CN116036310B - 琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域，所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体包括外泌体和修饰于所述外泌体表面的琥珀酰化壳聚糖。本发明通过琥珀酰化壳聚糖表面的氨基与具有膜结构的外泌体表面糖蛋白羧基形成化学交联，且琥珀酰化壳聚糖与外泌体间具有静电相互作用，从而使琥珀酰化壳聚糖修饰在外泌体表面，经过修饰后其组织诱导活性更好，生物活性更高，且对软骨基质的穿透作用更强，从而能够显著提高组织再生修复效果。

Description

琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体是最近新发现的具有调节炎症、免疫反应和周围细胞活性，促进组织修复与再生功能的关键细胞分泌产物，且与其它纳米给药系统相比，外泌体具有天然生物膜结构、低免疫原性、靶向性及归巢能力等优势，可作为高效的靶向给药载体。然而，外泌体在组织内易进入血液循环从而被快速清除，导致难以发挥长期疗效。目前，已有大量的科研工作者尝试利用各种水凝胶、支架材料等作为外泌体载体，实现外泌体的局部释放并提高其作用时效，提高组织再生修复效果，已取得了重大的突破和进展。但是，现有的研究主要将外泌体通过简单包裹或者吸附的方式引入至水凝胶或者支架材料三维网络内，生物学活性以及组织诱导活性较差。
发明内容
本发明解决的技术问题在于如何提供一种生物活性、组织诱导活性较高的外泌体，增强外泌体的功能。
为解决上述问题，本发明提供了一种琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体，包括外泌体和修饰于所述外泌体表面的琥珀酰化壳聚糖。
优选地，所述外泌体为载药外泌体。
优选地，所述载药外泌体中包载药物包括KGN或TGF-β1。
本发明通过在外泌体表面修饰琥珀酰化壳聚糖，能够更好维持修饰后外泌体的活性，修饰后的外泌体具有更好的渗透作用，有助于更好的发挥作用。本发明通过琥珀酰化壳聚糖表面的氨基与具有膜结构的外泌体表面糖蛋白羧基形成化学交联，且琥珀酰化壳聚糖与外泌体间具有静电相互作用，从而使琥珀酰化壳聚糖修饰在外泌体表面，经过修饰后其组织诱导活性更好，生物活性更高，且对软骨基质的穿透作用更强，从而能够显著提高组织再生修复效果。
本发明还提供了一种琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体的制备方法，用于制备如上所述的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体，包括以下步骤：
步骤S1、配制琥珀酰化壳聚糖溶液和外泌体溶液；
步骤S2、将所述琥珀酰化壳聚糖溶液和所述外泌体溶液搅拌混合后，离心去除上清液，得到的沉淀为琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体。
优选地，在所述步骤S1之后，在所述步骤S2之前，还包括：
在所述琥珀酰化壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和/或N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行混合，得到混合溶液；
所述步骤S2包括：
将所述混合溶液和所述外泌体溶液搅拌混合后，离心去除上清液，得到的沉淀为所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体。
本发明提供的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体的制备方法相对于现有技术的有益效果，与琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体相同，在此不再赘述。
本发明还提供如上所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备组织修复药物中的应用。
优选地，所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备外泌体基可注射水凝胶中的应用。
