culture-Insert 2孔，移除插入后，用PBS清洗细胞层，去除细胞碎片和非附着细胞，使用2mL的无细胞培养基加入到μ-dish，置于显微镜下拍摄。

结果如图5所示，从图中可以看出，加入外泌体的实验组相比于对照组的细胞迁移要明显，而加入包皮外泌体比加入脐带外泌体要更有效，细胞迁移更快，说明包皮外泌体效果要好于脐带外泌体。

b、促血管生成

HUVEC细胞培养，该模型通过混合15μg，10μl外泌体、Ⅰ型鼠尾胶原蛋白(corning)、FBS、DMEM和NaOH制备的，将总共400μL的上述混合物置于48孔板中，并在37℃下孵育30min，以形成果冻状固体胶原凝胶。HUVEC用4％的多聚甲醛固定用鬼笔环肽染色。使用共聚焦显微镜拍摄荧光图像。结果如图6所示，从图中可以看出，相比于对照组，间充质干细胞外泌体的加入促进了内皮细胞增长与血管生成，其中加入实施例1中包皮来源的间充质干细胞外泌体(FP EXO)的促血管生成要优于脐带来源的间充质干细胞外泌体(HP EXO)的效果。

c、抗炎实验(体外巨噬细胞极化)

对于体外巨噬细胞极化研究，将RAW264.7细胞接种在35mm共聚焦培养皿中，用RPMI1640培养基(10％FBS、1％AA、LPS(500ng/mL)中以1×10⁵个细胞的密度接种)和IFN-γ(20ng/mL)在37℃含5％二氧化碳培养箱中孵育24h后加入外泌体(每皿1×10⁷或1×10⁸个颗粒)，在37℃含5％二氧化碳培养箱中孵育48h后，用DPBS洗两次并用4％的多聚甲醛溶液固定。然后将细胞与DPBS中的0.2％Triton X-100孵育10分钟，用DPBS洗两次，并用1％BSA封闭45min，用抗INOS抗体Alexa Fluor 647和抗CD206抗体Alexa Fluor 488在4℃下处理细胞12小时，用倒置显微镜拍照如图7和图8所示，包皮外泌体(FP)的抗炎效果要优于脐带外泌体(HP)。

细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度种在六孔板中，孔板放置在二氧化碳培养箱中孵育24h，然后再将细胞消化下来并进一步裂解，再用High Pure RNAIsolation Kit(Invitrogen)试剂盒分离细胞中总的RNA，第一条cDNA链用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNAEraser(Takara)试剂盒合成并纯化，再进行后续对Survivin特异性引物的扩增，扩增后的DNA基因组使用SYBR Premix Ex Taq Kit(Takara)试剂盒进行测量，整个荧光定量PCR检测都在StepOne Real-Time PCR(Life Technologies)仪器上完成，引物序列如表2所示。PCR结果与显微镜下拍照结果一致。

表2.引物序列

参考图7，显微镜下对比M1型(促炎)发现包皮外泌体(FP MSCs EXO)组几乎不显示红光，而脐带外泌体组(HP MSCs EXO)显示红光，说明细胞在分化为MI型后，包皮外泌体抑制了炎症的发生，所以在M1型状态下包皮外泌体的抑炎效果要好于脐带外泌体；在PCR检测相应的M1型标志物iNOS和TNF-α中，相应的包皮外泌体(FP EXO)要低于脐带外泌体(HPEXO)组的表达量，与荧光显示的结果一致。

参考图8，对比M2型(抑炎)发现包皮外泌体(FP MSCs EXO)组的绿光要强于脐带外泌体组(HP MSCs EXO)，说明细胞在分化为M2型后，包皮外泌体产生了更多的抑炎效果，所以在M2型状态下包皮外泌体的抑炎效果比脐带外泌体强；在PCR检测相应的M2型标志物CD206和Arg-1中，相应的包皮外泌体(FP EXO)要高于脐带外泌体(HP EXO)组的表达量，与荧光显示的结果一致。

