CN111269444A - 一种交联微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物组织工程细胞支架材料领域，涉及一种交联微球及其制备方法和应用。该方法先通过喷雾冷冻干燥方式制备出壳聚糖‑明胶物理混合微球，然后使物理混合微球中的氨基和羧基进行化学交联，从而制备交联微球。不仅解决了由单用喷雾冷冻方式导致的微球结构不稳定的问题，同时联用壳聚糖和明胶可以提高微球的细胞黏附特性，以其作为微载体可以提高细胞培养效率，既可二维静态培养，也可三维动态培养。本发明中的壳聚糖和明胶原料成本低，物理混合微球和化学交联微球的大规模生产成本低，且无有毒物质残留，可进行大规模细胞培养，在体内注射方面具有极大的应用前景。

Description

一种交联微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物组织工程细胞支架材料领域，涉及一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，通过该制备方法制得的微球，以及利用该微球作为细胞培养微载体的应用。
背景技术
近年来，在糖尿病、角膜病变、软骨组织损伤等疾病治疗方面，围绕细胞治疗(celltherapy)已获得大量研究成果，并且有一部分已应用于临床，具有极大的应用前景。而微载体培养技术(microcarrier culture technique)是实现贴壁细胞大规模培养的有效手段。目前，国外已实现部分实心或多孔微载体的商品化，如通用电气医疗公司(GE Healthcare)的CytoporeTM、CytodexTM、CytolineTM等系列微球，以及康宁公司(CORNING)的
Figure BDA0002378361250000011
可溶性微载体(DMC)等。与此同时，还有多种微载体正处于研究阶段。
与传统的平板培养法相比，微载体培养法能够使待培养的细胞在微载体上贴壁生长，实现大规模悬浮培养。适于细胞培养的微载体的尺寸约为100-400μm(1,2)。但现有的微球制备技术在满足尺寸要求的前提下大多无法去除本身有毒性的物质，微载体应用仅限于细胞的体外培养。例如，康宁公司的中国专利申请CN 107849528 A中公开了一种符合尺寸要求的PGA-明胶微载体，但其制备过程中使用了戊二醛(对人体具有强烈的刺激作用)作为交联剂。因此，仍需开发既能满足用于细胞悬浮培养的尺寸要求，又无毒性残留物的微载体及其制备技术，用于大规模三维细胞的培养。
壳聚糖(chitosan，或称几丁聚糖)是一种储量极为丰富、生产成本低廉的天然多糖，主要来源于甲壳类动物(如虾、蟹等)的外壳以及某些真菌的细胞壁。壳聚糖是甲壳素(chitin，或称几丁质)的N-脱乙酰基产物，具有抗菌性能好、体内排异反应小、可降解吸收等优良特性，在医用敷料、人造组织、药物缓释载体等领域具有广泛应用，已被中国、美国等国家批准为药用辅料。然而，壳聚糖类微球多采用有毒的交联剂来合成，因此很难成为品质要求较高的药物的载体。例如，Chen等人采用戊二醛作为交联剂来制备壳聚糖微球(3)。常规喷雾加热干燥机在工作时，加热会导致液滴收缩，因此所得颗粒的尺寸不能达到上述细胞培养最佳的范围，且颗粒形貌很难控制。另一方面，部分壳聚糖由于其较高的粘度，冷冻喷雾干燥工艺不适于制备微球，限制了壳聚糖的广泛应用。
为了避免加热所造成的影响，Liang W.等人以及Wanning S.(4,5)等人均采用喷雾冷冻法制备壳聚糖微球，采用液氮作为凝固浴，使微球保持球形，但不足之处在于，所得微球结构稳定性差。同时，采用液氮进行冷冻，工艺操作性差。基于其结构的不稳定性，该类微球多用于提高药物的溶解(6)。
作为药用辅料的明胶(gelatin)是胶原的变性产物，具有良好的生物相容性和可降解性，其降解产物氨基酸易被吸收。明胶的原料生产成本低，在胶囊、片剂包衣(糖衣)、代血浆、止血剂等领域具有广泛应用。此外，明胶的问题在于易溶于热水。例如，Kim等人将未交联的明胶球置于37℃水中，发现明胶完全溶解(7)。因此，尽管明胶含有RGD序列，可以很好地黏附细胞，可改善细胞黏附能力，但由于其溶解/溶胀导致结构稳定性差，在三维动态细胞培养中，微载体结构不稳定，甚至破碎，造成细胞黏附性变差。因此，人们亟需一种尺寸适宜、细胞黏附性能好、结构稳定的微载体用于细胞培养。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决现有微载体包含有毒的交联剂残留物且尺寸达不到要求，单用壳聚糖适用范围窄且粘度大，单用明胶稳定性差，单用喷雾冷冻法制得的微球易碎、稳定性低等问题，本发明首次通过喷雾冷冻干燥法与化学交联法联用，即首次通过喷雾冷冻干燥制备出壳聚糖-明胶物理混合微球，再将其悬浮于交联体系，在保证其结构完整性的情况下实现化学交联法，从而制备出了直径为100-400μm的壳聚糖-明胶微载体。通过上述方法制得的微载体，尺寸适于三维培养，不会残留有毒物质，并且适用范围较宽，细胞培养体系中稳定性高，细胞培养效率高，并可以用于体内注射，有极高的应用前景。
用于解决问题的方案
第一方面，本发明提供了一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，该方法先通过喷雾冷冻干燥制备物理混合微球，随后对该微球进行化学交联，从而得到交联微球，具体包括下列步骤：
1)将壳聚糖加入到酸溶液中，在温度A条件下溶解，得到壳聚糖溶液；将明胶加入到水中，在温度B条件下溶解，得到明胶溶液；将壳聚糖溶液与明胶溶液混合，得到壳聚糖-明胶混合溶液；将壳聚糖-明胶混合溶液喷雾冷冻并冻干，得到壳聚糖-明胶物理混合微球；
2)将步骤1)中的壳聚糖-明胶物理混合微球加入到洗涤溶剂A中洗涤，过滤，将截留物加入到交联剂溶液中，在温度C条件下交联，过滤，将截留物中加入到pH调节剂中中和，过滤，将截留物加入到洗涤溶剂B中振荡，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖的脱乙酰度为70％-100％，优选80％-98％。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖的粘度为1-200mPa.s，优选5-120mPa.s。
进一步地，在上述制备方法中，所述酸为氯化氢、甲酸、冰醋酸(乙酸)、乳酸、苹果酸或抗坏血酸，优选冰醋酸。
进一步地，在上述制备方法中，所述酸溶液为所述酸的水溶液，其质量浓度为0.5-10g/100mL，优选为1-3g/100mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.5-5g/100mL，优选1-3g/100mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖由透明质酸、葡聚糖、藻酸、淀粉、胶原、丝素蛋白、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸代替。
进一步地，在上述制备方法中，所述明胶为A型明胶或B型明胶，优选A型明胶。
