WO2015001163A2 - Nanopartículas lipídicas para la cicatrización de heridas - Google Patents

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WO2015001163A2
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Garazi Gainza Lucea
Silvia Villullas Rincón
Marta Pastor Navarro
Oihane Ibarrola Moreno
Gorka Alonso Hornes
Angel DEL POZO PÉREZ
Rosa María Hernández Martín
Manuela Igartua Olaechea
José Luis PEDRAZ MUÑOZ
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Definitions

  • the invention relates to lipid nanoparticles and their use as pharmaceutical compositions for wound healing, in particular as a suspension of nanoparticles, dressings or gels for topical application.
  • Epidermal growth factor plays an important role in tissue regeneration and repair by stimulating cell migration, differentiation and proliferation, as well as promoting the formation of granulation tissue. From a clinical point of view, EGF has been used to improve healing, especially in diabetic foot ulcers. In clinical trials, evidence has been shown of the beneficial effects of topical application of EGF in neuropathic low-grade ulcers; however, the effect of the topical formulation of EGF can be diminished, especially in high-grade wounds, because an increase in the activity of proteases in this type of wounds has been identified.
  • Rengen-D 150 TM is a gel containing 150 ⁇ g / g of Recombinant Human Epidermal Growth Factor (rhEGF), which is manufactured in India to the treatment of grade I and II diabetic ulcers. It requires an administration of twice a day, for an average treatment period of 6 weeks.
  • Heberprot® a lyophilized formulation containing 75 rhEGF, is administered three times per week by intralesional injection. It is marketed in Norway, Argentina, Colombia, Cuba, Dominican Republic and Venezuela. A pilot study carried out in 20 diabetic patients showed that Heberprot® is a feasible and safe treatment to promote healing in chronic wounds of patients with full thickness ulcers.
  • EP 1 987 817 B1 claims the production process of polymer microspheres containing rhEGF for intralesional administration in the lower extremities of diabetic patients to prevent amputation of lower extremities.
  • Developed microspheres with a rhEGF content of 1.6-2.4% showed a controlled release of rhEGF from 5 to 10 ⁇ g per day for 14 days and a better ability to heal the lesion in humans compared to equivalent amounts of non-encapsulated rhEGF.
  • lipid nanoparticles comprising epidermal growth factor with high encapsulation efficiencies, which applied in a topical formulation applied twice by Week improves healing.
  • the invention relates to a lipid nanoparticle (lipid nanoparticle of the invention) comprising at least one solid lipid at room temperature, at least one non-ionic surfactant, and a growth factor.
  • the invention relates to a method for the preparation of lipid nanoparticle of the invention characterized in that it comprises the following steps:
  • the application refers to a pharmaceutical composition (pharmaceutical composition of the invention) comprising the lipid nanoparticle of the invention and a pharmaceutical vehicle.
  • the application refers to the lipid nanoparticle of the invention and the pharmaceutical composition comprising it, for use as a medicine, and for use in promoting wound healing.
  • FIGURES Figure 1 shows the graphic representation of the in vitro effect of lipid nanoparticles loaded with rhEGF on cell proliferation.
  • Figure 2 shows the photographs of the cellular uptake of the SLN-NileRed and NLC-NileRed formulations.
  • Figure 3 shows the graphic representation of the in vivo effect of (A) SLNs loaded with rhEGF and (B) NLCs loaded with rhEGF at wound closure and (C) photographs of wounds in untreated control rats and rats treated with white SLN, white NLC, rhEGF-MS, empty MS control, free rhEGF, rhEGF-SLN
  • Figure 4 shows the graphic representation of the in vitro effect of lipid nanoparticles loaded with rhEGF in the assessment of inflammation (A, C) and re-epithelialization score (B, D). Data shown as means ⁇ standard deviation.
  • * Significantly greater than the untreated control (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001);'Significantly greater than the empty MS control ("p ⁇ 0.05,” p ⁇ 0.01 and'”pO.001);'Significantly greater than white SLN ( * p ⁇ 0.05,” p ⁇ 0.01 and ••• p ⁇ 0.001) ; v Significantly greater than white NLC ( v p ⁇ 0.05, vv p ⁇ 0.01 and vvv p ⁇ 0.001); ° Significantly greater than free rhEGF (° p ⁇ 0.05, oo p ⁇ 0.01 and ooo p ⁇ 0.001); * Significantly greater than rh
  • Figure 5 shows micrographs (A) and a graphical representation (B) of the cutaneous uptake of SLN-NileRed and NLC-NileRed and paraffin-NileRed (arbitrary values of Pixel brightness (ABU) corrected for the fluorescent background in the stratum corneum, epidermis and dermis).
  • ABU Pixel brightness
  • Figure 6 shows the graphic representation of the in vitro effect of lipid nanoparticles loaded with LL-37 on cell proliferation.
  • Figure 7 shows the graphic representation of the in vitro effect of the combination of rhEGF and LL-37 on cell proliferation.
  • Figure 8 shows (A) the graphic representation of the in vivo effect of empty NLC, free rhEGF and rhEGF-NLC 20 ⁇ g in wound closure in pigs at 15, 25, 36 and 43 days and (B) photographs of wounds of pigs treated with empty NLC, free rhEGF and rhEGF-NLC 20 ig.
  • Figure 9 shows (A) the graphic representation of epithelial length in the different groups studied (empty NLC, free rhEGF and rhEGF-NLC 20 ⁇ g) at 15, 25 and 43 days and (B) histological images of wounds at 15, 25 and 43 days. Data shown as means ⁇ standard deviation (D.E). *** Significantly greater than empty NLC and free rhEGF (p ⁇ 0.001).
  • Figure 10 shows the graphic representation of the extent (mm) of healing at 15 days (A), at 25 days (B) and at 43 days (C). The results are shown as mean ⁇ D.E. *** p ⁇ 0.001 compared to the empty NLC and free rhEGF groups.
  • the first aspect of the present invention relates to a lipid nanoparticle characterized in that it comprises at least one solid lipid at room temperature, at least one non-ionic surfactant, and a growth factor.
  • lipid nanoparticles refer to particles in the nanometric range that possess a solid matrix.
  • the matrix is composed of lipids that are solid at room temperature, but also at body temperature.
  • solid lipid nanoparticles the matrix consists only of a solid lipid.
  • nanostructured lipid carriers NLC
  • the matrix consists of a mixture of solid lipids with liquid lipids (oils), but this mixture being solid at room temperature and also at body temperature (Muller et al. 2002, Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological! preparations.
  • the term "loaded with growth factor” refers to the growth factor embedded or encapsulated in the nanoparticle matrix.
  • the lipid nanoparticles are SLN and in another particular embodiment, the lipid nanoparticles are NLC.
  • the lipid nanoparticles are
  • the growth factor is selected from a group consisting of a growth factor that belongs to the epidermal growth factor family (EGF), family of the transforming growth factor beta
  • TGF-beta family of fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), colony stimulating factor of macrophages and granulocytes (GM-CSF, from English granulocyte macrophage colony stimulating factor), platelet-derived growth factor (PDGF), connective tissue growth factor (CTGF) factor), family of tumor necrosis factor alpha (TNFa), family of insulin-like growth factor (IGF) insulin-like growth factor).
  • the growth factor belongs to the family of epidermal growth factor (EGF), and more preferably the growth factor is epidermal growth factor.
  • the lipid nanoparticles are loaded with EGF (also referred to hereinafter as EGF-SLN) and / or NLC charged with EGF (also referred to herein as forward as EGF-NLC).
  • EGF also referred to hereinafter as EGF-SLN
  • EGF-NLC EGF-NLC
  • the epidermal growth factor is the recombinant human epidermal growth factor (rhEGF).
  • rhEGF can be obtained commercially (Peprotech, Promega, Pharmchem, etc.) or be produced by recombinant DNA technology, as described for example in Marioka-Fujimoto et al. (Modified enterotoxin signal sequences increase secretion level of the recombinant human epidermal growth factor in Escherichia coli.
  • the lipid nanoparticle of the invention has a proportion of growth factor, in particular EGF comprising between 0.01% and 20% by weight with respect to the total weight of the nanoparticle, preferably between 0.1% and 10% by weight. and most preferably between 0.5% and 5% by weight with respect to the total weight of the lipid nanoparticle.
  • the lipid nanoparticles of the present invention comprise at least one solid lipid at room temperature.
  • solid lipid at room temperature is understood as the lipid that remains solid at a temperature below 45 ° C, which can be saturated or unsaturated.
  • Said definition includes mono-, di-, or triglycerides, fatty acids, spheroids and waxes.
  • derivatives of those fatty acids can be used, the compounds produced being understood as a result of the reaction of the acid group with alcohols or amines such as, for example, the esters or amides of said fatty acids.
  • the solid lipid at room temperature is selected from acylglycerides, saturated fatty acids with a chain of at least 10 carbon atoms or their derivatives or mixtures thereof.
  • the acylglycerides are selected from glyceryl palmitostearate (Precirol® AT05), glyceryl monostearate (lmwitotf®900) and glyceryl behenate (Compritol® 888ATO).
  • the lipid component is glyceryl palmostearate (Precirol® AT05).
  • the lipid nanoparticle of the invention has a proportion of solid lipid comprising between 1% and 40% by weight with respect to the total weight of the lipid nanoparticle, preferably between 5% and 15%.
  • the lipid nanoparticles of the invention also comprise a non-ionic surfactant.
  • non-ionic surfactant is understood as the compound that has a hydrophobic part and a hydrophilic part that allows it to produce an emulsion.
  • the nonionic surfactant is selected from polysorbates, polyethylene glycol copolymers, and polypropylene glycol copolymers, and mixtures thereof.
  • the non-ionic surfactant is selected from the group comprising Tween, Span, Poloxamer and mixtures thereof.
  • the nonionic surfactant is Tween 80, and in another preferred embodiment, the ionic surfactant is a mixture of Tween 80 and Poloxamer.
  • the proportion of non-ionic surfactant is between 0.01% and 10% by weight with respect to the total weight of the lipid nanoparticle, preferably between 0.05% and 5%.
  • the lipid nanoparticle of the invention comprises between 1% and 40% of a solid lipid at room temperature, between 0.01% and 10% of non-ionic surfactant, and between 0.01% and 20% of factor of growth, all percentages given by weight with respect to the total weight of the lipid nanoparticle.
  • the lipid nanoparticle of the invention may optionally be presented as a lyophilized or dried product.
  • the present invention relates to the lipid nanoparticles of the first aspect also comprising a liquid lipid at room temperature.
  • liquid lipid at room temperature is understood as that lipid that is kept liquid at room temperature or below 45 ° C, being able to be saturated or unsaturated.
  • the liquid lipid at room temperature is selected from esters of saturated or unsaturated fatty acids, oils, fatty acids and triglycerides having a chain with less than 10 carbon atoms, and mixtures thereof (for example triglyceride of caprylic acid and of capric acid ( Miglyol®), soybean oil, isopropyl myristate, castor oil).
  • Miglyol® is used as liquid lipid
  • the lipid component of the lipid nanoparticles is a combination of glyceryl palmostearate (Precirol® AT05) and a triglyceride of caprylic acid and capric acid (Miglyol®).
  • liquid lipid at room temperature when incorporated into the nanoparticle, it is in a proportion between 1% and 30% by weight with respect to the total weight of the lipid nanoparticle, preferably between 5% and 15%.
  • the ratio of solid lipid: liquid lipid is between 0.5: 10 and 5: 10.
  • the present invention relates to a method (method 1 of the invention) for the preparation of lipid nanoparticles of the first aspect of the invention defined in previous paragraphs, characterized by comprising the following steps:
  • the nanoparticles obtained with this method 1 are SLN.
  • the first step (i) consists in dissolving the non-ionic surfactant in an aqueous solution, preferably water.
  • the second step (ii) of preparing the lipophilic solution is carried out by dissolving the solid lipid at room temperature in an organic solvent, where the proportion of solid lipid is at least 1% of the weight with respect to the total weight of the organic solvent.
  • the growth factor preferably EGF, and more preferably rhEGF, dissolves together with the lipid in the organic solvent.
  • the choice of organic solvent depends largely on the lipid component.
  • the organic solvent is selected from dichloromethane, acetone, chloroform, and mixtures thereof, and more preferably dichloromethane.
  • the aqueous solution (i) is added over the lipophilic solution (ii).
  • the resulting mixture is sonicated until an emulsion is obtained.
  • the organic solvent is evaporated by any method known to the person skilled in the art.
  • the evaporation step of the organic solvent is performed by keeping the emulsion under mechanical stirring for at least 60 minutes, preferably at least 120 minutes.
  • the lipophilic solution solidifies, and the nanoparticle suspension is obtained, which is filtered by centrifugation. Finally, the collected lipid nanoparticles are washed and resuspended in purified water.
  • the present invention relates to a method (method 2 of the invention) for the preparation of lipid nanoparticles of the second aspect of the invention defined in previous paragraphs, characterized by comprising the following steps:
  • the nanoparticles obtained with this method 2 are NLC.
  • the first step (i) consists in dissolving the non-ionic surfactant in an aqueous solution, preferably water.
  • the second step (ii) of preparing the lipophilic solution is carried out by melting a mixture of a solid lipid and a liquid lipid at a temperature higher than the melting point of the liquid lipid.
  • the growth factor preferably EGF, and more preferably rhEGF, dissolves together with the mixture of lipids.
  • the aqueous solution (i) is heated to the temperature at which the lipid mixture has melted, the aqueous solution (i) is added to the lipophilic solution (ii). The resulting mixture is sonicated until an emulsion is obtained. Then, the emulsion (iv) is cooled to a temperature of 5 ° C ⁇ 3 ° C to allow lipid recrystallization and nanoparticle formation. After recrystallization of the lipids, a suspension of nanoparticles is obtained, which is subsequently filtered by centrifugation. Finally, the collected lipid nanoparticles are washed and resuspended in purified water.
  • a fifth aspect refers to the lipid nanoparticles obtained by method 1 and the lipid nanoparticles obtained by method 2.
  • the lipid nanoparticles of the first, second and fifth aspects of the present invention are characterized by having an equal or smaller average particle size. at 1 ⁇ , preferably having an average size between 1 nm and 100 nm, and more preferably between 150 nm and 400 nm.
  • the average size can be measured by standard methods known to those skilled in the art, and which are described, for example, in the experimental part below (Table 1, Example 2).
  • lipid nanoparticles can have a surface charge (measured by the Z potential), the magnitude can vary between -50 mV and +80 mV (Table 1, Example 2).
  • lipid nanoparticles have an encapsulation efficiency greater than 40%, in particular greater than 70% for SLNs and greater than 95% for NLCs (Table 1, Example 2).
  • lipid nanoparticles of the present invention release the charged growth factor in a sustained manner.
  • Lipid nanoparticles loaded with growth factor have a release profile characterized by an initial release (bursf release) associated with the percentage of the protein associated to the surface, followed by a rapid release phase from 4 hours to 24 hours and finally , a slower phase of 24 hours to 72 hours is described until the total amount of EGF is released (Table 3, Example 2).
  • This characteristic of sustained release provides an important advantage, since it allows safer treatments compared to those that use free EGF, which require continuous administrations of growth factor and higher doses to achieve the same therapeutic effects.
