CN105611916A - 用于愈合伤口的脂质纳米颗粒 - Google Patents

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戈尔卡·阿隆索霍尔内斯
安赫尔·德尔波索佩雷斯
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Abstract

本发明涉及包含生长因子和/或抗微生物脂质的脂质纳米颗粒，并且涉及一种用于制备它们的方法。本发明还涉及包含所述脂质纳米颗粒和药学可接受的载体的药物组合物。本发明进一步涉及所述药物组合物作为医药的用途以及所述药物组合物用于促进伤口愈合的用途，特别是通过局部给药。

Description

用于愈合伤口的脂质纳米颗粒
技术领域
本发明涉及脂质纳米颗粒以及它们作为伤口愈合用的药物组合物的用途，特别是作为局部施用的纳米颗粒悬浮液、敷料(dressing)或凝胶。
背景技术
慢性伤口治疗已成为世界范围内卫生保健系统的一个主要问题，代表了巨大的经济和公共卫生挑战。诸如人口老龄化、吸烟、糖尿病和肥胖等危险因素的现行增加会使伤口愈合过程复杂化和减慢，造成难以愈合的伤口。
包括高压氧(hyperbaricoxygen)、负压和手术清创的一些姑息疗法(palliativetreatments)目前正被用于治疗老年人的慢性伤口。此外，在市场上可以购得许多用于治疗慢性溃疡的商用合成敷料，虽然呈现出有限的治疗功效。
表皮生长因子(EGF)通过刺激细胞的迁移、分化和增殖并且还通过促进肉芽组织形成而在组织再生及修复中发挥重要作用。从临床角度看，EGF已经被用来增强伤口愈合，尤其是糖尿病足溃疡。临床试验中已经显示了低级神经性溃疡中局部EGF应用的有益效果的证据；但是，局部EGF制剂的效果可能被减弱，尤其是在高级伤口(high-gradewound)中，因为在这种类型的伤口中已经鉴定出增加的蛋白酶活性。Rengen-D150TM是一种在印度制造用于治疗I级或II级糖尿病溃疡的含有150μg/g重组人表皮生长因子(rhEGF)的凝胶。其需要每日给药两次，平均治疗时间为6周。一种含有75μgrhEGF的冻干制剂，通过病灶内注射(损伤内注射，intralesionalinjection)每周给药三次。其在在阿尔及利亚、阿根廷、哥伦比亚、古巴、多明尼加共和国和委内瑞拉销售。在20位糖尿病患者中进行的试验性研究证明，作为一种可行性和安全性治疗，在全厚溃疡患者中促进慢性伤口的愈合。然而，rhEGF的短半衰期需要连续暴露(至少6-12小时)以增强对上皮细胞有丝分裂的影响。因此，为了在伤口愈合中取得显著疗效，在剂量、递送系统和安全方面，需要优化生长因子如rhEGF的给药。为了这个目的，Chuetal.,2010(Nanotechnologypromotesthefull-thicknessdiabeticwoundhealingeffectofrecombinanthumanepidermalgrowthfactorindiabeticrats”,WoundRepairRegen2010；15:499-505)已经开发出了一种制备具有2％rhEGF含量的聚合物聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒的方法。rhEGF的封装(囊封，encapsulation)效率为85.6％并且提供长达24小时的生物活性rhEGF的受控释放。与未封装的rhEGF相比，在糖尿病大鼠中诱导的全厚伤口(full-thicknesswound)上每日一次局部施用这些纳米颗粒促进了较高的成纤维细胞增殖水平和最快的愈合速率。
此外，专利EP1987817B1要求保护一种生产含有rhEGF的聚合物微球的方法，该聚合物微球用于病灶内(intralesional)浸润到糖尿病患者的下肢中以预防糖尿病截肢。所开发的具有1.6-2.4％rhEGF含量的微球显示出每天5和10μg的rhEGF受控释放，持续14天，并且与等效量的非封装rhEGF相比，在人体中加快了损伤愈合。
令人惊奇的是，本发明人们已经开发出了具有高封装效率的包含表皮生长因子的脂质纳米颗粒，其以每周两次的局部制剂进行应用，改善了伤口愈合。
发明内容
根据一个方面，本申请涉及一种脂质纳米颗粒(本发明的纳米颗粒)，其包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂、和一种生长因子。
根据进一步的方面，本申请涉及一种用于制备本发明的脂质纳米颗粒的方法，其特征在于包含下列步骤：
(i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
(ii)制备包含处于有机溶剂中的在室温下为固体的脂质的亲脂性溶液，
(iii)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理(sonication)，直到获得乳状液(乳液，emulsion)，
(iv)蒸发(iii)中获得的乳状液中的有机溶剂，和
(v)收集脂质纳米颗粒，
其中，生长因子被加入到溶液(ii)中。
根据进一步方面，本申请涉及一种药物组合物(本发明的药物组合物)，其包含本发明的脂质纳米颗粒以及药物载体。