进一步地，在上述制备方法中，所述明胶在双冻力检测条件下的冻力度为160-250g/cm2，优选200-250g/cm2，更优选220-250g/cm2。
进一步地，在上述制备方法中，所述水为去离子水。
进一步地，在上述制备方法中，所述明胶溶液的质量浓度为0.5-20g/100mL，优选1-6g/100mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖与所述明胶的质量比为10:1-1:10，优选2:1-1:2。
进一步地，在上述制备方法中，所述温度A和所述温度B各自独立地为1-100℃，优选50-70℃。
进一步地，在上述制备方法中，所述混合采用机械搅拌装置、磁力搅拌装置或均质搅拌装置来完成，优选均质搅拌装置。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖-明胶混合溶液的粘度不超过50mPa.s。
进一步地，在上述制备方法中，所述喷雾冷冻采用喷雾冷却塔来完成。
进一步地，在上述制备方法中，所述喷雾冷却塔的雾化器为离心式雾化器、压力式雾化器或气流式雾化器，优选压力式雾化器。
进一步地，在上述制备方法中，所述雾化器的喷嘴为50-1000μm喷嘴，优选70-300μm喷嘴。
进一步地，在上述制备方法中，所述雾化器的喷雾流速为0.1-20L/h。
进一步地，在上述制备方法中，所述喷雾冷却塔的内部温度为零下10℃-零下100℃，优选零下40℃-零下80℃。
进一步地，在上述制备方法中，所述洗涤溶剂A为无水乙醇或其含水量在1％(v/v)以下的乙醇水溶液，优选无水乙醇。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述洗涤溶液A的用量比为1g:100-1000mL，优选1g:200-600mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述洗涤的时间为1-48h，优选20-26h。
进一步地，在上述制备方法中，所述交联剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)在乙醇或乙醇水溶液中，优选在30％-50％(v/v)乙醇水溶液中的溶液。
进一步地，在上述制备方法中，所述交联剂溶液中EDC、NHS和MES的摩尔浓度各自独立地为1-1000mM，优选200-400mM。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述交联剂溶液的用量比为1g:100-400mL，优选1g:150-200mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述温度C为3-40℃，优选为33-37℃，在该温度下微球结构相对稳定。
进一步地，在上述制备方法中，所述交联的时间为1-100h，优选10-30h。
进一步地，在上述制备方法中，所述pH调节剂为磷酸氢二钠(Na2HPO4)在乙醇或乙醇水溶液中，优选在30％-50％(v/v)乙醇水溶液中的溶液。
进一步地，在上述制备方法中，所述pH调节剂中Na2HPO4的摩尔浓度为0.05-10M，优选0.05-0.15M。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述pH调节剂的用量比为1g:100-1000mL，优选1g:150-200mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述中和的终点为pH＝7-12，优选pH＝8-9。
进一步地，在上述制备方法中，所述洗涤溶剂B为水、乙醇或乙醇水溶液，优选30％-50％(v/v)乙醇水溶液。
进一步地，在上述制备方法中，所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述洗涤溶液B的用量比为1g:10-400mL。
进一步地，在上述制备方法中，所述冻干采用冷冻干燥机来完成。
进一步地，在上述制备方法中，所述冻干所使用的赋形剂选自甘露醇、山梨醇、肌醇、乙二醇、聚乙二醇、侧金盏花醇、葡聚糖、环糊精、麦芽糊精、海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、磷酸盐、碳酸钙、硫酸锰、乙酸钠、粘多糖蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白中的至少一种。
进一步地，在上述制备方法中，所述冻干的时间为24-72h，优选48h。
第二方面，本发明提供了一种通过上述制备方法制得的壳聚糖-明胶交联微球。
进一步地，所述壳聚糖-明胶交联微球的粒径为100-1000μm，优选100-400μm。
进一步地，所述壳聚糖-明胶交联微球具有联通外表孔隙，所述孔隙的孔径为5-100μm，优选10-30μm。
第三方面，本发明提供了上述壳聚糖-明胶交联微球作为微载体在细胞培养中的应用。
进一步地，在上述应用中，所述培养为静态培养或动态培养。
进一步地，在上述应用中，所述细胞选自293细胞、HEK293细胞、HEK-293T细胞、293T细胞、293TN细胞、293FT细胞、AAV-293细胞、HUVEC细胞、ECV-304细胞、L929细胞、WB-F344细胞、L-02细胞、THP-1细胞、D407细胞、CHO细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞和IPS细胞，优选间充质干细胞或脂肪干细胞。
第四方面，本发明提供了一种利用上述壳聚糖-明胶交联微球作为微载体进行动态细胞培养的方法，其包括下列步骤：
1)将上述壳聚糖-明胶交联微球加入到培养基中预培养；
2)在预培养后的壳聚糖-明胶交联微球上接种细胞；
3)将接种细胞后的壳聚糖-明胶交联微球继续培养。
进一步地，在上述方法中，所述培养基为完全培养基，优选干细胞完全培养基。
进一步地，在上述方法中，所述壳聚糖-明胶交联微球与所述培养基的用量比为1g:30-1000mL，优选1g:400-600mL。
进一步地，在上述方法中，所述预培养的搅拌速度为45-50rpm。
进一步地，在上述方法中，所述预培养的环境参数为37℃和5％(v/v)CO2。
进一步地，在上述方法中，所述接种的接种量为0.5×105-9×106个细胞，优选1×105-2×106个细胞。
进一步地，在上述方法中，所述细胞选自293细胞、HEK293细胞、HEK-293T细胞、293T细胞、293TN细胞、293FT细胞、AAV-293细胞、HUVEC细胞、ECV-304细胞、L929细胞、WB-F344细胞、L-02细胞、THP-1细胞、D407细胞、CHO细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞和IPS细胞，优选间充质干细胞或脂肪干细胞。
进一步地，在上述方法中，所述继续培养与所述预培养的条件相同。
进一步地，在上述方法中，所述继续培养的时间为1-15天，优选1-9天，更优选1-5天。
发明的效果