优选地，所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备外泌体基聚电解质膜中的应用。
优选地，所述外泌体基可注射水凝胶的制备方法，包括：
将所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体与氧化糖胺多糖混合后原位交联形成亚胺键，得到所述外泌体基可注射水凝胶。
优选地，所述外泌体基聚电解质膜的制备方法，包括：
步骤T1、配制氧化糖胺多糖溶液和琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体溶液；
步骤T2、将基底浸泡于1 mg/mL的多巴胺溶液中吸附30min，取出用水清洗后，再依次置于所述氧化糖胺多糖溶液和所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体溶液中10min，多次重复后，得到所述外泌体基聚电解质膜。
本发明通过将琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体应用于制备组织修复药物，能够改善外泌体的生物活性和组织诱导活性，并提升外泌体在组织中的渗透作用，增强组织修复效果。
附图说明
图1为本发明实施例中外泌体和琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体的理化性能检测对比图；
图2为本发明实施例中琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体前后成软骨诱导能力对比图；
图3为本发明实施例中琥珀酰化壳聚糖修饰前后外泌体的软骨基质穿透作用对比图；
图4为本发明实施例中外泌体基水凝胶与水凝胶包裹外泌体的微观形貌对比图；
图5为本发明实施例中外泌体基水凝胶与水凝胶包裹外泌体的缓释效果对比图；
图6为本发明实施例中外泌体基水凝胶的自愈合性能展示图；
图7为本发明实施例中外泌体基水凝胶与水凝胶包载外泌体的成软骨诱导能力对比图；
图8为本发明实施例中外泌体基聚电解质膜与琥珀酰化壳聚糖聚电解质膜的接触角对比图；
图9为本发明实施例中外泌体基聚电解质膜的缓释效果检测对比图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、质量分数的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供一种琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体，包括外泌体（Exo）和修饰于所述外泌体表面的琥珀酰化壳聚糖（sCH）。
通过琥珀酰化壳聚糖表面的氨基与具有膜结构的外泌体表面糖蛋白羧基形成化学交联，且琥珀酰化壳聚糖与外泌体间具有静电相互作用，从而使琥珀酰化壳聚糖修饰在外泌体表面，经过修饰后其组织诱导活性更好，生物活性更高，且穿透作用更强，从而能够显著提高组织再生修复效果。
琥珀酰化壳聚糖的表面分布有氨基，而具有膜结构的外泌体表面具有糖蛋白羧基，两者能够通过氨基和羧基形成化学交联作用，此外，检测了琥珀酰化壳聚糖和外泌体的ZETA电位，分别为33.84±0.58和-40.3±2.96，即，琥珀酰化壳聚糖带有正电，外泌体带有负电，两者能够通过静电相互作用进行吸附。因此，在氨基和羧基的化学交联作用以及静电相互作用的双重作用下，琥珀酰化壳聚糖能够修饰在外泌体表面。
进一步地，所述外泌体为载药外泌体。外泌体是药物递送的优良载体，通过在外泌体内特异性的装载药物或生物活性分子能够实现更好的治疗效果或组织再生修复效果。
示例性地，所述载药外泌体中包载药物包括KGN（Kartogenin）或TGF-β1（转化生长因子-β1）。KGN能够诱导内源性间充质干细胞成软骨分化，对软骨修复具有良好的作用。TGF-β1是一种重要的细胞分化、存活、增殖和行为诱导信号分子，组织损伤后，TGF-β1是愈合过程中的主要调节因子。
应理解的是，可根据外泌体的用途选择不同的装载药物或生物活性分子。