  • reducing the dose can reduce unwanted adverse effects as it is not necessary to administer high doses of growth factor, since the encapsulated growth factor is released over time, in small but more effective doses.
  • sustained release of growth factor allows reducing the number of administrations, increasing adherence to treatment by the patient and, consequently, the patient's quality of life.
  • the inventors found that the lipid nanoparticles of the present invention, that is to say lipid nanoparticles loaded with EGF, show an unexpected in vitro proliferation rate of fibroblasts greater than that of free EGF (Example 3, section 3.1, Figure 1).
  • the lipid nanoparticles of the invention ie EGF-SLN and EGF-NLC, are capable of entering the interior of the cell (Example 3, section 3.2, Figure 2).
  • lipids as a matrix for a nanoparticle is advantageous over the use of common biodegradable and hydrolytically degradable polymers, such as PLGA, since lipid nanoparticles allow administration topical of the molecule loaded in the lipid nanoparticles.
  • wound closure measurement but also in terms of healing quality based on the new microvasculature formed, fibroblast migration, collagen deposition and evolution of the inflammatory response.
  • these results are very relevant because in animals treated with 20 ⁇ g of rhEGF-NLC administered topically it improves healing significantly compared to those treated with 75 ⁇ g of free rhEGF administered intralesionally.
  • EGF-SLN and EGF-NLC show improved skin penetration capacity compared to paraffin cream (Example 3, section 3.4, Figure 5). This is an important advantage since it allows topical administration of the charged molecule in the lipid nanoparticles.
  • a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticle of the invention defined in the first, second and fifth aspects of the invention, as described in any of the preceding paragraphs, and a vehicle. pharmacist.
  • the pharmaceutical composition is administered topically. It can be administered as a gel, cream, ointment, dressing or as a patch.
  • the pharmaceutical composition also comprises collagen, hyaluronic acid, aloe vera, fibrin, carbopol® polymers and cellulose derivatives.
  • a seventh aspect of the present invention it refers to a lipid nanoparticle defined in the first, second and fifth aspects of the invention as described in any of the preceding paragraphs for use as a medicine.
  • the invention relates to the pharmaceutical composition defined in the sixth aspect for use as a medicament.
  • ninth aspect of the invention refers to the lipid nanoparticle defined in the first, second and fifth aspects of the invention described in any of the preceding paragraphs, for its use in promoting healing in a subject.
  • it refers to SLN loaded with EGF, for use in promoting healing in a subject, and NLC loaded with EGF, for use in promoting healing in a subject.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition defined in the sixth aspect of the invention for use in promoting healing of a subject.
  • subject used herein refers to any vertebrate animal, preferably mammal and more preferably a human.
  • wound refers to chronic wounds, wounds of difficult healing, ischemic wounds and burns.
  • the wound is selected from the group comprising chronic wounds, ischemic wounds, burns and combinations thereof.
  • chronic wounds are selected from the group comprising diabetic foot ulcers, pressure ulcers, vascular ulcers and combinations thereof.
  • chronic wounds are defined as those wounds that fail to advance through an orderly and adequate repair process to restore anatomical and functional integrity for a period exceeding three months. All types of wounds have the potential to become chronic and, as such, chronic wounds are traditionally divided by their etiology into three categories: pressure ulcers, diabetic ulcers and vascular ulcers (venous and arterial ulcers).
  • a pressure ulcer is defined as a lesion located in the skin and / or underlying tissue, usually on a bony prominence, as a result of a pressure or shear and / or combination of both.
  • Diabetic foot ulcers are one of the most feared complications of diabetes, due to the serious consequences they have on the quality of life of the patient, and that appear as a result of several factors such as mechanical changes in the conformation of the bone architecture of the foot, peripheral neuropathy (damaged nerves) and peripheral vascular disease (artery blockage), all of which occur with greater frequency and intensity in The diabetic population.
  • Vascular ulcers are usually located in the lower extremities.
  • vascular ulcers are chronic and recurrent. They cause considerable morbidity among patients with peripheral vascular disease.
  • Arterial or ischemic wounds are caused by poor perfusion to the lower extremities. Ischemia limits the supply of nutrients and oxygen, killing tissues and causing the formation of an open wound in the area. The reduced blood flow to the wound site severely hinders the healing response, causing a chronic wound that can end up in gangrene, and thus, in amputation.
  • wounds of difficult healing are characterized by chronic persistence of inflammatory cells, disorder in the synthesis and remodeling of the extracellular matrix, and the lack of re-epithelialization; and burns are skin lesions caused by the effects of heat, fire, radiation, solar radiation, electricity or chemicals.
  • the LL37 peptide corresponds to the C-terminal fragment of the human cathelicin antimicrobial protein, hCAP18, which is a component of the innate immune system and has a broad spectrum of antimicrobial activity (Heilborn et al., 2003, The cathelicidin anti-microbial peptide LL -37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol; 120: 379-389).
  • a thirteenth aspect of the present invention relates to a composition (composition of the invention) comprising lipid nanoparticles according to the first, second and fifth aspects of the present invention and lipid nanoparticles comprising at least one solid lipid at room temperature, at least one non-ionic surfactant and the LL37 peptide.
  • the composition comprises NLC loaded with EGF and NLC loaded with LL37.
  • the composition comprises SLNs loaded with EGF and SLNs loaded. with LL37.
  • the ratio of lipid nanoparticles loaded with growth factor, preferably loaded with EGF, and lipid nanoparticles loaded with LL37 is between 1: 17 and 1: 34.
  • the composition comprises 15 ng / ml of lipid nanoparticles loaded with EGF and 0.25 to 5 ⁇ g / ml lipid nanoparticles loaded with LL37.
  • a twelfth aspect of the invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the composition according to the eleventh aspect of the invention as described in the last paragraph and a pharmaceutical vehicle.
  • the pharmaceutical composition is administered topically.
  • the pharmaceutical composition also comprises collagen, hyaluronic acid, aloe vera, fibrin, carbopol® polymer and cellulose derivatives.
  • a thirteenth aspect of the present invention relates to the pharmaceutical composition of the twelfth aspect, for use as a medicament.
  • a fourteenth aspect of the present invention refers to the pharmaceutical composition defined in the twelfth aspect, for use to promote healing in a subject.
  • a fifteenth aspect of the present invention relates to a lipid nanoparticle comprising at least one solid lipid at room temperature, at least one non-ionic surfactant and the LL37 peptide.
  • the particular embodiments described in the first aspect of the present invention are applicable to the lipid nanoparticles loaded with LL37 of the fifteenth aspect, substituting the growth factor or the EGF for the LL37 peptide.
  • a sixteenth aspect of the present invention relates to the lipid nanoparticle of the fifteenth aspect of the present invention which further comprises a liquid lipid at room temperature.
  • the particular embodiments described in the second aspect of the present invention are applicable to lipid nanoparticles loaded with LL37 of the sixteenth aspect, substituting the growth factor or EGF for the LL37 peptide.
  • a seventeenth aspect of the present invention relates to a method (method 3 hereafter) for the preparation of lipid nanoparticles according to the fifteenth aspect of the present invention, characterized by the same steps as the method 1 described in the third aspect of the present invention, but where the LL37 peptide is added to the lipophilic solution (ii), instead of the growth factor.
  • the particular embodiments described for method 1 described in the third aspect of the present invention are applicable to method 3, substituting the growth factor or EGF for the LL37 peptide.
  • An eighteenth aspect of the present invention relates to a method (method 3
  • lipid nanoparticles according to the sixteenth aspect of the present invention, characterized by the same steps as the method 2 described in the fourth aspect of the present invention, but where the LL37 peptide is added to the lipophilic solution (ii), instead of the growth factor.
  • a nineteenth aspect of the present invention relates to lipophilic nanoparticles obtainable by method 3 and to lipophilic nanoparticles obtainable by method 4, described in seventeenth and eighteenth aspects, respectively.
  • this peptide can be synthesized using an automatic peptide synthesizer and by standard peptide synthesis methods. In addition, it can be obtained commercially, for example from Sigma-Aldrich.
  • LL37 has the amino acid sequence SEQ ID NO 1
  • lipid nanoparticles loaded with LL37 of the present invention release the charged LL37 in a sustained manner.
  • the lipid nanoparticles loaded with LL37 have a release profile characterized by an initial release (bursf release) associated with the percentage of the peptide associated with the surface, followed by a rapid release phase from 4 hours to 24 hours and finally, described a slower phase of 24 hours to 72 hours until the total amount of EGF is released (Table 4, Example 2).
  • the inventors found that lipid nanoparticles loaded with LL37 show an unexpected greater proliferation of fibroblasts in vitro than free LL37 (Example 3, section 3.3, Figure 6).
  • a twentieth aspect of the present invention relates to the lipid nanoparticles loaded with LL37 of the fifteenth, sixteenth and nineteenth aspects of the present invention, for use as a medicament.
  • a twenty-first aspect of the present invention relates to the lipid nanoparticles loaded with LL37 of the fifteenth, sixteenth and nineteenth aspects of the present invention, for use to promote wound healing.
  • a twenty-second aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the lipid nanoparticles loaded with LL37 of the fifteenth, sixteenth and nineteenth aspects of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition is administered topically.
  • the pharmaceutical composition also comprises collagen, hyaluronic acid, aloe vera, fibrin, carbopol® polymer and cellulose derivatives.
  • the present invention also relates, in a twenty-third aspect, to the pharmaceutical composition of the twenty-second aspect, for use as a medicament.
  • a twenty-fourth aspect of the present invention relates to pharmaceutical composition of the twenty-second aspect, for use to promote wound healing.
  • a twenty-fifth aspect of the present invention refers to a kit comprising any one of the nanoparticles described in the first, second, fifth, fifteenth, sixteenth and nineteenth aspects of the invention, or mixtures thereof. It also refers to a kit comprising a pharmaceutical composition according to any one of the pharmaceutical compositions described in the sixth, twelfth and twenty-second aspects of the invention.
  • SLN and NLC were prepared using the emulsification-ultrasonication-based method (Muller et a / 2002; Che et al. 2010 (Effects of lipophilic emulsifiers on the oral administration of lovastatin from nanostructured lipid carriers: Physicochemical characterization and pharmacokinetics. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74, 474-482)).
  • SLNs were then collected by centrifugation at 2500 rpm for 10 minutes using a 100 kDa pore size centrifugal filter (Amicon ® Ultra, Millipore, Spain), and washed three times with milliQ water. Finally, trehalose was added as a cryoprotectant in a 15% aqueous solution with respect to Precirol ® ATO 5.
  • SLNs loaded with LL37 and NLCs loaded with LL37 were prepared as described for SLNs loaded with rhEGF and NLC loaded with rhEGF, respectively, but using synthetic LL37 (Sigma-Aldrich 94261) or recombinant, instead of rhEGF.
  • the average size (z-media) and the polydispersion index (Pl) were measured by photonic correlation spectroscopy. Each test was performed in triplicate before and after the nanoparticles were lyophilized.
  • the zeta potential ( ⁇ ) was determined by Doppler velocimetry (LDV). All measurements described above were evaluated using the Malvern® Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). The appearance of the surface and its morphology was determined by scanning electron microscopy (SEM;
  • Jeol® JSM-35 CF Jeol® JSM-35 CF
  • TEM transmission electron microscopy
  • EE encapsulation efficiency
  • the amount of free rhEGF and free LL37 was estimated using a commercial sandwich immunoenzymatic assay kit for human EGF (human EGF ELISA development kit, Peprotech) and for human LL-37 (human LL-37 ELISA development kit, Hycult biotech), following the instructions of the supplier.
  • the release study was carried out by incubating for 3 days, 32 mg and 23 mg of SLN or NLC (corresponding to -200 ⁇ g of rhEGF or LL37) in 2 ml of 0.02 M phosphate buffered saline (PBS). At the selected intervals, the release medium was removed by filtration / centrifugation and replaced by the same amount of PBS. The amount of rhEGF and LL37 was analyzed by ELISA using the protocol described in section 2.2.
  • a 24-well plate was used for the proliferation study. 35,000 Balb / C 3T3 fibroblasts resuspended in 1 ml of complete culture medium (DMEM supplemented with 10% FCS) were grown in each well. After 8 hours of incubation, the medium was replaced with 1 ml of DMEM supplemented with 0.2% FCS (fetal calf serum) and the cells were incubated overnight.
  • DMEM complete culture medium
  • FCS fetal calf serum
  • the medium was then replaced by 1 ml of: (i) DMEM supplemented with 0.2% FCS, (ii) 15 ng / ml free rhEGF in DMEM supplemented with 0.2% FCS, (iii) empty SLN in DMEM supplemented with 0.2 % of FCS, (iv) 15 ng / ml of SLN loaded with rhEGF (rhEGF-SLN) in DMEM supplemented with 0.2% of FCS, (v) empty NLC in DMEM supplemented with 0.2% of FCS and (vi) 15 ng / ml of NLC loaded with rhEGF (rhEGF-NLC) in DMEM supplemented with 0.2% FCS.
  • the cells were grown in the same conditions for 24 hours, 48 hours and 72 hours. The experiments were carried out in triplicate. After the different incubation times, 100 ⁇ of CCK-8 (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA) was added to each well (Zhou, Y., Qian, M., Liang, Y., Liu, Y., Yang, X., Jiang, T., Wang, Y., 201 1. Effects of Leukemia Inhibitory Factor on Proliferation and Odontoblastic Differentiation of Human Dental Pulp Cells. J. Endod; 37: 819-824). After 4 hours of incubation, absorbance at 450 nm and 650 nm was measured as reference wavelength. The absorbance was directly proportional to the number of living cells in the medium.
  • FIG. 1 shows a greater proliferation in the rhEFG-treated groups (rhEGF-NLC, rhEGF-SLN and free rhEGF) than in the control groups, after 48 hours and 72 hours.
  • rhEGF encapsulated in lipid nanopoarticles both SLN and NLC
  • 50,000 Balb / C 3T3 fibroblasts and 100,000 HaCaT keratinocytes were cultured separately on coverslips in complete culture medium for 24 hours. The medium was then replaced by 1 ml of study medium.
  • the groups studied were the following: (i) 25 ⁇ g of SLN-NileRed in complete DMEM and (ii) 25 ⁇ g of NLC-NileRed in complete DMEM. After 1 hour of incubation the cells were washed and fixed. Subsequently, the nuclei were stained with DAPI (500 ng / ml) and the coverslips were mounted on the slides for examination in a fluorescence microscope.
  • DAPI 500 ng / ml
  • the skin was maintained for 24 hours at 32 ° C. Then, the skin was washed with PBS, dried and cut into vertical sections (bottom to top) 20 ⁇ thick using a Frigocut 2800 N cryotome, Leica, Bensheim, Germany). The sections were stored at -20 ° C and analyzed after 24 hours, subjecting them to normal and fluorescent light.
  • NileRed and NLC-NileRed increases four times in the stratum corneum (4.74 and 4.62 respectively) and about twice in the epidermis (2.09 and 2.03 respectively). A minor, although still significant increase in penetration was also observed in the dermis (1.29 and 1.32 respectively).
  • ABU and PEE values greater than 1 demonstrate an improvement in the penetration capacity of SLNs and NLCs compared to paraffin cream.