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的壳聚糖-明胶交联微球成分明确，不含有毒的交联剂残留物，其于细胞培养的过程中结构稳定且尺寸适于细胞培养，且含有明胶，能够有效提高细胞黏附。本发明所得交联微球，既能够在平面孔板中进行二维静态细胞培养，也能够在转瓶或生物反应器中进行三维动态细胞培养。与物理混合微球相比，采用交联微球作为微载体来培养细胞的增殖倍数提高了50％-5000％。
采用本发明的交联微球进行培养细胞，能够大大提高细胞的扩增效率，在培养干细胞时，可以使干细胞生长正常，并且在交联微球上扩增后仍可保持干细胞的“干性”。
本发明的交联微球的制备方法简便、易行，为工业化生产开辟了道路，并且有利于实现细胞的大规模增殖，为其在膝关节病症、肌腱损伤等领域中的体内注射施用提供了一种可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需的附图进行简单介绍。应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，而不应被看作是对本发明的保护范围的限定。
图1示出了实施例1中壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-60℃)的SEM照片。
图2示出了实施例2中壳聚糖-明胶物理混合微球(C2G1-2.4％/-60℃)的SEM照片。
图3示出了实施例3中壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-80℃)的SEM照片。
图4示出了实施例8中壳聚糖-明胶交联微球(C1G2-3.0％/-60℃)的SEM照片。
图5示出了实施例10中壳聚糖-明胶交联微球(C1G2-3.0％/-80℃)的SEM照片。
图6示出了实施例14中壳聚糖-明胶交联微球(C1G9-5.0％/-60℃)在水溶液中的光学显微镜照片。
图7示出了实施例15中壳聚糖-明胶物理混合微球交联前后的溶胀6小时的显微照片，其中：图7A对应实施例1中所得微球；图7B对应实施例8中所得微球；图7C对应实施例5中所得微球；图7D对应实施例12中所得微球。
图8示出了实施例16中利用壳聚糖-明胶物理混合微球进行二维静态培养的活细胞染色的荧光照片。
图9示出了实施例19中利用壳聚糖-明胶物理混合微球进行三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。
图10示出了实施例20中利用壳聚糖-明胶物理混合微球进行三维动态培养的明场显微镜照片。
图11示出了实施例21中利用壳聚糖-明胶物理混合微球进行三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。
图12示出了实施例25中利用壳聚糖-明胶交联微球进行三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。
图13示出了实施例26中利用壳聚糖-明胶交联微球进行三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。
图14示出了实施例27中利用壳聚糖-明胶交联微球进行三维动态培养的活细胞染色的荧光照片。
具体实施方式
[术语定义]
除非另有说明，本文中所使用的“数值A～数值B”是指包括作为端点的数值A和B在内的数值范围。
除非另有说明，本文中所使用的“可以”是指既包括进行某种行为、操作或处理，也包括不进行相应的动作。
除非另有说明，本文中所使用的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可以存在于其它实施方案中。另外，应当理解，所述要素均可以采用任何合适的方式组合在各种实施方案中。
下面将结合具体实施例来进一步阐述本发明中的技术方案。应当理解的是，下列实施例仅用于解释和说明本发明，而并不用于限定本发明的保护范围。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外，除非另有说明，下列实施例中使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。实施例中凡未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[壳聚糖-明胶物理混合微球的制备]
实施例1：
将壳聚糖粉末(1.2g，脱乙酰度为98.7％，粘度为29mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(60mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(60mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(2.4g)加入到去离子水(60mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(60mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为3.0％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-60℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为1:2的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-60℃)。
如图1所示，物理混合微球的直径在100-400μm之间，大小均匀，表面粗糙，呈多孔状，孔径约为10-30μm。
实施例2：
将壳聚糖粉末(2.0g，脱乙酰度为90％，粘度为112mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(100mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(100mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(1.0g)加入到去离子水(25mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(25mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为2.4％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-60℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为2:1的壳聚糖-明胶物理混合微球(C2G1-2.4％/-60℃)。
如图2所示，物理混合微球的直径在100-400μm之间，大小均匀，表面粗糙，呈多孔状。
实施例3：