本发明的另一实施例提供一种琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体的制备方法，用于制备如上所述的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体，包括以下步骤：
步骤S1、配制琥珀酰化壳聚糖溶液和外泌体溶液；
步骤S2、将所述琥珀酰化壳聚糖溶液和所述外泌体溶液搅拌混合后，离心去除上清液，得到的沉淀为琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体。
步骤S1中，琥珀酰化壳聚糖溶液的浓度为5mg/mL，外泌体溶液的浓度为10 μg/ml；
在一个实施例中，外泌体为载药外泌体。在步骤S1之前，需要先制备得到载药外泌体，具体包括以下步骤：
将外泌体与药物溶液混合得到混合液，在混合液中加入PBS，使用超声破碎仪超声后静置，多次重复，将药物载入外泌体中。
示例性地，外泌体内包载KGN的方法，包括：将5μl外泌体（2μg/μl）与3.1μl KGN溶液（1 mM）混合，混合液中加入100μl的PBS，使用超声破碎仪以20%的振幅冰上超声30 s后静置2 min，重复操作6次即可将KGN载入外泌体中；
外泌体内包载TGF-β1的方法，包括：将5μl外泌体（2μg/μl）与10μl TGF-β1溶液（100 ng/ml）混合，混合液中加入100μl的PBS，使用超声破碎仪以20%的振幅冰上超声30 s后静置2 min，重复操作6次即可将生长因子载入外泌体中。
步骤S2中，将2mL外泌体溶液加入2mL琥珀酰化壳聚糖溶液中，搅拌孵育过夜后，100000 g离心70 min，去除上清液，得到的沉淀为琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体。
在一个实施例中，为了进一步提高琥珀酰化壳聚糖与外泌体的结合强度，在步骤S1之后，步骤S2之前，还包括：
在所述琥珀酰化壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）溶液和/或N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液进行混合，得到混合溶液；
EDC和NHC能够催化琥珀酰化壳聚糖上的氨基与外泌体表面糖蛋白的羧基间的反应，从而提高琥珀酰化壳聚糖与外泌体结合的强度。
示例性地，将EDC溶液和/或NHS溶液加入2mL琥珀酰化壳聚糖溶液中，调节pH至5，得到混合溶液，然后将2mL外泌体溶液加入混合溶液中，搅拌孵育过夜后，100000 g离心70min，去除上清液，得到的沉淀为琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体。
本发明的另一实施例提供上述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备组织修复药物中的应用。
通过在外泌体表面修饰琥珀酰化壳聚糖，能够提升外泌体在组织中的渗透作用，并改善外泌体的生物活性和组织诱导活性，从而增强组织修复的效果。
进一步地，通过选择装载有KGN或TGF-β1的载药外泌体进行修饰后得到壳聚糖修饰外泌体，应用于制备软骨组织修复药物，能够有效增强促成软骨效果。
在一个实施例中，所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备外泌体基可注射水凝胶中的应用。通过琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体后，琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体能够作为交联单元与氧化糖胺多糖构建可注射、自愈合水凝胶，而不是简单地将琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体包裹于水凝胶网络中，从而能够显著提高外泌体的生物学活性，有效增强了组织修复效果。
具体地，所述外泌体基可注射水凝胶的制备方法，包括：
将所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体与氧化糖胺多糖混合后原位交联形成亚胺键，得到所述外泌体基可注射水凝胶。