根据进一步的方面，本申请涉及本发明的脂质纳米颗粒以及涉及包含该脂质纳米颗粒的药物组合物，其作为医药的用途以及其在促进伤口愈合中的用途。
从以下说明以及随附的权利要求书中，本申请的其它目的、特征、优点和方面将变得对本领域技术人员显而易见。
附图说明
图1显示了加载有rhEGF的脂质纳米颗粒对细胞增殖的体外效应的图示。
图2显示了尼罗红-SLN制剂和尼罗红-NLC制剂的细胞摄取的显微照片。
图3显示了(A)加载有rhEGF-的SLN和(B)加载有rhEGF-的NLC对伤口闭合的体内效应的图示，和(C)未处理的对照大鼠以及使用空SLN、空NLC、rhEGF-MS、对照空MS、游离rhEGF、rhEGF-SLN20μg、rhEGF-SLN10μg、rhEGF-NLC20μg、rhEGF-NLC10μg处理的大鼠中的伤口照片。数据显示为平均值±标准偏差(S.D.)，*显著大于未经处理的对照(*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001)；■显著大于空MS对照(■p<0.05、■■p<0.01和■■■p<0.001)；●显著大于空SLN(●p<0.05、●●p<0.01和●●●p<0.001)；▼显著大于空NLC(▼p<0.05、▼▼p<0.01和▼▼▼p<0.001)；○显著大于游离rhEGF(○p<0.05、○○p<0.01和○○○p<0.001)；◇显著大于rhEGF-MS75μg(◇p<0.05、◇◇p<0.01和◇◇◇p<0.001)；▲显著大于rhEGF-SLN10μg(▲p<0.05、▲▲p<0.01和▲▲▲p<0.001)。
图4显示了加载有rhEGF的脂质纳米颗粒在炎症评分(A,C)和在再上皮化评分(B,D)上的体外效应的图示。数据显示为平均值±S.D.。*显著大于未处理的对照(*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001)；■显著大于对照空MS(■p<0.05、■■p<0.01和■■■p<0.001)；●显著大于空SLN(●p<0.05、●●p<0.01和●●●p<0.001)；▼显著大于空NLC(▼p<0.05、▼▼p<0.01和▼▼▼p<0.001)；○显著大于游离rhEGF(○p<0.05、○○p<0.01和○○○p<0.001)；◇显著大于rhEGF-MS75μg(◇p<0.05、◇◇p<0.01和◇◇◇p<0.001)；▲显著大于rhEGF-SLN10μg(▲p<0.05、▲▲p<0.01和▲▲▲p<0.001)。
图5显示了SLN-尼罗红、NLC-尼罗红和石蜡-尼罗红的皮肤摄取的显微照片(A)和图示(B)(任意像素亮度值(ABU)，在角质层、表皮和真皮中校正背景荧光)。*显著大于石蜡-尼罗红(*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001)。插入数值给出了相对于石蜡霜(paraffincream)(PEE)的相应渗透增强。
图6显示了加载有LL37的脂质纳米颗粒对细胞增殖的体外效应的图示。
图7显示了rhEGF和LL37的组合对细胞增殖的体外效应的图示。
图8显示了(A)在第15、25、36和43天，空NLC、游离rhEGF和rhEGF-NLC20μg对猪中的伤口闭合的体内效应的图示，和(B)使用空NLC、游离rhEGF和rhEGF-NLC20μg处理的猪中的伤口照片。
图9显示了(A)在第15、25和43天，不同研究组(空NLC、游离rhEGF和rhEGF-NLC20μg)中上皮长度的图示，和(B)在第15、25和43天，伤口的组织学图像。数据显示为平均值±S.D.。***显著大于空NLC和游离rhEGF(p<0.001)。
图10显示了在第15(A)、25(B)和43(C)天，伤口愈合延伸(mm)的图示。数据显示为平均值±S.D.。相比于空NLC和游离rhEGF组，***p<0.001。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及一种脂质纳米颗粒，其特征在于包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂、和一种生长因子。
必须指出的是，如在本申请中使用的单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。
在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒是指具有固体基质的纳米范围的颗粒。所述基质由在室温下为固体的脂质组成，所述脂质在体温下也为固体。在固体脂质纳米颗粒(SLN)的情况下，所述基质仅由固体脂质组成。在纳米结构的脂质载体(NLC)的情况下，所述基质由固体脂质与液体脂质(油)的共混物组成，但是这种共混物在室温下也为固体并且在体温下也为固体(Mulleretal.,2002,Solidlipidnanoparticles(SLN)andnanostructuredlipidcarriers(NLC)incosmeticanddermatologicalpreparations.AdvancedDrugDeliveryReviews54(1)S131-S155)。术语“加载有生长因子”是指嵌入或封装在纳米颗粒基质中的生长因子。因此，在一个特定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒是SLN并且在另一个特定的实施方式中，所述脂质颗粒是NLC。因此，在一个特定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒是SLN或NLC。