将壳聚糖粉末(1.2g，脱乙酰度为98.7％，粘度为29mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(60mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(60mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(2.4g)加入到去离子水(60mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(60mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为3.0％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-80℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为1:2的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-80℃)。
如图3所示，物理混合微球的直径在100-400μm之间，大小均匀，表面粗糙，呈多孔状。
实施例4：
将壳聚糖粉末(2.0g，脱乙酰度为90％，粘度为112mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(100mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(100mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(1.0g)加入到去离子水(25mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(25mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为2.4％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-80℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为2:1的壳聚糖-明胶物理混合微球(C2G1-2.4％/-80℃)。
实施例5：
将壳聚糖粉末(1.2g，脱乙酰度为98.7％，粘度为29mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(60mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(60mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(2.4g)加入到去离子水(60mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(60mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为3.0％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-40℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为1:2的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-40℃)。
实施例6：
将壳聚糖粉末(2g，脱乙酰度为98.7％，粘度为29mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(100mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(100mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(0.4g)加入到去离子水(10mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的4％(w/v)明胶溶液(10mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为2.2％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-60℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为5:1的壳聚糖-明胶物理混合微球(C5G1-2.2％/-60℃)。
实施例7：
将壳聚糖粉末(0.8g，脱乙酰度为98.7％，粘度为29mPa.s，购自浙江金壳药业股份有限公司)加入到2％(w/v)冰醋酸水溶液(40mL)中，于65℃溶解5h，静置24h，得到无气泡的、均匀透明的2％(w/v)壳聚糖溶液(40mL)。
将250冻力(双冻力)的A型明胶(7.2g)加入到去离子水(120mL)中，于65℃溶解，静置24h，得到稳定的、透明的6％(w/v)明胶溶液(120mL)。
将壳聚糖溶液和明胶溶液混合，并采用13000rpm高速均质机均质10min，使其混合均匀，得到固含量为5.0％的壳聚糖-明胶混合溶液。
将壳聚糖-明胶混合溶液置于喷雾冷冻塔的雾化器中，并喷入预冷至-60℃的冷却塔中，收集已经冰冻的微球，并在冻干机中冻干48h，得到壳聚糖与明胶的质量比为1:9的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G9-5.0％/-60℃)。
[壳聚糖-明胶物理混合微球的化学交联]
实施例8：
将实施例1中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-60℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联3d，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
如图4所示，化学交联后，交联微球表面仍呈多孔状，与实施例1中的物理混合微球相比，表面更加粗糙。
实施例9：
将实施例2中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C2G1-2.4％/-60℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联16h，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
实施例10：
将实施例3中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-80℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联3d，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
如图5所示，化学交联后，微球表面仍呈多孔状，表面粗糙，其截面可以看出微球内部也存在孔隙。与实施例3相比，其尺寸和形貌基本类似。由此说明，交联过程中，物理混合微球结构稳定，未发生大的变形或破碎。
实施例11：