其中，所述氧化糖胺多糖包括氧化硫酸软骨素、氧化透明质酸、氧化肝素或氧化海藻酸钠。
氧化糖胺多糖的制备方法包括：
步骤U1、使用去离子水配制5 mg/ml糖胺多糖溶液（糖胺多糖包括硫酸软骨素，透明质酸，肝素或海藻酸钠）；
步骤U2、在糖胺多糖溶液中加入高碘酸钠，避光进行氧化反应，反应结束后，使用3500MW透析袋在去离子水中透析3d后冻干，即得到氧化糖胺多糖。
示例性地，将10 mg/ml sCH-Exo（琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体）与20 mg/ml的氧化硫酸软骨素（oCS）混合后原位交联形成亚胺键，即可得到以sCH-Exo为交联单元的外泌体基可注射水凝胶，可命名为sCH-Exo/oCS。
在另一个实施例中，所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体在制备外泌体基聚电解质膜中的应用。通过琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体后，得到的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体能够作为组装单元与氧化糖胺聚糖构建聚电解质膜，后续可用于植入材料的表面修饰，从而提高其组织诱导活性。
具体地，所述外泌体基聚电解质膜的制备方法，包括：
步骤T1、配制氧化糖胺多糖溶液和琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体溶液；
步骤T2、将基底浸泡于1 mg/mL的多巴胺溶液中吸附30min，取出用水清洗后，再依次置于所述氧化糖胺多糖溶液和所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体溶液中10min，多次重复后，得到所述外泌体基聚电解质膜。
示例性地，将琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo）和氧化硫酸软骨素（oCS）分别溶解于5%的葡萄糖溶液和水中，分别得到浓度为1mg/mLsCH-Exo溶液和oCS溶液；选择玻片作为基底，将玻片放置于特制的聚四氟乙烯支架上，浸泡在含有0.5M NaOH的溶液中（溶剂为96%乙醇），搅拌2小时后将清洗液回收，玻片用去离子水充分清洗5次，每次清洗10min，然后自然晾干备用；将玻片浸泡于1 mg/mL的多巴胺溶液中吸附30min，取出用水清洗后，再依次置于oCS溶液和sCH-Exo溶液中10min，每一层吸附后均用洗脱液进行清洗，每次清洗3min，清洗3次，洗脱液为0.15M的氯化钠溶液，多次重复后，得到外泌体基聚电解质膜，可命名为oCS/sCH-Exo。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的提取
需要说明的是，本实施例中新生儿脐带由广东医科大学附属医院妇产科提供，在获得产妇和医生知情同意之后，选择剖宫产分娩的健康新生儿脐带。
1.1、收集剖宫产分娩的健康新生儿脐带，浸入无菌PBS中；
1.2、于超净工作台中取出脐带，将其切成2-3cm的小段，反复冲洗直至无血液，用眼科剪刀和止血钳去除脐带中的血管，然后将其转移至另一无菌培养皿中，将经过分离并洗涤干净的脐带切成1-3mm的组织块，然后将其均匀地排列在培养皿中；
1.3、将上述组织块在37℃，5%CO2的培养箱中反向孵育以粘附组织块，30min后在培养皿中添加10mLα-MEM完全培养基（含10%PBS，1%双抗），并在37℃，5%CO2培养箱中培养，每隔3天进行换液，约2周后，当细胞达到70-80%融合时进行传代培养，得到人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）。
实施例2 hUC-MSCs外泌体的收集及鉴定
2.1、使用贝克曼超高速离心机的定角转子，以100000g将gibco公司的澳洲胎牛血清（FBS）离心过夜后，去除沉淀（外泌体），保留的上清即为无外泌体血清；
2.2、配置无外泌体的α-MEM完全培养基（含10%无外泌体FBS，1%双抗）；