  • the results reflect the ability of these nanoparticles to release Red Nile in the skin and therefore rhEGF and LL37.
  • the experiment was carried out as described in section 3.1.
  • the synergistic effect of LL37 and rhEGF was evaluated in Balb / C fibroblasts and HaCat keratinocytes.
  • a 24-well plate was used for the proliferation study.
  • 35,000 Balb / C 3T3 fibroblasts resuspended in 1 ml of complete culture medium (DMEM supplemented with 10% FCS) were seeded. After 8 hours of incubation, the medium was replaced with 1 ml of DMEM supplemented with 0.2% FCS and the cells were incubated overnight.
  • the medium was replaced by 1 ml of: (i) DMEM supplemented with 0.2% FCS, (ii) 15 ng / ml of free rhEGF, (iii) 5, 0.5 and 0.25 g / ml of LL37, (iv) 15 ng / ml of rhEGF and 5, 0.5 and
  • EXAMPLE 5 In vivo healing with SLN loaded with rhEGF and NLC loaded with rhEGF The in vivo healing efficacy of SLNs loaded with rhEGF and NLC loaded with EGF with two different rhEGF formulations has been evaluated: (i) 75 ⁇ g of lyophilized rhEGF (similar to that commercialized Heberprot ® ) and (ii) 75 ⁇ g and rhEGF 1% encapsulated (w / w) in polymer microspheres (rhEGF-MS 75 ⁇ g) prepared in our laboratory with a combination of alginate and polylactic-co-glycolic acid (PLGA) using the double emulsion method as described in the application European patent EP12382476.
  • PLGA polylactic-co-glycolic acid
  • acetone (3: 1) containing 5% (w / v) of PLGA (Resomer RG503) is emulsified by sonication for 15 seconds at 50 W with 0.2 ml of an aqueous internal phase ( in milliQ water) containing 0.05% (w / v) rhEGF, 2.5% mg (w / v) of Human Serum Albumin (HSA), 0.25% (w / v) of polyethylene glycol 400 (PEG400) and 2.5% (w / v) MVG sodium alginate (Pronova UP, NovaMatrix FMC BioPolymer, Sandvika, Norway).
  • the resulting emulsion (w ⁇ o) is added to 15 ml of an aqueous solution containing 5% polyvinyl alcohol (PVA) and 5% NaCI and emulsified by a paddle shaker for 60 seconds to obtain the double emulsion (W / o / w 2 ). Finally, 400 ml of a 5% NaCl aqueous solution and 0.6 mM calcium chloride are added and mixed for 30 minutes. The microspheres are collected by filtration and lyophilized.
  • db / db mice Eighty 8-week-old male db / db mice were used. Genetically diabetic db / db mice (BKS.Cg-m + / + Lepr db / J) were obtained from Javier Laboratories (Saint Berthevin Cedex). All procedures were carried out according to the protocols approved by the Institutional Committee for the Use and Care of Animals of the University of the Basque Country.
  • the animals were divided into the following 10 groups: (i) untreated control, (ii) 75 ⁇ g of free rhEGF, (iii) empty MS, (iv) empty SLN, (v) empty NLC, (vi) rhEGF-MS 75 ⁇ g, (vii) rhEGF-SLN 10 ⁇ , (viii) rhEGF-SLN 20 ⁇ g (ix) rhEGF-NLC 10 ⁇ g and (x) rhEGF- NLC 20 ⁇ g.
  • the previously resuspended nanoparticles in 20 ⁇ of vehicle (0.9% saline buffer and 0.5% carboxymethyl cellulose) were administered topically twice a week with a micropipette and allowing them to spread throughout the wound bed.
  • the free rhEGF resuspended in 0.5 ml of vehicle was administered twice a week by intralesional administration, introducing the needle into the wound.
  • the wound closure is expressed as a percentage of the area of the original wound.
  • 1 acute inflammation (fibrin and pyogenic membrane clot formation, migration of leukocytes and polynucleated neutrophils), 2: predominance of diffuse acute inflammation (predominance of granulation tissue and pyogenic membrane, vascular neogenesis), 3: predominance of chronic inflammation ( fibroblast proliferation), 4: resolution and scarring (reduction or disappearance of water inflammation although occasionally rounded cells may persist).
  • rhEGF-SLN 20 ⁇ g showed a better resolution (higher than rhEGF-SLN 10 ⁇ g). Histopathological analysis also indicated that diffuse acute inflammatory status prevailed in wounds treated with rhEGF, with an inflammation score of 2.13 ⁇ 0.64 (significantly higher than its control groups). These differences did not reach statistical significance with any of the lipid nanospheres (neither rhEGF-SLN nor rhEGF-NLC).
  • rhEGF-MS 75 2.13 ⁇ 0.64 2.86 ⁇ 0.90 rhEGF-SLN 10 1, 63 ⁇ 1, 51 3.50 ⁇ 0.93 rhEGF-SLN 20 3.67 ⁇ 1, 15 3.38 ⁇ 0.52 rhEGF-NLC 10 1, 88 ⁇ 1, 21 3.13 ⁇ 0.35 rhEGF-NLC 20 ⁇ 2.75 ⁇ 0.46 *, 3.00 ⁇ 0.00
  • the animals were sedated by intramuscular administration of 15 mg / kg of ketamine and 0.2 mg / kg of diazepam. Subsequently, they were induced anesthesia by administering propofol (3 mg / kg), to allow tracheal intubation. Immediately after, the animals were connected to an anesthetic machine through a semi-closed circular circuit attached to a ventilator, providing as a sevofluoran anesthetic agent at a concentration of 2.7% in an oxygen flow of 1 L / minute. As analgesia, remifentanil was given by continuous intravenous infusion at a rate of 0.1 ⁇ g / kg / minute during surgery.
  • Each animal was made 6 ulcers (6 cm x 5 cm) leaving 1.5-2.0 cm minimum between ulcers, after tattooing the edge of the ulcers using a mold to have permanent reference of the initial area of the wounds. Ulcers were created with monopolar diathermy in coagulation mode to obtain ischemic edges, 2 mm deep, leaving the adipose panicle. Postoperative analgesia was administered by transdermal fentanyl patches and systemic antibiotic therapy with amoxicillin / clavulanic acid (20 mg / kg) for one week.
  • Healing kinetics was determined by measuring the wound closure (initial percentage of the wound closed) on days 1, 15, 25, 36 and 43.
  • the area of the wound was determined, in a standardized manner, by taking perpendicular photos on the surface of the wound, using the same lighting and placing a sterile plastic ruler next to the wounds in order to introduce a metric reference in the images that allow further processing.
  • the wound area was calculated using ImageJ software (see section 5.3). The wounds were considered healed when they had a closure greater than 95%. 6.6.- Histological evaluation of healing
  • Plasma samples were collected from animals treated with rhEGF-NLC and free rhEGF to assess the absorption of rhEGF into systemic circulation when rhEGF was expected to be higher in plasma, since the systemic use of rhEGF has been limited due to The worry of abnormal epithelial growth.
  • the days of plasma sampling were selected based on the half-life of the EGF, the route of administration and the delayed release of the growth factor encapsulated in the rhEGF-NLC.
  • the plasma sample was made on day 1 of the experiment, 4 hours and 24 hours after administration. of rhEGF-NLC, rather than 30 minutes after administration, as was carried out in animals treated with free rhEGF. Due to the marked similarities between humans and pigs, similar concentrations of plasma rhEGF were expected.
  • Plasma rhEGF concentration (ng / ml)
  • the improvement in healing was evaluated by calculating the number of wounds closed in each experimental group on days 15, 25, 36 and 43. The greatest differences between the groups were found 25 days after the experiment. As can be seen in Figure 8, at 15 days none of the wounds had completely closed. At 25 days the percentage of closed wounds was significantly higher in the rhEGF-NLC treated group than in the empty NLC treated group. In addition, it is important to note that rhEGF-NLC treatment showed a slightly greater effectiveness compared to free rhEGF (50% and 40% respectively).
  • wounds treated with rhEGF-NLC received 2 weekly topical administrations of 20 ⁇ g of rhEGF, while those wounds treated with free rhEGF received higher doses ( 75 ⁇ g twice a week) administered intralesionally.
  • wounds treated with rhEGF both with rhEGF-NLC and free rhEGF were completely closed and wounds treated with empty NLC reached a healing rate of 90%.
  • all wounds had completely closed.

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Abstract

La invención se refiere a nanopartículas lipídicas que comprenden un factor de crecimiento y/o un lípido antimicrobiano y a su método de preparación. Asimismo, se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas nanopartículas lipídicas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por último, se refiere a dicha composición farmacéutica para su uso como medicamento y para su uso para promover la cicatrización de heridas, en particular mediante administración tópica.

Description

NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS PARA LA CICATRIZACIÓN DE HERIDAS
D E S C R I P C I O N CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a nanopartículas lipídicas y su uso como composiciones farmacéuticas para la cicatrización de heridas, en particular como suspensión de nanopartículas, apositos o geles para aplicación tópica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El tratamiento de heridas crónicas se ha convertido en un grave problema para los sistemas de salud de todo el mundo, representando un gran desafío económico y de salud pública. El aumento actual de factores de riesgo tales como el envejecimiento de la población, el tabaco, la diabetes y la obesidad pueden complicar y retrasar el proceso de cicatrización, provocando heridas de difícil cicatrización.
Varios tratamientos paliativos incluyendo el oxígeno hiperbárico, la presión negativa y el debridamiento quirúrgico se utilizan en la actualidad para el tratamiento de heridas crónicas en personas mayores. Además, un amplio rango de apositos comerciales sintéticos está disponible en el mercado para el tratamiento de heridas crónicas, aunque mostrando una eficacia cicatrizante limitada.
El factor de crecimiento epidérmico (EGF, del inglés Epidermal Growth Factor) juega un papel importante en la regeneración y reparación tisular estimulando la migración, diferenciación y proliferación celular, así como promoviendo la formación de tejido de granulación. Desde un punto de vista clínico, el EGF se ha utilizado para mejorar la cicatrización, especialmente en las úlceras de pie diabético. En ensayos clínicos se han mostrado evidencias de los efectos beneficiosos de la aplicación tópica de EGF en ulceras de bajo grado neuropáticas; sin embargo, el efecto de la formulación tópica de EGF puede verse disminuida, especialmente en heridas de alto grado, debido a que se ha identificado un aumento de la actividad de las proteasas en este tipo de heridas. Rengen-D 150™ es un gel que contiene 150 μg/g de Factor de Crecimiento Epidérmico humano recombinante (rhEGF, del inglés recombinant human Epidermal Growth Factor), que se fabrica en India para el tratamiento de ulceras diabéticas de grado I y II. Requiere una administración de dos veces al día, por un periodo de tratamiento medio de 6 semanas. Heberprot®, una formulación liofilizada que contiene 75 de rhEGF, se administra tres veces por semana mediante inyección intralesional. Se comercializa en Argelia, Argentina, Colombia, Cuba, República Dominicana y Venezuela. Un estudio piloto llevado a cabo en 20 pacientes diabéticos demostró que Heberprot® es un tratamiento factible y seguro para promover la cicatrización en heridas crónicas de pacientes con úlceras de grosor total. Sin embargo, la corta vida media del rhEGF requiere de una exposición continua (de al menos 6-12 horas) para aumentar su efecto mitogénico en las células epiteliales. Por ello, para lograr un efecto terapéutico cicatrizante significativo, es necesario optimizar la administración de los factores de crecimiento, como el rhEGF, en cuanto a dosis, sistema de liberación y seguridad. A ese efecto Chu et al. 2010 (Nanotechnology promotes the full-thickness diabetic wound healing effect of recombinant human epidermal growth factor in diabetic rats", Wound Repair Regen 2010; 15:499-505) desarrollaron un método para preparar nanopartículas del polímero de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) con un contenido en rhEGF del 2%. La eficacia de encapsulacion de rhEGF fue de 85.6% y presentó una liberación controlada de rhEGF biológicamente activo durante 24 horas. La aplicación tópica una vez al día de estas nanopartículas en heridas de grosor total inducidas en ratas diabéticas promovió niveles de proliferación en fibroblastos y tasas de cicatrización más altas en comparación con rhEGF no encapsulado.
Asimismo, la patente EP 1 987 817 B1 reivindica el proceso de producción de microesferas poliméricas que contienen rhEGF para la administración intralesional en las extremidades inferiores de pacientes diabéticos para prevenir la amputación de extremidades inferiores. Las microesferas desarrolladas con un contenido en rhEGF de 1.6-2.4% mostraron una liberación controlada de rhEGF de 5 a 10 μg al día durante 14 días y una mejor capacidad de cicatrización de la lesión en humanos comparados con cantidades equivalentes de rhEGF no encapsulado.
Sorprendentemente, los inventores han desarrollado nanopartículas lipídicas que comprenden el factor de crecimiento epidérmico con altas eficacias de encapsulacion, que aplicadas en una formulación tópica aplicadas dos veces por semana mejora la cicatrización. BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo a un aspecto, la invención se refiere a una nanopartícula lipídica (nanopartícula lipídica de la invención) que comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico, y un factor de crecimiento.
De acuerdo a otro aspecto, la invención se refiere a un método para la preparación de nanopartícula lipídica de la invención caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
(i) preparación de una solución acuosa que comprende un surfactante no iónico,
(ii) preparación de una solución lipofílica que comprende un lípido sólido a temperatura ambiente en un solvente orgánico,
(iii) añadir la solución acuosa (i) a la solución lipofílica (ii), sometiendo la mezcla resultante a sonicación hasta obtener una emulsión,
(iv) evaporar el solvente orgánico de la emulsión obtenida en (iii), y
(v) recoger las nanopartículas lipídicas,
donde el factor de crecimiento se añade a la solución (ii)
De acuerdo a otro aspecto, la aplicación se refiere a una composición farmacéutica (composición farmacéutica de la invención) que comprende la nanopartícula lipídica de la invención y un vehículo farmacéutico.
De acuerdo a otro aspecto, la aplicación se refiere a la nanopartícula lipídica de la invención y a la composición farmacéutica que la comprende, para su uso como medicamento, y para su uso en promover la cicatrización de heridas.
Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente aplicación serán evidentes para aquellos expertos en la materia de la siguiente descripción y reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 muestra la representación gráfica del efecto in vitro de las nanopartículas lipídicas cargadas con rhEGF en la proliferación celular.
Figura 2 muestra las fotografías de la captación celular de las formulaciones SLN- NileRed y NLC-NileRed.
Figura 3 muestra la representación gráfica del efecto in vivo de (A) las SLN cargadas con rhEGF y (B) las NLC cargadas con rhEGF en el cierre de la herida y (C) fotografías de las heridas en ratas control no tratadas y en ratas tratadas con SLN blancas, NLC blancas, rhEGF-MS, control MS vacías, rhEGF libre, rhEGF-SLN
20 pg, rhEGF-SLN 10pg, rhEGF-NLC 20 μg, rhEGF-NLC 10pg. Datos mostrados como medias ± desviación estándar. *Significativamente mayor que el control no tratado (*p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001); ■ Significativamente mayor que el control MS vacías ("p<0.05, "pO.01 y ""p<0.001); ' Significativamente mayor que SLN blancas ('p<0.05, "pO.01 y '"ρ<0.001); v Significativamente mayor que NLC blancas (vp<0.05, v vp<0.01 y v v vp<0.001); ° Significativamente mayor que rhEGF libre (°p<0.05, oop<0.01 y ooop<0.001); * Significativamente mayor que rhEGF-MS 75μg (°p<0.05, 0 0p<0.01 y 0 0 0p<0.001); A Significativamente mayor que rhEGF-SLN 10 pg (Ap<0.05, A Ap<0.01 y A A Ap<0.001).