将实施例4中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C2G1-2.4％/-80℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联16h，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
实施例12：
将实施例5中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G2-3.0％/-40℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联16h，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
实施例13：
将实施例6中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C5G1-2.2％/-60℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联16h，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
实施例14：
将实施例7中的壳聚糖-明胶物理混合微球(C1G9-5.0％/-60℃)(0.15g)加入到无水乙醇(50mL)中洗涤24h，过滤，得到截留物。
将MES、EDC和NHS(各16.67mmol)溶于40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中，得到交联剂溶液。将截留物加入到交联剂溶液(25mL)中，于35℃交联16h，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％乙醇水溶液(25mL，含有0.1M的Na2HPO4)中，使得最终的pH为8-9，过滤，得到截留物。
将截留物加入到40％(v/v)乙醇水溶液(50mL)中振荡洗涤3次，每次30min，速度250rpm，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
如图6所示，微球的粒径为155±30μm。微球在交联后仍存在孔隙结构。
实施例15：
按照如下操作，分别将实施例1(图7A)、实施例8(图7B)、实施例5(图7C)与实施例12(图7D)进行对比试验：在26℃条件下，将微球加入到无水乙醇中，洗涤24h，过滤，然后加入到水中，洗涤6h，对比交联前后微球的溶胀状态。
如图7所示，实施例1和实施例8中微球的粒径分别为360±100μm和390±100μm，实施例5和实施例12中微球的粒径分别为166±50μm和205±60μm。交联后的粒径相较于交联前略有增大，这可能是由于交联过程中明胶的溶胀所致。将壳聚糖/明胶混合溶液喷冷，壳聚糖和明胶两者之间仍处于分子级别的混合状态，没有形成明显的相分离。在低温冻干后，所得微球上有孔隙(见图1)，催化剂/交联剂通过孔隙扩散至内部，明胶的官能团与壳聚糖的官能团之间发生交联反应，从而形成壳聚糖/明胶交联微球，而该交联微球的宏观结构与交联之前的微球类似。
[利用壳聚糖-明胶物理混合微球为微载体的二维静态细胞培养]
实施例16：
将实施例1中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的微球置于硅化过的12孔培养板中(具体硅化过程如下：将二甲基硅烷加入孔板内，1mL/孔，在60℃条件下烤干，用75％(v/v)酒精洗涤3次，每次10min，再用PBS洗涤3次，每次10min，即可)，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA(二乙酸荧光素)染色，观察细胞在微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
如图8所示，细胞良好地黏附在微球表面，在第3天的时候有所增殖，说明壳聚糖-明胶物理混合微球可以满足细胞二维静态生长。
实施例17：
将实施例2中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的微球置于硅化过的12孔培养板中，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA染色，观察细胞在微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
实施例18：
将实施例3中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的微球置于硅化过的12孔培养板中，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA染色，观察细胞在微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
[利用壳聚糖-明胶物理混合微球为微载体的三维动态细胞培养]
实施例19：
将实施例1中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。第二天，接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1.5×106个细胞)，设置磁力搅拌器的转停时间，搅拌2min，静置25min，循环12次后，以预培养时的条件继续培养，然后用FDA染色，于第1、3和5天分别取样，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。
如图9所示，在三维动态培养中，微球未见破碎，细胞于第1天的黏附情况良好，并于第3天和第5天有所增殖。结晶紫计数结果显示，细胞数量先由第1天的0.84×106个增至第3天的2.27×106个，然后进一步增至第5天的4.70×106个，证明细胞确有增殖。
实施例20：
将实施例2中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。
如图10所示，虽然实施例19中的微球未见破碎，且细胞还有所增殖，但在本实施例中，旋转作业的搅拌桨却使微球出现破碎情况，因此并未进行后续的细胞培养和染色。上述结果说明由喷雾冷冻干燥方式制得的壳聚糖-明胶物理混合微球的结构还不够稳定，仍需进一步固化，即化学交联。
实施例21：
将实施例3中制得的壳聚糖-明胶物理混合微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。第二天，接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1.5×106个细胞)，设置磁力搅拌器的转停时间，搅拌2min，静置25min，循环12次后，以预培养时的条件继续培养，然后用FDA染色，于第1、3和5天分别取样，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。
如图11所示，微球破碎情况明显，且细胞黏附较少，需要进一步固化。
[利用壳聚糖-明胶化学交联微球为微载体的二维静态细胞培养]
实施例22：