2.3、进行hUC-MSCs细胞传代，传代时，弃去原来培养基，PBS冲洗2-3遍，加入少量胰蛋白酶消化1 分钟左右，显微镜下观察细胞变圆后，立即加入无外泌体完全培养基终止消化，使用一次性滴管轻柔吹打 2-3 次，离心弃上清，使用无外泌体完全培养基重悬，以1:3 的比例进行传代培养，之后每次传代时收集细胞培养上清液；
2.4、将收集的细胞培养上清液以300 g离心10min弃去沉淀中的细胞，保留上清；然后使用2000g离心10min弃去沉淀中的死细胞，保留上清；再使用10000g离心30 min弃去沉淀中的细胞碎片、膜微粒等；最后使用贝克曼超高速离心机100000g离心70min后，沉淀即为外泌体，使用PBS清洗沉淀后再次进行100000g离心操作，弃去上清，并使用PBS重悬外泌体。
实施例3 hUC-MSCs来源外泌体的载药
3.1、hUC-MSCs来源外泌体包载KGN：将5μl外泌体（浓度为2μg/μl）与3.1μl KGN溶液（浓度为1mM）混合，混合液中加入100μl的PBS，使用超声破碎仪以20%的振幅冰上超声30s后静置2 min，重复操作6次即可将KGN载入外泌体中；
3.2、hUC-MSCs来源外泌体内包载TGF-β1：将5μl外泌体（浓度为2μg/μl）与10μlTGF-β1溶液（浓度为100ng/ml）混合，混合液中加入100μl的PBS，使用超声破碎仪以20%的振幅冰上超声30 s后静置2 min，重复操作6次即可将生长因子TGF-β1载入外泌体中；
3.3、使用日立超高速离心机将步骤3.1和3.2中经过处理后的溶液以100000g离心70 min，保留沉淀的外泌体，去除未被载入外泌体中的药物或生长因子，分别得到载有KGN和TGF-β1的外泌体。
实施例4琥珀酰化壳聚糖（sCH）的制备
4.1、配制浓度为5%的乳酸溶液；
4.2、向乳酸溶液中加入0.5g壳聚糖，搅拌至充分溶解；
4.3、向步骤4.2中得到的溶液中加入160mL甲醇，继续搅拌30min后，加入750mg琥珀酰酐继续搅拌24h；
4.4、使用10M的NaOH将步骤4.3中得到的溶液的pH调节至7.0后，使用滤纸进行过滤，将收集到的沉淀溶解在100mL的去离子水中，搅拌溶解过夜后使用透析袋（分子截留量为3500MW）透析三天后冻干，得到琥珀酰化壳聚糖。
实施例5制备琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo）
配制浓度为5mg/ml的琥珀酰化壳聚糖溶液2 ml，分别加入EDC和NHS溶液，调节pH至5，加入2mL浓度为10μg/ml的外泌体溶液，搅拌孵育过夜后100000g离心70min，去除上清液，保留的沉淀即为琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo）。
实施例6琥珀酰化壳聚糖修饰前后外泌体的理化性能检测
6.1、为了观察琥珀酰化壳聚糖修饰前后外泌体的形态变化，分别使用透射电镜对修饰前的外泌体（Exo）和修饰后的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo）进行观察，方法如下：用100μL的2%多聚甲醛重悬Exo或sCH-Exo，分别得到Exo悬液和sCH-Exo悬液，分别取5μLExo悬液和sCH-Exo悬液滴到有碳膜的200目铜网上，室温干燥20min，再将铜网置于100μlPBS液滴上清洗1min；用1%戊二醛室温固定5min；再将铜网用去离子水洗涤2min，重复洗涤8次；将铜网放在 50μl 醋酸双氧铀液滴上负染 5min；室温干燥10min；用透射电子显微镜（TEM）在 80 kV加速电压下观察拍照，结果如图1中（A）所示；
图1中（A）的左图为Exo的TEM电镜图，右图为sCH-Exo的TEM图，从图1中（A）可以看出，外泌体经过琥珀酰化壳聚糖修饰后，其粒径有所增加，说明外泌体的膜表面成功修饰了琥珀酰化壳聚糖分子；
6.2、为了检测Exo和sCH-Exo的粒径，进行NTA检测，分别将Exo和sCH-Exo悬液稀释至1mL，浓度为3μg/ml，混合均匀后室温下平衡2min，使用注射器将样品注入到样品池中，检测并记录结果，结果如图1中（B）所示；
从图1中（B）可以看出，Exo的粒径主要分布在50-100nm，而sCH-Exo的粒径主要分布在100-200nm之间，且主要集中在150nm左右，仍属于外泌体尺寸（20-200nm）范围内；