Figura 4 muestra la representación gráfica del efecto in vitro de las nanopartículas lipídicas cargadas con rhEGF en la valoración de la inflamación (A, C) y en la puntuación de re-epitelización (B, D). Datos mostrados como medias ± desviación estándar. * Significativamente mayor que el control no tratado (*p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001); ' Significativamente mayor que el control MS vacías ("p<0.05, "p<0.01 y '"pO.001); ' Significativamente mayor que SLN blancas (*p<0.05, "p<0.01 y •••p<0.001); v Significativamente mayor que NLC blancas (vp<0.05, v vp<0.01 y v v vp<0.001); ° Significativamente mayor que rhEGF libre (°p<0.05, oop<0.01 y ooop<0.001); * Significativamente mayor que rhEGF-MS 75 pg (°p<0.05, 00p<0.01 y * ° °p<0.001); A Significativamente mayor que rhEGF-SLN 10 μg (Ap<0.05, A Ap<0.01 y A A Ap<0.001).
Figura 5 muestra micrografías (A) y una representación gráfica (B) de la captación cutánea de SLN-NileRed y NLC-NileRed y parafina-NileRed (valores arbitrarios del brillo de los píxeles (ABU) corregidos del fondo fluorescente en el estrato córneo, epidermis y dermis). * Significativamente mayor que parafina-NileRed (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001). Los números añadidos aportan el respectivo aumento de la penetración sobre la crema de parafina (PEE).
Figura 6 muestra la representación gráfica del efecto in vitro de las nanopartículas lipídicas cargadas con LL-37 en la proliferación celular.
Figura 7 muestra la representación gráfica del efecto in vitro de la combinación del rhEGF y el LL-37 en la proliferación celular.
Figura 8 muestra (A) la representación gráfica del efecto in vivo de NLC vacías, rhEGF libre y rhEGF-NLC 20 μg en el cierre de heridas en cerdos a los 15, 25, 36 y 43 días y (B) fotografías de las heridas de los cerdos tratados con NLC vacías, rhEGF libre y rhEGF-NLC 20 ig.
Figura 9 muestra (A) la representación gráfica de la longitud epitelial en los diferentes grupos estudiados (NLC vacías, rhEGF libre y rhEGF-NLC 20 μg) a los 15, 25 y 43 días y (B) imágenes histológicas de las heridas a los 15, 25 y 43 días. Datos mostrados como medias ± desviación estándar (D.E). *** Significativamente mayor que NLC vacías y rhEGF libre (p<0.001).
Figura 10 muestra la representación gráfica de la extensión (mm) de la cicatrización a los 15 días (A), a los 25 días (B) y a los 43 días (C). Los resultados se muestran como media ± D.E. ***p<0.001 comparado con los grupos de NLC vacías y rhEGF libre.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El primer aspecto de la presente invención se refiere a una nanopartícula lipídica caracterizada por que comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico, y un factor de crecimiento.
Cabe destacar que, como se utiliza en la siguiente aplicación, las formas singulares "el", "la", "un" y "una" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En el contexto de la presente invención, nanopartículas lipídicas se refieren a partículas en el rango nanométrico que poseen una matriz sólida. La matriz se compone por lípidos que son sólidos a temperatura ambiente, pero también a la temperatura corporal. En el caso de nanopartículas sólidas lipídicas (SLN, del inglés solid lipid nanoparticles) la matriz consiste solo de un lípido sólido. En el caso de los transportadores lípidos nanoestructurados (NLC, del inglés nanostructured lipid carriers) la matriz consiste en una mezcla de lípidos sólidos con lípidos líquidos (aceites), pero siendo esta mezcla sólida a temperatura ambiente y también a la temperatura corporal (Muller et al. 2002, Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatológica! preparations.
Advanced Drug Delivery Reviews 54 (1): S131-S155). El término "cargado con factor de crecimiento" se refiere al factor de crecimiento embebido o encapsulado en la matriz de la nanopartícula. Así, en una realización particular, las nanopartículas lipídicas son SLN y en otra realización particular, las nanopartículas lipídicas son NLC. Así, en una realización particular, las nanopartículas lipídicas son
SLN o NLC.
En una realización particular, el factor de crecimiento se selecciona de un grupo que consiste en un factor de crecimiento que pertenece a la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), familia del factor de crecimiento transformante beta
(TGF-beta, del inglés transforming growth factor beta), familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, del inglés fibroblast growth factor), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, del inglés vascular endothelial growth factor), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF, del inglés granulocyte macrophage colony stimulating factor), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, del inglés platelet-derived growth factor), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF, del inglés connective tissue growth factor), familia del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, del inglés tumor necrosis factor- alpha), familia del factor de crecimiento similares a la insulina (IGF, del inglés insulin-like growth factor). Preferentemente, el factor de crecimiento pertenece a la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), y más preferiblemente el factor de crecimiento es el factor de crecimiento epidérmico. En una realización particular, las nanopartículas lipídicas están cargadas con EGF (también referidas de aquí en adelante como EGF-SLN) y/o NLC cargadas con EGF (también referidas de aquí en adelante como EGF-NLC). En una realización particular de la invención, el factor de crecimiento epidérmico es el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (rhEGF, del inglés recombinant human epidermal growth factor). Dicho rhEGF puede obtenerse comercialmente (Peprotech, Promega, Pharmchem, etc.) o ser producido mediante tecnología de ADN recombinante, como se describe por ejemplo en Marioka-Fujimoto et al. (Modified enterotoxin signal sequences increase secretion level of the recombinant human epidermal growth factor in Escherichia coli. J Biol Chem. 1991 Jan 25; 266(3): 1728-32), o en la solicitud de patente WO 91/18999 A1. En una realización particular, la nanopartícula lipídica de la invención tiene una proporción de factor de crecimiento, en particular EGF que comprende entre 0.01 % y 20% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula, preferentemente entre 0.1 % y 10% en peso y muy preferentemente entre 0.5% y 5% en peso con respecto al peso total de la nanopartícula lipídica. Como se ha mencionado anteriormente, las nanopartículas lipídicas de la presente invención comprenden al menos un lípido sólido a temperatura ambiente. En el contexto de la presente invención, se entiende "lípido sólido a temperatura ambiente" como el lípido que se mantiene sólido a una temperatura inferior a 45°C, pudiendo ser saturado o insaturado. Dicha definición incluye mono-, di-, o triglicéridos, ácidos grasos, esferoides y ceras. Asimismo, se pueden usar derivados de esos ácidos grasos, entendiéndose como los compuestos producidos como resultado de la reacción del grupo ácido con alcoholes o aminas tales como, por ejemplo, los esteres o amidas de dichos ácidos grasos. Así, en una realización particular, el lípido sólido a temperatura ambiente se selecciona de los acilgliceridos, ácidos grasos saturados con una cadena de al menos 10 átomos de carbono o sus derivados o sus mezclas. En una realización preferente los acilgliceridos se seleccionan de gliceril palmitoestearato (Precirol® AT05), gliceril monoestearato (lmwitotf®900) y gliceril behenato (Compritol® 888ATO). En una realización más preferente, el componente lipídico es gliceril palmitoestearato (Precirol® AT05).
En una realización particular de la invención, la nanopartícula lipídica de la invención tiene una proporción de lípido sólido que comprende entre 1 % y 40% de peso respecto al peso total de la nanopartícula lipídica, preferiblemente entre 5% y 15%. Como se ha mencionado anteriormente, las nanopartículas lipídicas de la invención también comprenden un surfactante no iónico. El término "surfactante no iónico" se entiende como el compuesto que tiene una parte hidrofóbica y una parte hidrofílica que le permite producir una emulsión. En una realización particular de la presente invención el surfactante no iónico es seleccionado de los polisorbatos, copolímeros de polietilenglicol, y copolímeros de polipropilenglicol, y sus mezclas. En una realización particular, el surfactante no iónico es seleccionado del grupo que comprende Tween, Span, Poloxamer y sus mezclas. En una realización preferente, el surfactante no iónico es Tween 80, y en otra realización preferente, el surfactante iónico es una mezcla de Tween 80 y Poloxamer.
En una realización particular de la invención, la proporción de surfactante no iónico está comprendido entre 0.01 % y 10% de peso con respecto al peso total de la nanopartícula lipídica, preferiblemente entre 0.05% y 5%.
En una realización particular de la invención, la nanopartícula lipídica de la invención comprende entre 1 % y 40% de un lípido sólido a temperatura ambiente, entre 0.01 % y 10% de surfactante no iónico, y entre 0.01 % y 20% de factor de crecimiento, todos los porcentajes dados en peso respecto al peso total de la nanopartícula lipídica.
En una realización particular la nanopartícula lipídica de la invención puede opcionalmente presentarse como producto liofilizado o desecado. En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a las nanopartículas lipídicas del primer aspecto comprendiendo también un lípido líquido a temperatura ambiente. En el contexto de la presente invención, "lípido líquido a temperatura ambiente" se entiende como aquel lípido que se mantiene líquido a temperatura ambiente o por debajo de los 45°C, pudiendo ser saturado o insaturado. El lípido líquido a temperatura ambiente se selecciona de esteres de ácidos grasos saturados o insaturados, aceites, ácidos grasos y triglicéridos que tengan una cadena con menos de 10 átomos de carbono, y sus mezclas (por ejemplo triglicérido de ácido caprílico y de ácido cáprico (Miglyol®), aceite de soja, miristato de isopropil, aceite de ricino). En una realización preferente, Miglyol® se usa como lípido líquido. En una realización preferente, el componente lipídico de las nanopartículas lipídicas es una combinación de gliceril palmitoestearato (Precirol® AT05) y un triglicérido de ácido caprílico y de ácido cáprico (Miglyol®). En otra variante de este segundo aspecto de la invención, cuando el lípido líquido a temperatura ambiente se incorpora en la nanopartícula, es en una proporción que comprende entre el 1 % y el 30% de peso respecto al peso total de la nanopartícula lipídica, preferiblemente entre 5% y 15%. En otra realización, la proporción lípido sólido:lípido líquido es entre 0.5:10 y 5: 10.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un método (método 1 de la invención) para la preparación de nanopartículas lipídicas del primer aspecto de la invención definida en párrafos anteriores, caracterizado por comprender las siguientes etapas:
(i) preparación de una solución acuosa que comprende un surfactante no iónico,
(ii) preparación de una solución lipofílica que comprende un lípido sólido a temperatura ambiente en un solvente orgánico,
(iii) añadir la fase acuosa (i) a la solución lipofílica (ii), sometiendo la mezcla resultante a sonicación hasta obtener una emulsión,
(iv) evaporar el solvente orgánico de la emulsión obtenida en (iii), y
(v) recoger las nanopartículas,
donde el factor de crecimiento se añade a la solución (ii).
Las nanopartículas obtenidas con este método 1 son SLN. La primera etapa (i) consiste en disolver el surfactante no iónico en una solución acuosa, preferiblemente agua. La segunda etapa (ii) de preparación de la solución lipófilica se lleva a cabo mediante la disolución del lípido sólido a temperatura ambiente en un solvente orgánico, donde la proporción de lípido sólido es de al menos el 1 % del peso con respecto al peso total del solvente orgánico. El factor de crecimiento, preferiblemente EGF, y más preferiblemente rhEGF, se disuelve junto con el lípido en el solvente orgánico. La elección del solvente orgánico depende en gran medida del componente lipídico. En una realización particular de la invención, el solvente orgánico se selecciona de diclorometano, acetona, cloroformo, y sus mezclas, y más preferiblemente diclorometano. Una vez se han preparado ambas soluciones, la solución acuosa (i) se añade sobre la solución lipofílica (ii). La mezcla resultante se somete a sonicación hasta obtener una emulsión. A continuación, el solvente orgánico se evapora mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. En una realización particular, el paso de evaporación del solvente orgánico se realiza manteniendo la emulsión bajo agitación mecánica durante al menos 60 minutos, preferiblemente al menos 120 minutos. Tras eliminar el solvente orgánico, la solución lipofílica solidifica, y se obtiene la suspensión de nanopartículas, que es filtrada mediante centrifugación. Finalmente, las nanopartículas lipídicas recogidas se lavan y resuspenden en agua purificada.
En un cuarto aspecto de la invención, la presente invención se refiere a un método (método 2 de la invención) para la preparación de nanopartículas lipídicas del segundo aspecto de la invención definida en párrafos anteriores, caracterizado por comprender las siguientes etapas:
(i) preparación de una solución acuosa que comprende un surfactante no iónico,
(ii) preparación de una solución lipofílica que comprende una mezcla de un lípido sólido y un lípido líquido fundida a una temperatura superior al punto de fusión del lípido líquido,
(iii) calentar la solución acuosa (i) a la misma temperatura que la solución lipofílica
(¡i)
(iv) añadir la fase acuosa (i) a la solución lipofílica (ii), sometiendo la mezcla resultante a sonicación hasta obtener una emulsión,
(v) enfriar la emulsión (iv) a 5°C±3°C para permitir la recristalización del lípido y la formación de la nanopartícula, y
(vi) recoger las nanopartículas,
donde el factor de crecimiento se añade a la solución (ii).
Las nanopartículas obtenidas con este método 2 son NLC. La primera etapa (i) consiste en disolver el surfactante no iónico en una solución acuosa, preferiblemente agua. La segunda etapa (ii) de preparación de la solución lipófilica se lleva a cabo fundiendo una mezcla de un lípido sólido y un lípido líquido a una temperatura superior al punto de fusión del lípido líquido. El factor de crecimiento, preferiblemente EGF, y más preferiblemente rhEGF, se disuelve junto con la mezcla de lípidos.
Una vez la solución acuosa (i) se calienta a la temperatura a la que se han fundido la mezcla de lípidos, la solución acuosa (i) se añade a la solución lipofílica (ii). La mezcla resultante se somete a sonicación hasta obtener una emulsión. A continuación, la emulsión (iv) se enfría a una temperatura de 5°C±3°C para permitir la recristalización del lípido y la formación de la nanopartícula. Tras la recristalización los lípidos, se obtiene una suspensión de nanopartículas, que es posteriormente filtrada mediante centrifugación. Finalmente, las nanopartículas lipídicas recogidas se lavan y resuspenden en agua purificada.
Un quinto aspecto se refiere a las nanopartículas lipídicas obtenidas por el método 1 y las nanopartículas lipídicas obtenidas por el método 2. Las nanopartículas lipídicas del primer, segundo y quinto aspecto de la presente invención se caracterizan por tener un tamaño de partícula medio igual o menor a 1 μηι, teniendo preferiblemente un tamaño medio comprendido entre 1 nm y 100 nm, y más preferiblemente entre 150 nm y 400 nm. El tamaño medio puede medirse por métodos estándar conocidos por expertos en la materia, y que son descritos, por ejemplo, en la parte experimental abajo (Tabla 1 , Ejemplo 2). Además, las nanopartículas lipídicas pueden tener una carga superficial (medido mediante el potencial Z), la magnitud puede variar entre -50 mV y +80 mV (Tabla 1 , Ejemplo 2). Asimismo, las nanopartículas lipídicas tienen una eficacia de encapsulacion mayor que 40%, en particular mayor que 70% para las SLN y mayor que 95% para las NLC (Tabla 1 , Ejemplo 2).