将实施例8中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的交联微球置于硅化过的12孔培养板中，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA染色，观察细胞在交联微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
实施例23：
将实施例9中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的交联微球置于硅化过的12孔培养板中，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA染色，观察细胞在交联微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
实施例24：
将实施例10中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)进行高压灭菌，然后用PBS(50mL)漂洗3遍。将灭菌后的交联微球置于硅化过的12孔培养板中，加入干细胞完全培养基(1.5mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，平衡1h。弃去培养基，再加入新鲜的培养基(1.5mL)，然后接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1×105个细胞)，摇晃均匀后，将孔板放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下培养24h。然后用FDA染色，观察细胞在交联微球上于第1天和第3天的黏附及增殖情况。
[利用壳聚糖-明胶化学交联微球为微载体的三维动态细胞培养]
实施例25：
将实施例8中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将交联微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。第二天，接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1.5×106个细胞)，设置磁力搅拌器的转停时间，搅拌2min，静置25min，循环12次后，以预培养时的条件继续培养，然后用FDA染色，于第1、3、5天分别取样，观察细胞形态，并于第1、3和5天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。
如图12所示，可以观察到荧光强度显著增强，表明细胞在交联微球上接种后的第1-5天增殖明显，且从荧光强度上看，采用化学交联微载体三维培养方式的细胞增殖数量高于采用物理混合微球三维培养方式的细胞增殖数量。结晶紫计数结果显示，细胞数量先由第1天的0.84×106个增至第2天的4.75×106个，然后进一步增至第5天的9.37×106个，得到了显著提高，表明经过交联固化处理的微球更加适合于细胞黏附和增殖。
实施例26：
将实施例9中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将交联微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。第二天，接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1.5×106个细胞)，设置磁力搅拌器的转停时间，搅拌2min，静置25min，循环12次后，以预培养时的条件继续培养，然后用FDA染色，于第1、3、5天分别取样，观察细胞形态，并于第3、5、7和9天分别使用结晶紫-柠檬酸染色法进行计数。
如图13所示，可以观察到荧光强度显著增强，表明细胞在交联微球上接种后的第1-5天增殖明显，且从荧光强度上看，采用化学交联微载体三维培养方式的细胞增殖数量高于采用物理混合微球三维培养方式的细胞增殖数量。
实施例27：
将实施例10中制得的壳聚糖-明胶交联微球(0.1g)用PBS漂洗4遍。将交联微球置于配有搅拌桨的转瓶中，加入干细胞完全培养基(50mL，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，并将转瓶放入二氧化碳培养箱中，于37℃、5％CO2条件下过夜预培养，搅拌桨的转速设为45-50rpm，使得微球能够均匀地悬浮于培养基中。第二天，接种人脐带血间充质干细胞(接种量为1.5×106个细胞)，设置磁力搅拌器的转停时间，搅拌2min，静置25min，循环12次后，以预培养时的条件继续培养，然后用FDA染色，于第1、3、5天分别取样，观察细胞形态，并于第3、5、7和9天分别使用结晶紫柠檬酸染色法进行计数。
如图14所示，可以观察到荧光强度显著增强，表明细胞在交联微球上接种后的第1-5天增殖明显，且从荧光强度上看，采用化学交联微载体三维培养方式的细胞增殖数量高于采用物理混合微球三维培养方式的细胞增殖数量。
[FDA染色]
实施例28：
使用移液器将实施例16-19和21-27中用于培养细胞的物理混合微球/交联微球从孔板和转瓶中吸出来，转移至离心管中，静止一段时间后，待微球全部沉降到底部，去掉上清培养基，然后用PBS悬浮，洗涤2次。从冰箱中取出FDA(二乙酸荧光素)，复温摇匀，FDA尽量避光，从转瓶中取一部分微球至48孔板中，用PBS漂洗三遍后加入FDA染色液，避光染色15min，弃染色液，加入PBS漂洗3遍后用倒置荧光显微镜观察拍照。
[结晶紫-柠檬酸染色]
实施例29：
将实施例19、21和25-27中的转瓶从37℃、5％CO2条件下的培养箱中取出，用移液枪吸取混合均匀的微球悬液(1mL)至1.5mL离心管中。待管中微球自然沉降，弃去上清液，加入0.1％结晶紫-柠檬酸溶液(1mL)，将离心管放入37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，使细胞核充分裂解。吹打均匀后，取裂解液(10μL)于血球计数板计数。计数完成后，得到1mL微球悬液的细胞数，再乘以对应的培养体积，即可得到转瓶中微球上粘附的细胞总数。
如表1所示，采用物理混合微球进行三维动态细胞培养的稳定性较差，部分微球上的细胞可以增殖至5倍(增殖倍率为当天的细胞总数除以培养前的接种量(第0天)的细胞总数或实际接种(即培养1天的)的细胞总数，如实施例19)，但部分微球却会在培养过程中碎掉(如实施例20)，且随着培养时间的加长，细胞数量反而会降低(如实施例21)。而经过化学交联之后，细胞的黏附和增殖比较稳定，细胞数量远远高于物理混合微球上的细胞数量(如实施例25-27)，且微球相互之间不粘连，分散性较为理想。
表1.实施例19-21和25-27中微球的结晶紫-柠檬酸染色计数结果
Figure BDA0002378361250000191
Figure BDA0002378361250000201
参考文献：
1.GE Healthcare,Microcarrier Cell Culture Principles and Methods[M],General Electric Company,2005.