6.3、为了鉴定Exo和sCH-Exo，使用western blotting检测外泌体的特异性抗体CD9、CD63、CD81、hsp70和TSG101的表达，结果如图1中（C）所示；
图1中（C）中，Exo表示修饰前的外泌体，sCH-Exo表示修饰后的外泌体，从图1中（C）可以看出，并未因为外泌体膜表面修饰琥珀酰化壳聚糖导致特异性标志物的表达发生改变；
6.4、为更加直观的观察琥珀酰化壳聚糖对外泌体的修饰情况，将琥珀酰化壳聚糖使用FITC标记，外泌体使用pkh26标记后，按照实施例5中所示方法制备得到琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo），并通过超高分辨率显微成像系统观察两者的结合情况，结果如图1中（D）所示；
图1中（D）中FITC表示琥珀酰化壳聚糖的分布情况，显示为绿色荧光（图片经灰度处理后显示为浅灰色），pkh26表示外泌体的分布情况，显示为红色荧光（图片经灰度处理后显示为白色），Merge表示两个图片叠加后的情况，从图1中（D）可以看出琥珀酰化壳聚糖修饰在外泌体膜表面。
实施例7琥珀酰化壳聚糖修饰前后外泌体的成软骨诱导作用研究
将1mL的BMSC（骨髓间充质干细胞）悬液以2×105个/mL的密度接种至15 mL离心管中，1000rpm离心3min后静置于培养箱中培养，24h后分别采用未载药的外泌体（Exo）、载有KGN和TGF-β1的外泌体（载药Exo）和载有KGN和TGF-β1的琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（载药sCH-Exo）进行成软骨诱导，并采用未加入外泌体的空白组（ctrl）作为对照，诱导14d后取出软骨微球，固定脱水后进行石蜡包埋和切片染色，观察软骨基质的分泌情况，结果如图2所示；
从图2中可以看出，空白组和单独采用外泌体时成软骨诱导能力较差，而外泌体内负载KGN和TGF-β1之后明显促进了BMSC的成软骨分化能力，利用琥珀酰化壳聚糖对外泌体进行修饰后进一步增强了载药外泌体的促干细胞成软骨分化的能力。
实施例8琥珀酰化壳聚糖修饰前后外泌体的软骨基质穿透作用
采用pkh26对外泌体（Exo）进行荧光标记，经过荧光标记的外泌体一部分按照实施例5中的方法制备成琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo），一部分直接用于试验；取两块尺寸接近的猪软骨，分别浸泡于含有1mL浓度为20μg/μL 的sCH-Exo和Exo的EP管中，浸泡24h后取出，采用PBS充分清洗后，使用荧光显微镜观察横截面，查看外泌体在软骨基质中的渗透情况，结果如图3所示；
图3中，BF一列表示在没有荧光的条件下观察到的不同处理的猪软骨的横截面图，pkh26表示在荧光条件下观察到的猪软骨的横截面图，从图3中可以看出，与单纯的外泌体相比，经过琥珀酰化壳聚糖修饰后的外泌体，能够更好的穿透软骨基质，进入到软骨基质发挥效果，从而克服了软骨基质致密结构不利于治疗药物渗透的技术难题。
实施例9外泌体基可注射水凝胶的制备
9.1、采用去离子水配制5mg/ml硫酸软骨素溶液；
9.2、向硫酸软骨素溶液中加入对应量的高碘酸钠后，避光进行氧化反应，反应结束后，使用3500 MW透析袋在去离子水中透析3 d后冻干，即得到氧化硫酸软骨素（oCS）；
9.3、将浓度为10mg/ml 的sCH-Exo与浓度为20mg/ml的oCS溶液混合后原位交联形成亚胺键，即可得到以sCH-Exo为交联单元的可注射、自愈合水凝胶，命名为sCH-Exo/oCS。
实施例10外泌体基可注射水凝胶的微观形貌观察
按照实施例9中的方法制备sCH-Exo/oCS，另外，将外泌体直接包载至sCH/oCS水凝胶内（命名为[sCH/oCS]-Exo）作为对照组；
将两组水凝胶置于-80℃冰箱中冷冻过夜后冻干，使用扫面电子显微镜观察两者的微观形貌，结果如图4所示，sCH-Exo/oCS表示通过实施例9中方法制得的外泌体基可注射水凝胶，[sCH/oCS]-Exo表示外泌体直接包载至sCH/oCS水凝胶内的对照组，从图4中可以看出，对照组中水凝胶冻干后可见外泌体主要分布在水凝胶支架的表面，而外泌体基可注射水凝胶则以交联单元的形式参与了水凝胶交联网络的形成，冻干后的样品可以发现外泌体以嵌入的形式均匀分布于水凝胶支架内。