Una característica importante de las nanopartículas lipídicas de la presente invención es que liberan el factor de crecimiento cargado de una manera sostenida. Las nanopartículas lipídicas cargadas con factor de crecimiento presentan un perfil de liberación que se caracteriza por una liberación inicial (liberación bursf) asociada al porcentaje de la proteína asociada a la superficie, seguida de una fase de liberación rápida de 4 horas a 24 horas y finalmente, se describe una fase más lenta de 24 horas a 72 horas hasta la liberación de la cantidad total de EGF (Tabla 3, Ejemplo 2). Esta característica de liberación sostenida proporciona una importante ventaja, ya que permite tratamientos más seguros comparados con aquellos que usan EGF libre, que requieren de continuas administraciones de factor de crecimiento y de dosis más altas para lograr los mismos efectos terapéuticos. Asimismo, reduciendo la dosis se pueden disminuir los efectos adversos no deseados al no ser necesaria la administración de altas dosis de factor de crecimiento, ya que el factor de crecimiento encapsulado se libera a lo largo del tiempo, en pequeñas dosis pero más efectivas. Finalmente, la liberación sostenida de factor de crecimiento permite reducir el número de administraciones, aumentando la adherencia al tratamiento por parte del paciente y en consecuencia, la calidad de vida del paciente.
Sorprendentemente los inventores encontraron que las nanopartículas lipídicas de la presente invención, es decir nanopartículas lipídicas cargadas con EGF, muestran una inesperada tasa de proliferación in vitro de fibroblastos mayor que la del EGF libre (Ejemplo 3, sección 3.1 , Figura 1). Además, las nanopartículas lipídicas de la invención, es decir EGF-SLN y EGF-NLC, son capaces de entrar en el interior de la célula (Ejemplo 3, sección 3.2, Figura 2).
Resulta interesante señalar, que los estudios in vivo muestran que 4 administraciones tópicas de rhEGF-SLN a una dosis de 10 y 20 μg de rhEGF mejora la cicatrización, en cuanto a cierre de herida (Figura 3 A, C), resolución de la inflamación (Figura 4 A) y proceso de reepitelización (Figura 4 B), comparado con 300 μg de rhEGF administrado en 4 aplicaciones intralesionales. Además, estudios in vivo muestran que 4 administraciones tópicas de rhEGF-NLC a una dosis de 10 y 20 μg de rhEGF mejora la cicatrización en cuanto a cierre de herida (Figura 3 B, C), resolución de la inflamación (Figura 4 C) y proceso de reepitelización (Figura 4 D), comparado con 300 μg de rhEGF administrado en 4 aplicaciones intralesionales. Además, los datos obtenidos revelan que el proceso de cicatrización se mejoró considerablemente con 20 o 10 μg de rhEGF encapsulado en SLN y NLC, en términos de cierre de herida tras 8 y 1 1 días de estudio, comparado con una dosis intralesional de 75 μg de microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) rhEGF-MS. Así, el uso de lípidos como matriz para una nanopartícula es ventajoso sobre el uso de polímeros comunes biodegradables e hidrolíticamente degradables, como PLGA, puesto que las nanopartículas lipídicas permiten la administración tópica de la molécula cargada en la nanopartículas lipídica.
Asimismo, los estudios in vivo mostrados en el Ejemplo 6 (Figuras 8-10) muestran que la administración local y tópica de rhEGF-NLC puede mejorar la cicatrización no solo en términos de velocidad de cicatrización y número de heridas cicatrizadas
(medición de cierre de heridas), sino también en términos de calidad de cicatrización en base a la nueva microvasculatura formada, la migración de fibroblastos, deposición de colágeno y evolución de la respuesta inflamatoria. Además estos resultados resultan muy relevantes porque en los animales tratados con 20 μg de rhEGF-NLC administrado de forma tópica mejora la cicatrización significativamente comparados con aquellas lesiones tratadas con 75 μg de rhEGF libre administrado intralesionalmente. Estos resultados junto con los resultados de porcentaje de heridas cerradas y de re-epitelización demuestran que la nanoencapsulación de rhEGF en rhEGF-NLC permite su administración tópica y la reducción de dosis debido a que la encapsulación previene la degradación del factor de crecimiento en el lugar de la herida.
De manera interesante, EGF-SLN y EGF-NLC muestran una mejorada capacidad de penetración en la piel comparado con crema de parafina (Ejemplo 3, sección 3.4, Figura 5). Esta es una ventaja importante ya que permite la administración tópica de la molécula cargada en las nanopartículas lipídicas.
Así en un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula lipídica de la invención definida en el primer, segundo y quinto aspecto de la invención, como se ha descrito en cualquiera de los párrafos anteriores, y un vehículo farmacéutico. En una realización particular de este aspecto, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. Se puede administrar en forma de gel, crema, ungüento, aposito o como parche. Así, en una realización particular, la composición farmacéutica también comprende colágeno, ácido hialurónico, aloe vera, fibrina, polímeros de carbopol® y derivados de celulosa.
Además, en un séptimo aspecto de la presente invención se refiere a una nanopartícula lipídica definida en el primer, segundo y quinto aspecto de la invención como se ha descrito en cualquiera de los párrafos anteriores para su uso como medicamento. Además, en el octavo aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica definida en el sexto aspecto para su uso como medicamento.
Teniendo en cuenta los resultados in vivo descritos anteriormente, otro aspecto de la invención, noveno aspecto de la invención, se refiere a la nanopartícula lipídica definida en el primer, segundo y quinto aspecto de la invención descrita en cualquiera de los párrafos anteriores, para su uso en promover la cicatrización en un sujeto. Preferiblemente, se refiere a SLN cargadas con EGF, para su uso en promover la cicatrización en un sujeto, y a NLC cargadas con EGF, para su uso en promover la cicatrización en un sujeto. Además, en un décimo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica definida en el sexto aspecto de la invención para su uso en promover la cicatrización de un sujeto. El término "sujeto" usado aquí se refiere a cualquier animal vertebrado, preferiblemente mamífero y más preferiblemente un humano. En el contexto de la presente invención, herida se refiere a heridas crónicas, heridas de difícil cicatrización, heridas isquémicas y quemaduras. En una realización particular, la herida se selecciona del grupo que comprende las heridas crónicas, heridas isquémicas, quemaduras y sus combinaciones. Preferiblemente heridas crónicas se seleccionan del grupo que comprende úlceras de pie diabético, úlceras de presión, úlceras vasculares y sus combinaciones.
En el contexto de la presente invención, heridas crónicas se definen como aquellas heridas que fracasan al avanzar por un proceso de reparación ordenado y adecuado para restaurar la integridad anatómica y funcional por un periodo superior a tres meses. Todos los tipos de heridas tienen la potencialidad de convertirse en crónicas y, como tal, las heridas crónicas se dividen tradicionalmente por su etiología en tres categorías: úlceras de presión, úlceras diabéticas y úlceras vasculares (úlceras venosas y arteriales). Una úlcera por presión se define como una lesión localizada en la piel y/o en el tejido subyacente, por lo general sobre una prominencia ósea, como resultado de una presión o cizalla y/o combinación de ambas. Las úlceras de pie diabético son una de las complicaciones más temidas de la diabetes, debido a las graves consecuencias que tienen sobre la calidad de vida del paciente, y que aparecen como resultado de varios factores tales como cambios mecánicos en la conformación de la arquitectura ósea del pie, neuropatía periférica (nervios dañados) y enfermedad vascular periférica (bloqueo de arterias), ocurriendo todo ello con mayor frecuencia e intensidad en la población diabética. Las úlceras vasculares, se localizan generalmente en las extremidades inferiores.
La gran mayoría de ulceras vasculares son crónicas y recurrentes. Causan una considerable morbilidad entre los pacientes con enfermedad vascular periférica. Las heridas arteriales o isquémicas son causadas por una pobre perfusión a las extremidades inferiores. La isquemia limita el aporte de nutrientes y oxígeno, matando los tejidos y causando en el área la formación de una herida abierta. El reducido flujo sanguíneo al lugar de la herida dificulta gravemente la respuesta cicatrizante, causando una herida crónica que puede terminar en gangrena, y así, en amputación. Finalmente, las heridas de difícil cicatrización se caracterizan por una persistencia crónica de células inflamatorias, desorden en la síntesis y remodelado de la matriz extracelular, y la falta de re-epitelización; y las quemaduras son lesiones en la piel causadas por los efectos del calor, fuego, radiación, radiaciones solares, electricidad o químicos.
Sorprendentemente los inventores encontraron que la combinación de EGF y el péptido antimicrobiano perteneciente a las catelicinas LL37 muestra una inesperada mayor proliferación celular que el EGF libre y el LL37 libre, respectivamente (Ejemplo 4, Figura 7). El péptido LL37 corresponde al fragmento C-terminal de la proteína antimicrobiana catelicina humana, hCAP18, que es un componente del sistema inmune innato y que presenta un amplio espectro de actividad antimicrobiana (Heilborn et al., 2003, The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol; 120:379-389). Así, un decimoprimer aspecto de la presente invención se refiere a una composición (composición de la invención) que comprende nanopartículas lipídicas según los aspectos primero, segundo y quinto de la presente invención y nanopartículas lipídicas que comprenden al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico y el péptido LL37. En una realización particular de este aspecto, la composición comprende NLC cargadas con EGF y NLC cargadas con LL37. En otra realización particular de este aspecto, la composición comprende SLN cargadas con EGF y SLN cargadas con LL37. En otra una realización particular de este aspecto, en la composición de la invención la proporción nanopartículas lipídicas cargadas con factor de crecimiento, preferiblemente cargadas con EGF, y nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 es de entre 1 : 17 y 1 :34. En otra realización particular, la composición comprende 15 ng/ml de nanopartículas lipídicas cargadas con EGF y de 0.25 a 5 μg/ml nanopartículas lipídicas cargadas con LL37.
Un decimosegundo aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende la composición según el aspecto onceavo de la invención como se ha descrito en el último párrafo y un vehículo farmacéutico. En una realización preferida de este aspecto, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. Así, en una realización particular, la composición farmacéutica también comprende colágeno, ácido hialurónico, aloe vera, fibrina, polímero de carbopol® y derivados de celulosa.
Además, un decimotercer aspecto de la presente invención se refiere a la composición farmacéutica del aspecto doceavo, para su uso como medicamento.
Un decimocuarto aspecto de la presente invención, se refiere a la composición farmacéutica definida en el aspecto doceavo, para su uso para promover la cicatrización en un sujeto.
Un decimoquinto aspecto de la presente invención, se refiere a una nanopartícula lipídica que comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico y el péptido LL37. Las realizaciones particulares descritas en el primer aspecto de la presente invención son aplicables a las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 del aspecto decimoquinto, sustituyendo el factor de crecimiento o el EGF por el péptido LL37.
Un decimosexto aspecto de la presente invención, se refiere a la nanopartícula lipídica del decimoquinto aspecto de la presente invención que comprende además un lípido líquido a temperatura ambiente. Las realizaciones particulares descritas en el segundo aspecto de la presente invención son aplicables a las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 del aspecto decimosexto, sustituyendo el factor de crecimiento o el EGF por el péptido LL37. Un decimoséptimo aspecto de la presente invención, se refiere a un método (método 3 de aquí en adelante) para la preparación de nanopartículas lipídicas de acuerdo al decimoquinto aspecto de la presente invención, caracterizado por las mismas etapas que el método 1 descrito en el tercer aspecto de la presente invención, pero donde el péptido LL37 se añade a la solución lipofílica (ii), en lugar del factor de crecimiento. Las realizaciones particulares descritas para el método 1 descrito en el tercer aspecto de la presente invención son aplicables al método 3, sustituyendo el factor de crecimiento o el EGF por el péptido LL37. Un decimoctavo aspecto de la presente invención, se refiere a un método (método
4 de aquí en adelante) para la preparación de nanopartículas lipídicas de acuerdo al decimosexto aspecto de la presente invención, caracterizado por las mismas etapas que el método 2 descrito en el cuarto aspecto de la presente invención, pero donde el péptido LL37 se añade a la solución lipofílica (ii), en lugar del factor de crecimiento.
Un decimonoveno aspecto de la presente invención, se refiere a las nanopartículas lipofílicas obtenibles por el método 3 y a las nanopartículas lipofílicas obtenibles por el método 4, descritos en los aspectos decimoséptimo y decimoctavo, respectivamente.
Respecto al LL37, este péptido se puede sintetizar usando un sintetizador de péptidos automático y por métodos de síntesis peptídica estándar. Además, se puede obtener comercialmente, por ejemplo de Sigma-Aldrich. LL37 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1
(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES).
Una característica importante de las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 de la presente invención es que liberan el LL37 cargado de una manera sostenida. Las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 presentan un perfil de liberación que se caracteriza por una liberación inicial (liberación bursf) asociada al porcentaje del péptido asociado a la superficie, seguida de una fase de liberación rápida de 4 horas a 24 horas y finalmente, se describe una fase más lenta de 24 horas a 72 horas hasta la liberación de la cantidad total de EGF (Tabla 4, Ejemplo 2). Sorprendentemente los inventores encontraron que las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37, muestran una inesperada mayor proliferación de fibroblastos in vitro que el LL37 libre (Ejemplo 3, sección 3.3, Figura 6). Así, un vigésimo aspecto de la presente invención se refiere a las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 de los aspectos decimoquinto, decimosexto y decimonoveno de la presente invención, para su uso como medicamento.
Un vigesimoprimer aspecto de la presente invención se refiere a las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 de los aspectos decimoquinto, decimosexto y decimonoveno de la presente invención, para su uso para promover la cicatrización de heridas.
Un vigesimosegundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas lipídicas cargadas con LL37 de los aspectos decimoquinto, decimosexto y decimonoveno de la presente invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de este aspecto, la composición farmacéutica se administra por vía tópica. Así, en una realización particular, la composición farmacéutica también comprende colágeno, ácido hialurónico, aloe vera, fibrina, polímero de carbopol® y derivados de celulosa.
La presente invención también se refiere, en un vigesimotercero aspecto, a la composición farmacéutica del aspecto vigésimo segundo, para su uso como medicamento. Un vigesimocuarto aspecto de la presente invención se refiere a composición farmacéutica del aspecto vigésimo segundo, para su uso para promover la cicatrización de heridas.
Finalmente, un vigesimoquinto aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende una cualquiera de las nanopartículas descritas en el primer, segundo, quinto, decimoquinto, decimosexto y decimonoveno aspecto de la invención, o mezclas de las mismas. Asimismo se refiere a un kit que comprende una composición farmacéutica según una cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el aspecto sexto, decimosegundo y vigesimosegundo de la invención.