实施例5

止血实验

雌性Sprague-Dawley大鼠用于评估水凝胶的止血特性。麻醉后，切开大鼠的腹部，露出肝脏。将滤纸称重并置于肝脏中。然后用18-G针在肝脏中切开形成出血伤口，并立即将3g实施例2的复合水凝胶注射到出血部位。通过称重滤纸来计算血量。同时设置不进行止血操作的对照组和采用纱布止血的纱布组，结果如图9所示，对照组出血明显，使用纱布止血后出血量明显下降，而采用实施例中的水凝胶后出血量又有进一步的下降，表明本申请实施例所提供的水凝胶具有良好的止血效果。

实施例6

本实施例提供一种医用敷料，包括依次的隔离纸层、复合水凝胶层和无纺布层，其中的复合水凝胶层所用的水凝胶与实施例2的区别在于，PVP的摩尔质量为2.4×10⁴g/mol。本实施例所提供的医用敷料采用与前述实施例类似的复合水凝胶，能够有效止血，促进糖尿病等慢性伤口愈合。

实施例7

本实施例提供一种医用敷料，包括依次的隔离纸层、复合水凝胶层和无纺布层，其中的复合水凝胶层所用的水凝胶与实施例2的区别在于，采用摩尔质量为1.3×10⁶g/mol的聚乙二醇代替PVP。本实施例所提供的医用敷料采用与前述实施例类似的复合水凝胶，能够有效止血，促进糖尿病等慢性伤口愈合。

综合上述实施例可以看出，本申请实施例所提供的水凝胶中所采用的包皮外泌体的得率比脐带外泌体的得率更高。同时其生物学特性更能抑制炎症反应，其基因组学相比脐带等其他来源的MSCs表达更多的免疫抑制相关基因和趋化基因。在促进血管生成、促进细胞迁移、抗炎等方面要远远优于其它来源的间充质干细胞外泌体。同时，作为基体的水凝胶通过直接搅拌SiW和PVP溶液制备而无需进行任何化学改性，凝胶化过程既方便又超快。产生的水凝胶的分子形成刚性交联结构域，其中的PVP作为柔软成分，确保了水凝胶的柔韧性动态交联网络，保证了SiW/PVP水凝胶的粘弹性和自愈能力。而生物相容性良好的成分和凝胶机制赋予SiW/PVP水凝胶极低的细胞毒性。因而，可用作治疗器官损伤的止血剂或者用于高效治疗糖尿病慢性伤口。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市儿童医院

<120> 复合水凝胶及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctcagc ctcttctcat tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcttgtcact cgaattttga ga 22

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<211> 25

<212> DNA

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

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taggtgaggg cttggctgag tg 22

<210> 5

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<212> DNA

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<400> 5

catatctgcc aaagacatcg tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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Claims

1.用于治疗慢性伤口的复合水凝胶，其特征在于，包括水凝胶和负载在所述水凝胶中的外泌体，所述外泌体来源于儿童包皮间充质干细胞，所述儿童包皮间充质干细胞的所述外泌体的粒径在30~150nm，所述水凝胶的制备原料为杂多酸和聚合物，所述聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸中的至少一种，所述杂多酸选自硅钨酸、磷钨酸、磷钼酸、硅钼酸中的至少一种。

2. 根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述聚合物的摩尔质量为10³~10⁷g/mol。

3.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述杂多酸与所述聚合物的质量比为1：（1~4）。

4.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，基于所述水凝胶的总质量，所述杂多酸的质量分数为3~9wt%，所述聚合物的质量分数为5~20wt%。

5.权利要求1至4任一项所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取杂多酸、聚合物与外泌体混合反应，形成所述复合水凝胶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取含有杂多酸的溶液与外泌体混合，得到混合液；

将所述混合液与含有聚乙烯吡咯烷酮的溶液混合，搅拌均匀，得到所述复合水凝胶。