实施例11外泌体基可注射水凝胶的缓释效果检测
按照实施例9中的方法制备sCH-Exo/oCS，另外，将外泌体直接包载至sCH/oCS水凝胶内（命名为[sCH/oCS]-Exo）作为对照组；
将两组水凝胶分别置于5ml离心管中，加入PBS溶液，在预定时间内收集浸提液，利用BCA检测释放的外泌体浓度，结果如图5所示；
图5中[sCH/oCS]-Exo表示外泌体直接包载至sCH/oCS水凝胶内的对照组，sCH-Exo/oCS为以外泌体为交联单元的实验组，横坐标表示时间，纵坐标表示释放量，从图5可以看出，第2天时，两者释放量比较接近，均为20%左右，说明对照组和实验组均未出现外泌体的突释，但随着时间的增加，实验组的释放速率较对照组显著降低，表明通过琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体制备的可注射水凝胶能够更好的进行外泌体控释，使其能够在较长时间内发挥组织再生修复的效果。
实施例12外泌体基可注射水凝胶的自愈合实验
按照实施例9的方法制备sCH-Exo/oCS，进行自愈合实验，结果如图6所示，
图6分别为三个自愈合实验的实验过程和结果示意图，其中，自愈合实验一的结果如图6中（A）所示：将sCH-Exo/oCS切断后，使用镊子将切断后的两部分夹起，使两部分密切接触，能够重新愈合成为一个整体；自愈合实验二的结果如图6中（B）所示：将sCH-Exo/oCS置于橡胶手套上，通过利用锐器将水凝胶断裂为两部分，手指恢复伸直状态后，断裂的两部分充分接触，重新愈合为一个整体。自愈合实验三如图6中（C）所示：首先利用流变仪检测了sCH-Exo/oCS的破裂点，当施加应变接近1000%时，G″值超过了相应的G′值，表明水凝胶解体并转变为准液态。随后，采用连续阶跃应变试验来确定sCH-Exo/oCS的自愈合性能，当施加应变从1%增加到1000%时，水凝胶的G′值急剧下降，小于G″值，表明sCH-Exo/oCS的水凝胶网络受到破坏。当施加应变恢复到1%时，G′值恢复为大于G″值，表明sCH-Exo/oCS恢复了交联，通过sCH-Exo/oCS的破裂和恢复行为证实了其具有自愈合性能。
综上所述，通过自愈合实验说明采用本发明实施例9中方法制得的sCH-Exo/oCS具有良好的自愈合性能。
实施例13外泌体基可注射水凝胶的成软骨诱导作用研究
13.1、按照实施例9中的方法制备sCH-Exo/oCS，另外，将外泌体直接包载至sCH/oCS水凝胶内（命名为[sCH/oCS]-Exo）作为对照组；
13.2、将hUC-MSCs以5.0×105个每孔的密度接种于分别分别接种至sCH-Exo/oCS水凝胶上，其中[sCH/oCS]-Exo组设为对照，成软骨诱导培养7、14天后收集细胞，利用WB技术检测细胞内成软骨相关蛋白的表达情况，结果如图7所示；
从图7可以看出，在第7天和第14天时，sCH-Exo/oCS组BMSC细胞的软骨特异性蛋白的表达量均明显高于对照组，说明相对于水凝胶直接包载外泌体的方式，本发明实施例提供的外泌体基可注射水凝胶能够显著的促进干细胞向软骨细胞分化。
实施例14外泌体基聚电解质膜的构建
14.1、分别将琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体（sCH-Exo）和氧化硫酸软骨素（oCS）搅拌溶解于5%的葡萄糖溶液和水中，分别得到浓度为1mg/mL的sCH-Exo溶液和oCS溶液；
14.2、将⌀12 mm的玻片放置于特制的聚四氟乙烯支架上，浸泡在浓度为0.5M的NaOH溶液（溶剂为96%的乙醇）中，去除玻片用去离子水充分清洗5次，每次清洗10min，自然晾干备用；
14.3、将玻片浸泡于1 mg/mL的多巴胺溶液中吸附30min，取出用水清洗后，再依次置于所述氧化糖胺多糖溶液和所述琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体溶液中10min，每一层吸附后均使用洗脱液（0.15M氯化钠溶液）进行清洗，清洗3次，每次清洗三分钟，多次重复后，得到所述外泌体基聚电解质膜。
实施例15聚电解质膜接触角（WCA）检测