2.Tavassoli H,et al.,Large-scale Production of Stem Cells UtilizingMicrocarriers:A Biomaterials Engineering Perspective from Academic Researchto Commercialized Products[J],Biomaterials,2018,181:333-346.
3.Pengfei Chen,et al.,Intra-articular delivery of sinomeniumencapsulated by chitosan microspheres and photo-crosslinked GelMA hydrogelameliorates osteoarthritis by effectively regulating autophagy[J],Biomaterials,2016,81:1-13.
4.Liang W.,et al.,Using two-fluid nozzle for spray freeze drying toproduce porous powder formulation of naked siRNA for inhalation[J],International Journal of Pharmaceutics,2018,552(1-2):67-75.
5.Wanning S.,et al.,Pharmaceutical spray freeze drying[J],International Journal of Pharmaceutics,2015,488(1-2):136-153.
6.Leuenberger H.,et al.,Spray-freeze drying in a fluidized bed atnormal and low pressure[J],Drying Technology,2006,24:711-719.
7.Sungwoo Kim,et al.,Sequential delivery of BMP-2and IGF-1using achitosan gel with gelatin microspheres enhances early osteoblasticdifferentiation[J],Acta Biomaterialia,2012,8:1768-1777.

Claims (16)

1.一种壳聚糖-明胶交联微球的制备方法，其包括下列步骤：
1)将壳聚糖加入到酸溶液中，在温度A条件下溶解，得到壳聚糖溶液；将明胶加入到水中，在温度B条件下溶解，得到明胶溶液；将壳聚糖溶液与明胶溶液混合，得到壳聚糖-明胶混合溶液；将壳聚糖-明胶混合溶液喷雾冷冻并冻干，得到壳聚糖-明胶物理混合微球；
2)将步骤1)中的壳聚糖-明胶物理混合微球加入到洗涤溶剂A中洗涤，过滤，将截留物加入到交联剂溶液中，在温度C条件下交联，过滤，将截留物中加入到pH调节剂中中和，过滤，将截留物加入到洗涤溶剂B中振荡，将沉淀物冻干，得到壳聚糖-明胶交联微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述壳聚糖的脱乙酰度为70％-100％，优选80％-98％；所述壳聚糖的粘度为1-200mPa.s，优选5-120mPa.s；
所述酸为氯化氢、甲酸、冰醋酸、乳酸、苹果酸或抗坏血酸，优选冰醋酸；
所述酸溶液为所述酸的水溶液，其质量浓度为0.5-10g/100mL，优选为1-3g/100mL；
所述温度A为1-100℃，优选50-70℃；
所述壳聚糖溶液的质量浓度为0.5-5g/100mL，优选1-3g/100mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述明胶为A型明胶或B型明胶，优选A型明胶；
所述明胶在双冻力检测条件下的冻力度为160-250g/cm2，优选200-250g/cm2，更优选220-250g/cm2；
所述水为去离子水；
所述温度B为1-100℃，优选50-70℃；
所述明胶溶液的质量浓度为0.5-20g/100mL，优选1-6g/100mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述壳聚糖与所述明胶的质量比为10:1-1:10，优选2:1-1:2；
所述壳聚糖-明胶混合溶液的粘度不超过50mPa.s。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述混合采用机械搅拌装置、磁力搅拌装置或均质搅拌装置来完成，优选均质搅拌装置；
所述喷雾冷冻采用喷雾冷却塔来完成；
所述冻干采用冷冻干燥机来完成。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述洗涤溶剂A为无水乙醇或其含水量在1％(v/v)以下的乙醇水溶液，优选无水乙醇；
所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述洗涤溶液A的用量比为1g:100-1000mL，优选1g:200-600mL；
所述洗涤的时间为1-48h，优选20-26h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述交联剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉基)乙磺酸在乙醇或乙醇水溶液中，优选在30％-50％(v/v)乙醇水溶液中的溶液；
所述交联剂溶液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和2-(N-吗啉基)乙磺酸的摩尔浓度各自独立地为1-1000mM，优选200-400mM；
所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述交联剂溶液的用量比为1g:100-400mL，优选1g:150-200mL；
所述温度C为3-40℃，优选为33-37℃；
所述交联的时间为1-100h，优选10-30h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述pH调节剂为磷酸氢二钠在乙醇或乙醇水溶液中，优选在30％-50％(v/v)乙醇水溶液中的溶液；
所述pH调节剂中磷酸氢二钠的摩尔浓度为0.05-10M，优选0.05-0.15M；
所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述pH调节剂的用量比为1g:100-1000mL，优选1g:150-200mL；
所述中和的终点为pH＝7-12，优选pH＝8-9。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述洗涤溶剂B为水、乙醇或乙醇水溶液，优选30％-50％(v/v)乙醇水溶液；