Los ejemplos de abajo sirven para ilustrar mejor la invención, y para proporcionar a aquellos expertos en la materia una completa descripción de cómo se preparan y evalúan las nanopartículas lipídicas presentadas aquí, y que no tienen como objeto limitar el ámbito de la invención. En los ejemplos, salvo que se indique lo contrario, las cantidades y porcentajes son en peso, temperatura en grados Celsius o temperatura ambiente, y la presión es presión atmosférica o próxima. EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Preparación de las nanopartículas lipídicas
Las SLN y NLC fueron preparadas mediante el método basado en emulsificación- ultrasonicación (Muller et a/ 2002; Che et al. 2010 (Effects of lipophilic emulsifiers on the oral administration of lovastatin from nanostructured lipid carriers: Physicochemical characterization and pharmacokinetics. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74, 474-482)). En el caso de las SLN cargadas con rhEGF, se añadió 10 mi de una solución acuosa de 1 % (v/v) Tween 80 a 2 mi de una solución de diclorometano que contenía 0.1 % (w/v) rhEGF comercial y 10% (w/w) Precirol® ATO 5. Inmediatamente después, la mezcla se emulsificó durante 30 segundos a 50 W (Branson® 250 sonifier, CT, USA). En este paso se produjo una emulsión o/w que fue después agitada durante 2 horas para extraer el solvente orgánico y para la compactación de las partículas. Las SLN fueron después recogidas mediante centrifugación a 2500 rpm durante 10 minutos usando un filtro centrífuga con tamaño de poro de 100 kDa (Amicon® Ultra, Millipore, España), y se lavaron tres veces con agua miliQ. Finalmente, se añadió trehalosa como crioprotector en una solución acuosa al 15% respecto al Precirol® ATO 5.
En cuanto a la preparación de las NLC cargadas con rhEGF, se añadió una solución acuosa templada de 0.67% (w/v) Poloxamer y 1.33% (w/v) Tween 80, calentada a 40°C durante 1 minuto, sobre una mezcla de 200 mg de Precirol® ATO 5 fundido, 2 mg de rhEGF comercial y 20 mg de Migliol, también calentadas a 40°C durante 1 minuto. La mezcla resultante se emulsificó después durante 15 s a 50 W (Branson® 250 sonifier, CT, USA) y conservada durante 12 horas a 4°C, recristalizando el lípido, para que se formen las NLCs. Finalmente, las partículas se recogen, lavan y liofilizan como se ha descrito anteriormente. La carga de rhEGF tanto en las SLN como en las NLC fue de 1 % (w/w).
Las SLN cargadas con LL37 y las NLC cargadas con LL37 se prepararon como se ha descrito para las SLN cargadas con rhEGF y NLC cargadas con rhEGF, respectivamente, pero utilizando LL37 sintético (Sigma-Aldrich 94261) o recombinante, en lugar de rhEGF.
EJEMPLO 2.- Caracterización de las naopartículas lípidas
2.1. - El tamaño medio (z-media) y el índice de polidispersión (Pl) fueron medidos por espectroscopia de correlación fotónica. Cada ensayo fue realizado por triplicado antes y después de que las nanopartículas fueran liofilizadas. El potencial zeta (ζ) fue determinado por velocimetría Doppler (LDV). Todas las mediciones descritas anteriormente fueron evaluadas mediante el equipo Malvern® Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). La apariencia de la superficie y su morfología fue determinada por microscopía electrónica de barrido (SEM;
Jeol® JSM-35 CF) y microscopía electrónica de transmisión (TEM).
2.2. - La eficacia de encapsulación (EE) fue calculada indirectamente midiendo el rhEGF libre y el LL37 libre (no-encapsulado) eliminado en la técnica de filtración/centrifugación usada para recoger las SLN y NLC. Cada muestra fue diluida 1 : 10000 con una solución de solución de fosfato salina de Dulbecco (DPBS) que contenía 0.05% (v/v) Tween 20 y 0.1 % (w/v) Albúmina de Suero Bovino (BSA, del inglés Bovine Serum Albumin). La cantidad de rhEGF libre y LL37 libre se estimó utilizando un kit comercial de ensayo inmunoenzimático tipo sándwich para EGF humano (human EGF ELISA development kit, Peprotech) y para LL-37 humano (human LL-37 ELISA development kit, Hycult biotech), siguiendo las instrucciones del proveedor. La eficacia de encapsulación (EE) se estudió siguiendo la siguiente ecuación: EE (%) = Cantidad total de rhEGF (o LL37) - rhEGF libre (o LL37 libre) X100 Cantidad total de rhEGF (o LL37)
Todos los estudios se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron medias ± desviación estándar de estos ensayos.
Tabla!- Caracterización de SLN y NLC cargadas con rhEGF:
Antes de la Después de la
liofilización liofilización
Formul Tamaño(nm)PDI Tamaño (nm) PDI Potencial zeta (mV) EE ación (%
)
SLN 226.1 0.28 310.9 0.30 ± -33.8 73,9
± 0.8 ± 15.8 0.02 ± 0.3 ± 2.2
NLC 241.5 0.38 353.6 0.37 ± -34.6 95.7 ± 23.3 ± 4.53 0.01 ± 0.2 ± 4.7
Tabla 2.- Caracterización de SLN y NLC cargadas con LL37:
Antes de la Después de la
liofilización liofilización
Formul Tamaño (nm)PDI Tamaño (nm) PDI Potencial zeta EE ación (mV) (%)
SLN 251.53 0.35± 340.27 0.25 -33.97 70,67
± 7.79 0.02 ± 2.42 ± 0.01 ± 0.6 ± 0.2
NLC 225.4 0.35± 320.90 0.37 -33.47 97.52 ± 1.26 0.07 ± 3.72 ± 0.01 ± 1.8 ± 0.8 Tal y como se muestra en las Tablas 1 y 2, el valor de PDI fue menor de 0.5 en todas las formulaciones antes y después de liofilizar, confirmando la distribución de tamaño homogénea en todos los casos. La reconstitución de las partículas secas para las mediciones de tamaño no presentó ningún problema, lo que sugiere la ausencia de fusión o agregación de las partículas, a pesar del aumento de tamaño. En cuanto al potencial zeta, ambas formulaciones presentaron una carga superficial similar, estando todas las medidas en la región de -34 mV. Además, los estudios de ELISA demostraron que la EE de las NLC fue ligeramente superior a la de las SLN.
En ambas formulaciones, la superficie de las partículas era lisa y sin poros. Por el contrario, tanto las imágenes de SEM como las de TEM sugirieron que las SLN son más regulares que las NLC (datos no mostrados).
2.3.- Estudios de liberación in vitro
El estudio de liberación se llevó a cabo incubando durante 3 días, 32 mg y 23 mg de SLN o NLC (correspondientes a -200 μg de rhEGF o LL37) en 2 mi de 0.02 M tampón fosfato salino (PBS). En los intervalos seleccionados, el medio de liberación fue retirado mediante filtración/centrifugación y sustituido por la misma cantidad de PBS. La cantidad de rhEGF y LL37 fue analizada mediante ELISA usando el protocolo descrito en la sección 2.2.
Tabla 3.- Porcentaje acumulado de rhEGF liberado durante el tiempo
Figure imgf000023_0001
Tabla 4.- Porcentaje acumulado de LL37 liberado durante el tiempo
Tiempo Liberación acumulada de Liberación acumulada de LL37
LL37 liberado de SLN liberado de NLC
30 minutos 27,60 ± 2,96 31 ,21 ±10,56
4 horas 45, 19 ± 6,82 52, 14 ± 4,57
8 horas 55,87 ± 4,31 65, 18 ± 6,21
24 horas 62,51 ± 21 ,22 74,93 ± 10,20 48 horas 89,00 ± 12,41 93,81 ± 5,25
72 horas 100,76 ± 19,20 105,70 ± 10,25
Los perfiles de liberación in vitro de rhEGF y LL37 descritos en la Tabla 3 y Tabla 4, respectivamente, demuestran que ambas formulaciones presentan un perfil similar de liberación. Primeramente, se observa una liberación inicial (liberación burst) asociada al porcentaje de proteína o péptido asociada a la superficie, seguida de una fase de liberación rápida de 4 horas a 24 horas y finalmente, se describe una liberación más lenta desde las 24 horas hasta las 72 horas hasta la liberación de la cantidad total de rhEGF y LL37.
EJEMPLO 3.- Proliferación celular, captación celular y penetración en la piel de las nanopartículas
3.1.- Efecto de las nanopartículas cargadas con rhEGF en la proliferación celular Para el estudio de proliferación se utilizó una placa de 24 pocilios. Se cultivaron 35000 fibroblastos Balb/C 3T3 resuspendidos en 1 mi de medio de cultivo completo (DMEM suplementado con 10 % de FCS) en cada pocilio. Tras 8 horas de incubación, el medio fue sustituido por 1 mi de DMEM suplementado con 0.2% de FCS (suero fetal de ternero) y se incubaron las células durante toda la noche. Después el medio fue sustituido por 1 mi de: (i) DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (ii) 15 ng/ml de rhEGF libre en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (iii) SLN vacías en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (iv)15 ng/ml de SLN cargadas con rhEGF (rhEGF-SLN) en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (v) NLC vacías en DMEM suplementado con 0.2% de FCS y (vi) 15 ng/ml de NLC cargadas con rhEGF (rhEGF- NLC) en DMEM suplementado con 0.2% de FCS.
Las células se cultivaron en las mismas condiciones durante 24 horas, 48 horas y 72 horas. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Después de los diferentes tiempos de incubación, se añadió 100 μΙ de CCK-8 (Sigma-Aldrich, Saint Louise, USA) a cada pocilio (Zhou, Y. , Qian, M., Liang, Y., Liu, Y., Yang, X., Jiang, T., Wang, Y., 201 1. Effects of Leukemia Inhibitory Factor on Proliferation and Odontoblastic Differentiation of Human Dental Pulp Cells. J. Endod; 37:819-824). Tras 4 horas de incubación, se midió la absorbancia a 450 nm y 650 nm como longitud de onda de referencia. La absorbancia fue directamente proporcional al número de células vivas en el medio.
El estudio de proliferación llevado a cabo en células Balb/c 3T3 demostró el efecto mitogénico del rhEGF. La Figura 1 muestra una mayor proliferación en los grupos tratados con rhEFG (rhEGF- NLC, rhEGF-SLN y rhEGF libre) que en los grupos control, después de 48 horas and 72 horas. Sorprendentemente, el rhEGF encapsulado en nanopoartículas lípidas (tanto SLN como NLC) mostró un mayor incremento en el efecto mitogénico de los fibroblastos Balb/C 3T3 que el rhEGF libre.
3.2. - Efecto de las nanopartículas cargadas con LL37 en la proliferación celular
El experimento se llevó a cabo cómo se describe en el apartado 3.1. pero con células HUVEC (células humanas endoteliales de cordón umbilical) Los grupos estudiados fueron los siguientes: (i) DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (ii) 0.5 y 0.1 g/ml de LL37 libre en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (iii) SLN vacías en DMEM suplementado con 0.2% de FCS DMEM, (iv) 0.5 and 0.1 μg/ml de SLN cargadas con LL37 (LL37-SLN) en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (v) NLC vacías en DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (vi) 0.5 y 0.1 μg/vΓ^\ de NLC cargadas con LL37 (LL37-NLC) DMEM suplementado con 0.2% de FCS y (vii) 10%
DMSO como control negativo.
El estudio de proliferación llevado a cabo en células HUVEC demostró el efecto mitogénico del LL37. La Figura 6 demuestra una mayor proliferación después de 48 horas en los grupos tratados con LL37 (LL37-NLC, LL37-SLN y LL37 libre) que los grupos control tratados con ambas dosis.
3.3. - Captación celular de las formulaciones de SLN-NileRed y NLC-NileRed
Se cultivaron 50000 fibroblastos Balb/C 3T3 y 100000 queratinocitos HaCaT, de forma separada, en cubreobjetos en medio de cultivo completo durante 24 horas. El medio fue después sustituido por 1 mi de medio de estudio. Los grupos estudiados fueron los siguientes: (i) 25 μg de SLN-NileRed en DMEM completo y (ii) 25 μg de NLC-NileRed en DMEM completo. Tras 1 hora de incubación las células se lavaron y fijaron. Posteriormente, los núcleos se tiñeron con DAPI (500 ng/ml) y los cubreobjetos se montaron sobre los portaobjetos para su examen en un microscopio de fluorescencia.
Los resultados obtenidos del estudio de captación celular se presentan en la Figura 2. El citoplasma celular se torna rojo (flechas blancas en Figura 2) debido a la internalización de las SLN y NLC. La figura muestra la capacidad de las SLN- NileRed y NLC-NileRed de entrar en la célula. No se observaron diferencias entre la capacidad de internalización de las SLN y NLC. 3.4.- Captación cutánea de las formulaciones SLN y NLC
El experimento se llevó a cabo tal y cómo lo describen Küchler et al. 2009 (Nanoparticles for skin penetration enhancement - A comparison of dendritic core- multishell-nanotransporter and solid lipid nanoparticles. Eur J Pharm Biopharm.; 71 :243-250). Para los grupos tratados y los grupos control se utilizó la piel del mismo animal. Los grupos estudiados fueron (n=3) (i) SLN-NileRed, (ii) NLC-
NileRed y (iii) crema de parafina cargada con Rojo Nilo usada como referencia. Todas las preparaciones tenían Rojo Nilo a la misma concentración de 0.004%. La piel se mantuvo durante 24 horas a 32°C. Después, la piel se lavó con PBS, se secó y se cortó en secciones verticales (de abajo para arriba) de 20 μηι de grosor usando un criotomo Frigocut 2800 N, Leica, Bensheim, Alemania). Los cortes se guardaron a -20°C y se analizaron tras 24 horas, sometiéndolas a luz normal y fluorescente.
Para todos los experimentos, los valores arbitrarios corregidos del brillo de los píxeles (ABU) obtenidos de la captación del tinte se estudiaron frente a los valores de captación de la crema de parafina cargada con Rojo Nilo. El parámetro resultante, llamado efecto aumentado de penetración (PEE) se calculó para todas las capas de la piel. El valor de la crema de parafina fue 1 por definición (Lombardi Borgia, S., Regehly, M., Sivaramakrishnan, R., Mehnert, W., Korting, H.C., Danker, K., Roder, B., Kramer, K.D., Schafer-Korting, M., 2005. Lipid nanoparticles for skin penetration enhancement-correlation to drug localization within the particle matrix as determined by fluorescence and parelectric spectroscopy. J. Control. Reléase. 1 10: 151-163). Los valores del efecto aumentado de penetración (PEE), estimados de los valores arbitrarios corregidos del brillo de los píxeles (ABU) de las capas de la piel están presentados en la Figura 5. Los valores de PEE muestran que la penetración del marcador de las SLN-NileRed y NLC-NileRed son superiores a los encontrados con la crema de parafina en todas las capas de la piel. Los valores de PEE para SLN-
NileRed y NLC-NileRed aumenta cuatro veces en el estrato córneo (4.74 y 4.62 respectivamente) y alrededor de dos veces en la epidermis (2.09 y 2.03 respectivamente). Un menor, aunque todavía significativo aumento de la penetración también se observó en la dermis (1.29 y 1.32 respectivamente). En definitiva, los valores de ABU y PEE superiores a 1 demuestran una mejora en la capacidad de penetración de las SLN y NLC en comparación con la crema de parafina. Además, los resultados reflejan la capacidad de estas nanopartículas de liberar el Rojo Nilo en la piel y por consiguiente el rhEGF y LL37. EJEMPLO 4.- Proliferación in vitro de rhEGF / LL37 / la combinación de rhEGF y LL37
El experimento se llevó a cabo como se describe en el apartado 3.1. El efecto sinérgico del LL37 y rhEGF se evaluó en fibroblastos Balb/C y queratinocitos HaCat. Para el estudio de proliferación se utilizó una placa de 24 pocilios. En cada pocilio se sembraron 35000 fibroblastos Balb/C 3T3 resuspendidos en 1 mi de medio de cultivo completo (DMEM suplementado con 10 % de FCS). Tras 8 horas de incubación, el medio fue sustituido por 1 mi de DMEM suplementado con 0.2% de FCS y se incubaron las células durante toda la noche. Posteriormente, el medio fue sustituido por 1 mi de: (i) DMEM suplementado con 0.2% de FCS, (ii) 15 ng/ml de rhEGF libre, (iii) 5, 0.5 y 0.25 g/ml de LL37, (iv) 15 ng/ml de rhEGF y 5, 0.5 y
0.25 μg/ml de LL37. Las células se cultivaron a 37°C y atmosfera de 5% C02 durante 24 horas, 48 horas y 72 horas.