为了检测聚电解质膜在组装过程中的表面润湿度及其变化情况，选用座滴法检测每一层聚电解质分子吸附后膜表面的WCA值。具体方法为：首先将1µL的水滴滴到膜表面，继而通过椭圆拟合法测得其WCA值，每一种聚电解质膜的每一层制备三个样品用以检测，各样品表面选择五个不同的测试点。
采用上述方法对采用实施例14中方法制得的外泌体基聚电解质膜的接触角进行检测，并采用相同的方法，将实施例14中琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体替换为琥珀酰化壳聚糖制得不含有外泌体的聚电解质膜作为对照组，结果如图8所示；
图8中，oCS/sCH表示不含有外泌体的聚电解质膜，oCS/sCH-Exo表示外泌体基聚电解质膜，从图8中可以看出，两组样品均出现了接触角的振荡变化，说明采用琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体作为组装单元与琥珀酰化壳聚糖类似，均能够与氧化硫酸软骨素进行层层自组装制备得到聚电解质膜。
实施例16外泌体基聚电解质膜缓释效果检测
采用实施例14中方法制备外泌体基聚电解质膜（命名为oCS/sCH-Exo）作为实验组，将实施例14中琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体替换为琥珀酰化壳聚糖制得不含有外泌体的聚电解质膜，然后再直接负载外泌体（命名为[oCS /sCH]-Exo）作为对照组，将两组聚电解质膜分别置于24孔板中，加入PBS溶液，在预定时间内收集浸提液，利用BCA检测释放的外泌体浓度，结果如图9所示；
图9中，[oCS /sCH]-Exo表示直接负载外泌体的聚电解质膜，oCS/sCH-Exo表示外泌体基聚电解质膜，横坐标表示时间，纵坐标表示释放量，从图9可以看出，在整个释放周期内对照组和实验组均未出现外泌体的突释，但实验组的释放速率较对照组显著较低，表明通过琥珀酰化壳聚糖修饰外泌体制备的聚电解质膜能够更好的进行外泌体控释，使其能够在较长时间内发挥组织再生修复的效果。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种外泌体基可注射水凝胶，其特征在于，由琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体和氧化硫酸软骨素组成，所述琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体包括外泌体和修饰于所述外泌体表面的琥珀酰化壳聚糖；
所述琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、配制琥珀酰化壳聚糖溶液和外泌体溶液；
步骤S2、将所述琥珀酰化壳聚糖溶液和所述外泌体溶液搅拌混合后，离心去除上清液，得到的沉淀为所述琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体；
在所述步骤S1之后，在所述步骤S2之前，还包括：
在所述琥珀酰化壳聚糖溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺溶液和/或N-羟基琥珀酰亚胺溶液进行混合，得到混合溶液；
所述步骤S2包括：
将所述混合溶液和所述外泌体溶液搅拌混合后，离心去除上清液，得到的沉淀为所述琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体。
2.根据权利要求1所述的外泌体基可注射水凝胶，其特征在于，所述外泌体为载药外泌体。
3.根据权利要求2所述的外泌体基可注射水凝胶，其特征在于，所述载药外泌体中包载药物包括KGN或TGF-β1。
4.如权利要求1-3任一项所述的外泌体基可注射水凝胶在制备组织修复药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外泌体基可注射水凝胶的制备方法，包括：
将所述琥珀酰化壳聚糖修饰的外泌体与氧化硫酸软骨素混合后原位交联形成亚胺键，得到所述外泌体基可注射水凝胶。
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