所述壳聚糖-明胶物理混合微球与所述洗涤溶液B的用量比为1g:10-400mL。
10.一种通过根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法制得的壳聚糖-明胶交联微球。
11.根据权利要求10所述的壳聚糖明胶交联微球，其特征在于：
所述壳聚糖-明胶交联微球的粒径为100-1000μm，优选100-400μm；
所述壳聚糖-明胶交联微球具有联通外表孔隙，所述孔隙的孔径为5-100μm，优选10-30μm。
12.根据权利要求10或11所述的壳聚糖-明胶交联微球作为微载体在细胞培养中的应用。
13.一种利用根据权利要求10或11所述的壳聚糖-明胶交联微球作为微载体进行动态细胞培养的方法，其包括下列步骤：
1)将上述壳聚糖-明胶交联微球加入到培养基中预培养；
2)在预培养后的壳聚糖-明胶交联微球上接种细胞；
3)将接种细胞后的壳聚糖-明胶交联微球继续培养。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：
所述培养基为完全培养基，优选干细胞完全培养基；
所述壳聚糖-明胶交联微球与所述培养基的用量比为1g:30-1000mL，优选1g:400-600mL；
所述预培养的搅拌速度为45-50rpm；
所述预培养的环境参数为37℃和5％(v/v)CO2。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：
所述接种的接种量为0.5×105-9×106个细胞，优选1×105-2×106个细胞；
所述细胞选自293细胞、HEK293细胞、HEK-293T细胞、293T细胞、293TN细胞、293FT细胞、AAV-293细胞、HUVEC细胞、ECV-304细胞、L929细胞、WB-F344细胞、L-02细胞、THP-1细胞、D407细胞、CHO细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞和IPS细胞，优选间充质干细胞或脂肪干细胞。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：
所述继续培养与所述预培养的条件相同；
所述继续培养的时间为1-15天，优选1-9天，更优选1-5天。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111704739A (zh) * 2020-06-22 2020-09-25 苏州大学 一种用于三维细胞培养的多孔微球颗粒及其制备方法
CN111793241A (zh) * 2020-07-23 2020-10-20 武汉纺织大学 一种苎麻骨纳米晶纤维素气凝胶及其制备方法
CN112266487A (zh) * 2020-10-22 2021-01-26 苏州新丝原生物科技有限公司 一种固体微球及其制备方法和应用
CN114392390A (zh) * 2022-03-15 2022-04-26 广东泰宝医疗科技股份有限公司 一种海洋植物提取物诱导组织修复水凝胶伤口敷料及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180755A1 (en) * 2001-11-19 2003-09-25 Robin Hwang Pharmaceutical compositions in particulate form
CN101624472A (zh) * 2009-08-11 2010-01-13 南方医科大学珠江医院 一种细胞培养用大孔微载体及其制备方法和用途
CN102172498A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用
US20140316013A1 (en) * 2013-04-22 2014-10-23 Nitto Denko Corporation Crosslinked gelatin support and support for controlled release of physiologically active substance using the same
CN108653741A (zh) * 2018-05-24 2018-10-16 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180755A1 (en) * 2001-11-19 2003-09-25 Robin Hwang Pharmaceutical compositions in particulate form
CN101624472A (zh) * 2009-08-11 2010-01-13 南方医科大学珠江医院 一种细胞培养用大孔微载体及其制备方法和用途
CN102172498A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种三维多孔壳聚糖/明胶微球及其制备方法和在肝细胞培养中的应用
US20140316013A1 (en) * 2013-04-22 2014-10-23 Nitto Denko Corporation Crosslinked gelatin support and support for controlled release of physiologically active substance using the same
CN108653741A (zh) * 2018-05-24 2018-10-16 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
董梅等: "喷雾冷冻干燥技术及其在药物微球中的应用举例", 《制冷技术》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111704739A (zh) * 2020-06-22 2020-09-25 苏州大学 一种用于三维细胞培养的多孔微球颗粒及其制备方法
CN111793241A (zh) * 2020-07-23 2020-10-20 武汉纺织大学 一种苎麻骨纳米晶纤维素气凝胶及其制备方法
CN112266487A (zh) * 2020-10-22 2021-01-26 苏州新丝原生物科技有限公司 一种固体微球及其制备方法和应用
CN114392390A (zh) * 2022-03-15 2022-04-26 广东泰宝医疗科技股份有限公司 一种海洋植物提取物诱导组织修复水凝胶伤口敷料及其制备方法

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