El estudio de proliferación llevado a cabo en las HaCaT (queratinocitos humanos) y fibroblastos demostró que tras 48 horas, 10 y 50 ng/ml de LL37 y 15 ng/ml rhEGF aumentan la mitosis en mayor medida que el rhEGF libre solo (Figura 7).
EJEMPLO 5.- Cicatrización in vivo con SLN cargadas con rhEGF y NLC cargadas con rhEGF Se ha evaluado la eficacia de cicatrización in vivo de las SLN cargadas con rhEGF y NLC cargadas con EGF con dos formulaciones distintas de rhEGF: (i) 75 μg de rhEGF liofilizado (similar al comercializado Heberprot®) y (ii) 75 μg e rhEGF encapsulado al 1 % (w/w) en microesferas poliméricas (rhEGF-MS 75μg) preparadas en nuestro laboratorio con una combinación de alginato y de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) usando el método de doble emulsión como se describe en la aplicación de patente Europea EP12382476. Brevemente, 2 mi de una solución de diclorometano:acetona (3:1) que contiene 5% (w/v) de PLGA (Resomer RG503) se emulsiona mediante sonicacion durante 15 segundos a 50 W con 0.2 mi de una fase interna acuosa (en agua miliQ) que contiene 0.05% (w/v) rhEGF, 2.5% mg (w/v) de Albúmina Sérica Humana (HSA), 0.25% (w/v) de polietilenglicol 400 (PEG400) y 2.5% (w/v) alginato sódico MVG (Pronova UP, NovaMatrix FMC BioPolymer, Sandvika, Norway). La emulsión resultante (w^o) se añade a 15 mi de una solución acuosa que contiene 5% alcohol polivinílico (PVA) y 5% NaCI y se emulsiona mediante un agitador de paletas durante 60 segundos para obtener la doble emulsión (W /o/w2). Finalmente, se añade 400 mi una solución acuosa de 5% NaCI y 0.6 mM de cloruro cálcico y se mezcla durante 30 minutos. Las microesferas se recogen por filtración y se liofilizan. 5.1.- Animales
Se utilizaron ochenta ratones macho db/db de 8 semanas. Los ratones genéticamente diabéticos db/db (BKS.Cg-m +/+ Leprdb/J) se obtuvieron de los Laboratorios Javier (Saint Berthevin Cedex). Todos los procedimientos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Uso y Cuidado de Animales de la Universidad del País Vasco.
5.2.- Procedimiento experimental
Los experimentos se realizaron adaptando el procedimiento usado por Michaels et al. (db/db mice exhibit severe wound healing impairments compared with other murine diabetic strains in a silicone splinted excisional wound model. Wound Repair and Regeneration 2007; 15:665-670). Los animales se dividieron en los siguientes 10 grupos: (i) control no tratado, (ii) 75 μg de rhEGF libre, (iii) MS vacías, (iv) SLN vacías, (v) NLC vacías, (vi) rhEGF-MS 75μg, (vii) rhEGF-SLN 10 μς, (viii) rhEGF- SLN 20 μg (ix) rhEGF- NLC 10 μg y (x) rhEGF- NLC 20 μg. Las nanopartículas previamente resuspendidas en 20 μΙ de vehículo (tampón 0.9% salino y 0.5% carboximetilcelulosa) se administraron tópicamente dos veces por semana con una micropipeta y permitiendo que se extendiesen por todo el lecho de la herida. El rhEGF libre resuspendido en 0.5 mi de vehículo, se administró dos veces por semana mediante administración intralesional, introduciendo la aguja dentro de la herida. rhEGF-MS 75 μg también resuspendido en 0.5 mi de vehículo, se administró una única vez el día que se indujeron las heridas mediante administración intralesional.
5.3.- Evaluación de la cicatrización
La eficacia de los tratamientos para mejorar la cicatrización se evaluaron mediante la medición del área de la herida (cm2) en el día de la cirugía y los días 4, 8, 11 y 15 tras la inducción de las heridas (Figura 3B), usando una cámara digital (Lumix FS16, Panasonic®, España) y un programa de análisis de imagen (ImageJ®,
Biophotonics Facility, Universidad de McMaster, Canadá). El cierre de la herida se expresa como porcentaje del área de la herida original.
Todos los grupos experimentales (rhEGF-SLN 20 y 10 μg, rhEGF-NLC 20 y 10 μg, y rhEGF-MS 75μg) presentaron una reducción del área de herida superior desde el día 4 (Figura 3A) comparado con sus grupos control (para los grupos rhEGF-SLN sus controles son rhEGF libre, SLN vacías y control no tratado; para los grupos de rhEGF-NLC sus controles son rhEGF libre, NLC vacías y control no tratado; y para rhEGF-MS 75μg sus controles son rhEGF libre, MS vacías y control no tratado). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las formulaciones lipídicas (rhEGF-SLN y rhEGF-NLC); por el contrario, la contracción de la herida fue significativamente mayor que en los grupos de rhEGF-MS 75μg y rhEGF libre (p<0.001). En cuanto a los grupos control, rhEGF-MS 75μg también mostró un cierre de herida estadísticamente significativo. Para el día 8, la contracción de la herida alcanzó diferencias máximas entre todos los grupos experimentales y sus controles. Del mismo modo, no se encontraron diferencias entre las formulaciones rhEGF-SLN, rhEGF-NLC y rhEGF-MS 75 μg. De forma interesante, a los 1 1 días tras la inducción de las heridas, los animales tratados con rhEGF-SLN 20 μg mostraron una significativa mayor reducción de la herida comparado con otros grupos experimentales (p<0.05 para rhEGF-SLN 10 μg, rhEGF-NLC 20 y 10 μg, y p<0.001 para rhEGF-MS 75μς) y sus grupos control. Sin embargo, los otros grupos experimentales también mostraron contracción de la herida, aunque menor. Al final del estudio, el día 15, las heridas de los grupos tratados con todas las formulaciones con nanopartículas lipídicas casi habían cerrado. Sorprendentemente, rhEGF-MS 75μg presentó un retardo en la contracción de la herida (73.16 ± 3.24%) en relación a las nanopartículas lipídicas (-95 %). Es de destacar que durante todo el experimento, administraciones múltiples de rhEGF libre muestran menores diferencias entre todos los grupos control que aquellas presentadas por los grupos con rhEGF nanoformulados.
Tabla 5.- Cicatrización
Figure imgf000030_0001
5.4. - Estimación histológica de cicatrización
El día 8 y 15 los animales fueron sacrificados con inhalación de C02. Las heridas y el tejido colindante (~ 1 cm) fue extirpado y fijado en paraformaldehido al 3.7% durante 24 horas. Después, los tejidos fijados fueron biseccionados, embebidos en parafina y cortados en láminas de espesor 5 μηι. Las muestras se procesaron para tinción con hematoxilina-eosina para observación morfológica.
Con respecto a resolución de la recuperación de la inflamación (Figura 4 A) y la maduración de la herida, se utilizó la escala descrita por Cotran et al, 2000 (Reparación de los tejidos: regeneración celular y fibrosis. Patología estructural y funcional: Me Graw Hill Interamericana, 2000, pp 95-120). La puntuación de cada herida se asignó de manera sem ¡cuantitativa con una puntuación de 0 a 4. 0: Ausencia de respuesta inflamatoria. 1 : inflamación aguda (formación del coágulo de fibrina y membrana piogénica, migración de leucocitos y neutrofilos polinucleados), 2: predominancia de inflamación aguda difusa (predominancia de tejido de granulación y membrana piogénica, neogénesis vascular), 3: predominancia de inflamación crónica (proliferación de fibroblastos), 4: resolución y cicatrización (reducción o desaparición de la inflamación agua aunque ocasionalmente puedan persistir células redondeadas).
El proceso de re-epitelización (Figura 4.B, D) se midió siguiendo el criterio establecido en Sinha et al. (Effects of steel scalpel, ultrasonic scalpel, C02 láser, and monopolar and bipolar electrosurgery on wound healing in guinea pig oral mucosa. Laryngoscope 2003; 113(2):228-236). 0: re-epitelización en el borde de la herida, 1 : re-epitelización cubriendo más de la mitad de la herida, 3: re-epitelización cubriendo toda la herida, con grosor irregular y 4: re-epitelización cubriendo toda la herida con grosor normal.
5.5. - Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como medias ± desviación estándar. Basado en el test Levene, los resultados de homogeneidad de las medias de las varianzas se compararon con los test de t de Student o ANOVA de un solo factor para comparación múltiple. Posteriormente, se aplicó el test Bonferroni o Tamhane post- hoc. Las diferencias se consideraron significativas con p<0.05. Los cálculos se llevaron a cabo con el software SPSS 20.0 (SPSS®, Inc., Chicago, IL).
El día 8 solo rhEGF-SLN 20 μg presentó un estado de inflamación crónica próximo a la resolución completa, donde prevalecía la proliferación de fibroblastos
(puntuación 3.67 ± 1.15) (Tabla 6). Los animales tratados con rhEGF-NLC 20 μg, casi con predominancia de estado inflamatorio agudo cercano al crónico, mostró menor puntuación de inflamación (2.75 ± 0.46). Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Además, ambas formulaciones presentaron una mejor resolución que sus controles. Por otra parte, rhEGF-SLN 10 μg y rhEGF-
NLC 10 μg no abandonaron el estado inflamatorio agudo (<2.00); no obstante, se encontraron diferencias (p<0.001) entre estos grupos y el grupo control no tratado, que mostró ausencia de respuesta inflamatoria. rhEGF-NLC 10 μg también mostró diferencias (p<0.05) con su control (NLC Blancas).
Respecto a la evaluación de la respuesta en función de la dosis (20 o 10 μg) entre las nanopartículas lipídicas, solo rhEGF-SLN 20 μg presentó una mejor resolución (superior que rhEGF-SLN 10 μg). El análisis histopatológico también indicó que en las heridas tratadas con rhEGF prevalecía el estado inflamatorio agudo difuso, con una puntuación de inflamación de 2.13 ± 0.64 (significativamente superior que sus grupos control). Estas diferencias no alcanzaron significancia estadística con ninguna de las nanoesferas lipídicas (ni rhEGF-SLN ni rhEGF-NLC).
Como se ha mencionado anteriormente, 15 días después de la inducción de las heridas las diferencias tienden a ser menores, no alcanzando la significancia estadística con ningún grupo y sus controles. Con respecto al grado de re-epitelización, los datos obtenidos el día 8 mostraron que solo los grupos tratados con nanopartículas lipídicas con la mayor dosis (20 μg) y los animales tratados con rhEGF-MS 75μg, presentaban nuevo epitelio cubriendo más de la mitad de la herida (>2.00, de acuerdo al criterio de Sinha U.K. 2003). Además, se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre estos grupos y sus controles (rhEGF libre, SLN vacías y control no tratado para rhEGF- SLN20 μg y rhEGF libre, NLC vacías y control no tratado para rhEGF-NLC 20 μg) (Figura 5). Por el contrario, en los grupos tratados con nanopartículas lipídicas con la menor dosis (rhEGF-SLN 10 μg y rhEGF-NLC 10 μg) el nuevo epitelio no cubrió más de la mitad de la herida. Además, aunque se encontraron diferencias significativas con el grupo no tratado (p<0.01), la significancia estadística tendía a perderse con las SLN vacías en el caso de rhEGF-SLN 10 μg y con las NLC vacías en el caso de rhEGF-NLC 10 μg, a pesar de que las puntuaciones de re- epitelización fueron superiores en el grupo de nanopartículas lipídicas cargadas con rhEGF 10 μg (Figura 4.B). Con respecto a rhEGF-MS- 75μg, en el día 8 el área re- epitelizada cubría más de la mitad de la herida y se encontraron diferencias significativas entre rhEGF-MS 75μg y sus grupos control (control no tratado y MS vacías).
Así, el estudio del proceso de re-epitelización (Tabla 7) reveló que los animales tratados con 4 dosis de 75 μg de rhEGF libre mostraba una mayor puntuación de re-epitelización que los grupos no tratados (1.25 ± 0.89 y 0.00 ± 0.00 respectivamente). Sorprendentemente, el efecto de múltiples dosis intralesionales de rhEGF libre mostró una mejora inferior en la re-epitelización que aquella obtenida con 4 administraciones tópicas de rhEGF-SLN y rhEGF-NLC y una dosis intralesional e rhEGF-MS 75 μg.
15 días tras la inducción de las heridas, el estudio de re-epitelización no reveló ninguna diferencia entre grupos.
Tabla 6.- Puntuación de la inflamación
Figure imgf000033_0001
rhEGF-MS 75 2,13 ± 0,64 2,86 ± 0,90 rhEGF-SLN 10 1 ,63 ± 1 ,51 3,50 ± 0,93 rhEGF-SLN 20 3,67 ± 1 ,15 3,38 ± 0,52 rhEGF-NLC 10 1 ,88 ± 1 ,21 3,13 ± 0,35 rhEGF-NLC 20 μς 2,75 ± 0,46*, 3,00 ± 0,00
Tabla 7. Puntuación de la re-epitelización.
Figure imgf000034_0001
EJEMPLO 6.- Cicatrización in vivo en cerdos con NLC cargadas con rhEGF
6.1.- Animales
Todos los protocolos y procedimientos utilizados fueron aprobados por el Comité Ético de Bienestar Animal del Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón (CCMIJU). Se emplearon 6 cerdos de la raza Large white, hembras con un peso medio de 26,82 ± 2,90 kg al comienzo del estudio, distribuidos en cubículos individuales de 2,90 x 1 ,35m. Todos los animales del estudio se distribuyeron aleatoriamente en salas aclimatadas en las cuales se establecieron las siguientes condiciones de alojamiento: ciclos de 12 horas de luz/oscuridad, temperatura entre 20 y 25°C, ocho cambios de aire por hora con filtración HEPA y una humedad relativa entre el 50 y el 70%. Para el enriquecimiento ambiental de los cubículos se instalaron cadenas colgantes y pelotas de goma como elementos masticables. Los animales cumplieron un periodo de aclimatación tras el cual fueron identificados mediante crotal para su inclusión en el estudio.
6.2. - Modelo de herida y procedimiento quirúrgico
Tras doce horas de ayuno sólido y seis de ayuno líquido, los animales fueron sedados mediante la administración intramuscular de 15 mg/kg de ketamina y 0,2 mg/ kg de diazepam. Posteriormente, se les indujo anestesia mediante la administración de propofol (3 mg/kg), para permitir la intubación traqueal. Inmediatamente después se conectó a los animales a una máquina anestésica a través de un circuito circular semicerrado unido a un ventilador suministrando como agente anestésico sevofluorano a una concentración de 2,7% en un flujo de oxígeno de 1 L/minuto. Como analgesia se suministró remifentanilo mediante infusión intravenosa continua a un ritmo de 0, 1 μg/kg /minuto durante la cirugía. A cada animal se le realizó 6 úlceras (6 cm x 5 cm) dejando 1 ,5-2,0 cm mínimo entre úlcera, tras tatuar el borde de las úlceras usando un molde para tener referencia permanente del área inicial de las heridas. Las úlceras se crearon con diatermia monopolar en modo de coagulación para obtener bordes isquémicos, de 2 mm de profundidad, dejando el panículo adiposo. Se administró analgesia postoperatoria mediante parches transdérmicos de fentanilo y antibioterapia sistémica con amoxicilina/clavulánico (20 mg/kg) durante una semana.
6.3. - Grupos experimentales
A las 24 horas de inducir las heridas se comenzó la administración de los tratamientos (día 1 del estudio) para permitir hemostasia primaria, adhesión y agregación plaquetaria y activación de la cascada de coagulación. Los animales se dividieron aleatoriamente en 3 grupos (n=2): (i) NLC blancas, (ii) 20 μg de rhEGF- NCL y (iii) 75 μg de rhEGF libre. Las nanopartículas previamente resuspendidas en 150 μΙ de vehículo (0.9% cloruro de sodio y 0.5% carboximetilcelulosa) se administraron tópicamente dos veces por semana distribuyéndolas por todo el lecho de la herida. El rhEGF libre, resuspendido en 1 mi de vehículo, se administró intralesionalmente dos veces por semana.
Durante todo el estudio, se cubrieron las heridas para evitar la deshidratación y la contaminación bacteriana. Asimismo, el vendaje previno la formación de costra y favoreció la observación de los bordes epiteliales para medir el área de las heridas cicatrizadas. Para ello, cada herida se cubrió con una gasa parafinada para evitar la adhesión del vendaje, encima se colocaron tres gasas de algodón estériles, fijadas con un vendaje adhesivo y se aseguraron con esparadrapo. Los cambios de vendaje se realizaron dos veces por semana para valorar de forma continua el estado de la herida y su evolución, manteniendo de esta forma un elevado grado de asepsia. El proceso de limpieza se llevó a cabo con el máximo cuidado, con gasas estériles y solución salina, para eliminar exudados y suciedad respetando la integridad del tejido de granulación neoformado.
6.4. - Muestras de sangre
Para monitorizar el estado general de los animales, se recogieron muestras de sangre para evaluar los niveles hematológicos y bioquímicos el día de la inducción de las heridas, el día 15 y al final del estudio (día 43). Los parámetros estudiados fueron: hematocrito, hemoglobina, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media, glóbulos blancos, proteínas totales y plaquetas.
Además, se recogieron muestras de plasma en los animales tratados con rhEGF- NLC y rhEGF libre para evaluar la absorción sistémica de rhEGF. La detección de rhEGF se realizó mediante ELISA (human EGF ELISA development kit, PeproTech). Las muestras se recogieron cuando se esperaba que los niveles de rhEGF en plasma fuesen más altos. Por ello, las muestras de los animales tratados con rhEGF-NLC se recogieron el día 1 del experimento (antes de la administración del tratamiento), 4 y 12 horas tras la administración. Las muestras de plasma de los animales tratados con rhEGF libre se obtuvieron justo tras la administración y 30 minutos después de la primera dosis.
6.5. - Análisis seriado de las heridas cicatrizadas
La cinética de cicatrización se determinó midiendo el cierre de la herida (porcentaje inicial de la herida cerrada) los días 1 , 15, 25, 36 y 43. El área de la herida se determinó, de forma estandarizada, tomando fotos perpendiculares en la superficie de la herida, usando la misma iluminación y colocando una regla plástica estéril junto a las heridas con el objetivo de introducir una referencia métrica en las imágenes que permitiese su posterior procesado. El área de la herida se calculó utilizando el software ImageJ (ver sección 5.3). Las heridas se consideraron cicatrizadas cuando presentaron un cierre superior al 95%. 6.6.- Evaluación histológica de cicatrización
Se recogieron biopsias de piel completa desde la zona central del área ulcerada al margen cicatrizado (2 mm), utilizando un escalpelo estéril. Las muestras recogidas fueron inmediatamente fijadas en 4% formaldehido, parafinadas y cortadas en capas de 5 μηι de espesor. Las muestras se tiñeron con hematoxilina-eosina para observación morfológica. Se tomaron biopsias el día 15 para las heridas 1 , 2 y 3, y el día 25 y 43 para todas las heridas. El día 36 se tomaron fotografías de las heridas pero no se recogieron biopsias para no retrasar la cicatrización.
La cicatrización se determinó teniendo en cuenta el grado de reepitelización, midiendo el nuevo epitelio formado, y la maduración de la herida y la calidad de cicatrización según el criterio de Cotran et al. (2000).
6.7.- Análisis hematológico
El análisis hematológico no reveló ningún cambio en ninguno de los parámetros estudiados a lo largo del estudio. Además, todos los valores obtenidos estaban dentro de los rangos normales para cerdos sanos (datos no mostrados).
Se recogieron muestras de plasma de los animales tratados con rhEGF-NLC y rhEGF libre para evaluar la absorción de rhEGF a la circulación sistémica cuando la rhEGF se esperaba que fuese más alta en plasma, ya que el uso sistémico de rhEGF ha sido limitado debido a la preocupación de crecimiento epitelial anormal.
Los días de la toma de muestra de plasma se seleccionaron en base a la vida media del EGF, la vía de administración y la liberación retardada del factor de crecimiento encapsulado en las rhEGF-NLC. A este respecto, puesto que el rhEGF incorporado en las rhEGF-NLC se esperaba que fuese absorbido más tarde que el rhEGF libre debido a la encapsulación, la muestra de plasma se realizó al día 1 del experimento, 4 horas y 24 horas tras la administración de rhEGF-NLC, en lugar de a los 30 minutos tras la administración, como se llevó a cabo en los animales tratados con rhEGF libre. Debido a las marcadas similitudes entre los humanos y los cerdos, se esperaban concentraciones similares de rhEGF plasmático. Como se ilustra en la Tabla 8, la concentración de rhEGF en plasma mostró valores de aproximadamente 0, claramente por debajo de la concentración de rhEGF basal humano (0.4 ng/ml). Este hecho es muy sorprendente porque la casi inexistencia de absorción sistémica, incluso cuando el rhEGF libre es inyectado directamente en la herida, puede minimizar los efectos secundarios, y por tanto, mejorar la seguridad del tratamiento y garantizar el efecto local del rhEGF en la lesión.
Tabla 8. Concentraciones de rhEGF plasmático. Los resultados se muestran como media ± D.E.
Concentración de rhEGF plasmático (ng/ml)
30 minutos 4 horas 24 horas rhEGF- NLC - 0.03 ± 0.01 0.01 ± 0.01 rhEGF libre 0.20 ± 0.01 - -
6.8. - Análisis seriado de las heridas cicatrizadas
La mejora en la cicatrización fue evaluada calculando el número de heridas cerradas en cada grupo experimental los días 15, 25, 36 y 43. Las mayores diferencias entre los grupos fueron encontrados a los 25 días del experimento. Tal y cómo se observa en la Figura 8, a los 15 días ninguna de las heridas había cerrado completamente. A los 25 días el porcentaje de heridas cerradas era significativamente superior en el grupo tratado con rhEGF-NLC que en el grupo tratado con NLC vacías. Además, es importante destacar que el tratamiento con rhEGF-NLC mostró una ligera mayor efectividad comparado con el rhEGF libre (50% y 40 % respectivamente). Aunque el porcentaje de heridas cerradas fuera similar en ambos grupos, estos resultados son particularmente significativos debido a que las heridas tratadas con rhEGF-NLC recibieron 2 administraciones tópicas semanales de 20 μg de rhEGF, mientras que aquellas heridas tratadas con rhEGF libre recibieron dosis superiores (75 μg dos veces por semana) administradas intralesionalmente. A los 36 días, casi todos los grupos habían cerrado completamente las heridas; las heridas tratadas con rhEGF (tanto con rhEGF-NLC y rhEGF libre) estaban completamente cerradas y las heridas tratadas con NLC vacías alcanzaron una cicatrización del 90%. Al final del estudio (a los 43 días) todas las heridas habían cerrado completamente.
6.9. - Estudio histológico de cicatrización de heridas 6.9. 1. - Grado de re-epitelización:
Tal y cómo se observa en la Figura 9A, a los 15 días la longitud del nuevo epitelio era significativamente superior en los animales tratados con 20 μg de rhEGF-NLC administrado tópicamente que en aquellas heridas tratadas con NLC vacías y en aquellas que recibieron 75 μg de rhEGF libre administrado intralesionalmente
(p<0.001). La mejora en la eficacia de re-epitelización de las rhEGF-NLC comparado con el rhEGF libre, sugiere que la nanoencapsulacion protege el factor de crecimiento frente al microambiente de la herida y reduce la inactivación que ejercen las proteasas y el estrés oxidativo del área de la herida. Esta protección puede ser la responsable de la mayor efectividad de las rhEGF-NLC que se ha observado en los estudios in vivo. Sin embargo, las diferencias entre los grupos no alcanzaron la significación estadística a los 25 y 43 días (Figura 9A), a pesar de que los valores medios obtenidos a los 25 días en aquellos animales tratados con rhEGF (libre o encapsulado) fueron superiores a los de las NLC vacías.
6.9.2. - Madurez de la herida y calidad de la cicatrización:
Debido a las dimensiones de las lesiones creadas, en una misma muestra histológica se pueden observar diferentes grados de cicatrización de acuerdo al criterio seguido por Cotran et al., 2000. Tal y cómo se observa en la Figura 10A, a los 15 días los animales tratados con rhEGF-NLC mostraron no solo una estadísticamente significativa menor extensión de tejido inflamatorios (Grado 2) comparado con aquellas heridas que habían recibido NLC vacías y rhEGF libre, sino que también mostraron una significativa mayor extensión de casi una completamente cicatrizada epidermis (Grado 4) (p<0.001). Por el contrario, las heridas tratadas con NLC vacías y rhEGF libre principalmente mostraron una inflamación aguda difusa con presencia de algunos neutrófilos polimorfonucleares, formación del tejido granulomatoso y neogénesis vascular (Grado 2).
A los 25 días, debido a que el proceso de cicatrización prosiguió en todos los grupos estudiados, la extensión del grado 2 fue significativamente menor que la observada a los 15 días y la extensión del grado 3 y 4 significativamente superior (p<0.001). Además, resulta destacable que a pesar de que a los 25 días no pudieran encontrarse diferencias en el grado de re-epitelización entre los grupos, existen diferencias en la madurez de la lesión y la calidad de la cicatrización (Figura 9A y Figura 10B). Los animales tratados con rhEGF-NLC mostraron un grado de cicatrización más cercano a la cicatrización completa que aquellos grupos que recibieron NLC vacías y rhEGF libre, los cuales todavía mostraban una inflamación crónica y un tejido granulomatoso rico en nuevos vasos y fibroblastos en proliferación.
Además, tal y cómo se muestra en la Figura 9B y Figura 10C a los 43 días todas las heridas de todos los grupos experimentales mostraron algo de inflamación crónica (grado 3 y 4). Sin embargo, las lesiones tratadas con rhEGF-NLC presentaron una mejora significativa en el grado de cicatrización y madurez de la herida (p<0.001).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Nanopartícula lipídica caracterizada por que comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico, y un factor de crecimiento.
2. Nanopartícula lipídica según la reivindicación 1 , donde el factor de crecimiento es el factor de crecimiento epidérmico.
3. Nanopartícula lipídica según la reivindicación 2, donde el factor de crecimiento epidérmico es factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (rhEGF).
4. Nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos un lípido líquido a temperatura ambiente.
5. Nanopartícula lipídica caracterizada por que comprende al menos un lípido sólido a temperatura ambiente, al menos un surfactante no iónico, y el péptido antimicrobiano de las catelicinas LL37.
6. Nanopartícula lipídica según la reivindicación anterior, que comprende además al menos un lípido líquido a temperatura ambiente.
7. Composición caracterizada por que comprende una nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y una nanopartícula lipídica según la reivindicación 5 ó 6.
8. Nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composición según las reivindicación 7, para su uso como medicamento.
9. Nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o composición según las reivindicación 7, para su uso para promover la cicatrización de heridas en un sujeto.
10. Nanopartícula lipídica o composición según la reivindicación anterior, donde las heridas se seleccionan del grupo formado por úlceras de pie diabético, úlceras por presión, úlceras vasculares, heridas isquémicas y sus combinaciones.
1 1. Composición farmacéutica que comprende una nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición según las reivindicación 7, y un vehículo farmacéutico aceptable.
12. Composición farmacéutica según la reivindicación anterior, para su uso como medicamento.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 11 , para su uso para promover la cicatrización de heridas en un sujeto.
14. Kit que comprende una nanopartícula lipídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o una composición según la reivindicación 7 y/o una composición farmacéutica según la reivindicación 1 1 , para promover la cicatrización de heridas.
15. Método para la preparación de una nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, que comprende las siguientes etapas:
(i) preparación de una solución acuosa que comprende un surfactante no iónico,
(ii) preparación de una solución lipofílica que comprende un lípido sólido a temperatura ambiente en un solvente orgánico,
(iii) añadir la solución acuosa (i) a la solución lipofílica (ii), sometiendo la mezcla resultante a sonicación hasta obtener una emulsión,
(iv) evaporar el solvente orgánico de la emulsión obtenida en (iii), y
(v) recoger las nanopartículas,
donde un factor de crecimiento o el péptido LL37 se añade a la solución (ii).
16. Método para la preparación de una nanopartícula lipídica según una cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 6, que comprende las siguientes etapas: (i) preparación de una solución acuosa que comprende un surfactante no iónico,
(ii) preparación de una solución lipofílica que comprende una mezcla de un lípido sólido y un lípido líquido fundida a una temperatura superior al punto de fusión del lípido líquido,
(iii) calentar la solución acuosa (i) a la misma temperatura que la solución lipofílica (ii)
(iv) añadir la solución acuosa (i) a la solución lipofílica (ii), sometiendo la mezcla resultante a sonicación hasta obtener una emulsión,
(v) enfriar la emulsión (iv) a 5°C±3°C para permitir la recristalización del lípido y la formación de la nanopartícula, y
(vi) recoger las nanopartículas,
donde el factor de crecimiento o el péptido LL37 se añade a la solución (ii).
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