在一个特定的实施方式中，所述生长因子选自于由属于表皮生长因子(EGF)家族、转化生长因子β(TGF-β)家庭、成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板衍生生长因子(血小板源性生长因子，platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子-α家族(TNFα)和胰岛素样生长因子(IGF)的生长因子组成的组。优选地，所述生长因子属于表皮生长因子(EGF)家族，并且更优选地，所述生长因子是表皮生长因子(EGF)。在一个特定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒是加载有EGF的SLN(在下文中也称为EGF-SLN)和/或加载有EGF的NLC(在下文中也称为EGF-NLC)。在本发明的特定实施方式中，所述表皮生长因子是重组人表皮生长因子(rhEGF)。所述rhEGF可以商业获得(Peprotech、Promega、Pharmchem等)或者通过重组DNA技术来生产，如在例如Marioka-Fujimotoetal.(ModifiedenterotoxinsignalsequencesincreasesecretionleveloftherecombinanthumanepidermalgrowthfactorinEscherichiacoli.JBiolChem.1991Jan25；266(3):1728-32)中所描述的，或在专利申请WO91/18999A1中所描述的。在一个特定的实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒具有的生长因子(特别是EGF)的比例相对于脂质纳米颗粒的总重量为0.01重量％至20重量％，优选0.1重量％至10重量％，并且更优选地相对于脂质纳米颗粒的总重量为0.5重量％至5重量％。
如上所述，本发明的脂质纳米颗粒包含至少一种在室温下为固体的脂质。在本发明的上下文中，“在室温下为固体的脂质”应理解为在45℃下为固体的脂质，可以是饱和的或不饱和的。所述定义包括甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、脂肪酸、类固醇和蜡。同样地，可以使用这些脂肪酸的衍生物，该衍生物应理解为由酸基团与醇或胺反应所产生的那些化合物，诸如例如所述脂肪酸的酯类或酰胺类。因此，在一个特定的实施方式中，所述在室温下为固体的脂质选自于酰基甘油酯、具有至少10个碳原子的链的饱和脂肪酸或其衍生物以及其混合物。在一个优选的实施方式中，所述酰基甘油酯选自于棕榈酸硬脂酸甘油酯(AT05)、单硬脂酸甘油酯(900)和山嵛酸甘油酯(888ATO)。在更优选的实施方式中，所述脂质组分是棕榈酸硬脂酸甘油酯(AT05)。
在本发明一个特定的实施方式中，所述脂质纳米颗粒具有的固体脂质的比例相对于该脂质纳米颗粒的总重量为1重量％至40重量％，优选5％至15％。
如上所述，本发明的脂质纳米颗粒还包含非离子表面活性剂。术语“非离子表面活性剂”应理解为具有疏水性和亲水性部分的化合物，其能够产生乳状液。在本发明的一个特定实施方式中，所述非离子表面活性剂选自于聚山梨醇酯、聚乙二醇共聚物和聚丙二醇共聚物、以及它们的混合物。在一个特定的实施方式中，所述非离子表面活性剂选自于由吐温、司盘(Span)、泊洛沙姆(Poloxamer)和它们的混合物组成的组。在一个优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂是吐温80，并且在另一个优选的实施方式中，所述非离子表面活性剂是吐温80和泊洛沙姆的混合物。
在本发明的一个特定实施方式中，非离子表面活性剂的比例相对于脂质纳米颗粒的总重量为0.01重量％至10重量％，优选0.05％至5重量％。
在本发明的一个特定实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒包含1％～40％在室温下为固体的脂质、0.01％～10％非离子表面活性剂、和0.01％～20％生长因子，所有给出的百分比均相对于该脂质纳米颗粒的总重量按重量计。
在一个特定的实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒可以任选地提供为冻干的或干燥的(desiccated)产品。
在第二方面，本发明涉及第一方面的脂质纳米颗粒，其进一步包含在室温下为液体的脂质。在本发明的上下文中，“在室温下为液体的脂质”应理解为在室温下并且在低于45℃下为液体的脂质，其可以是饱和的或不饱和的。在室温下为液体的脂质选自于不饱和的或饱和的脂肪酸酯、油、脂肪酸以及链的甘油三酸酯(具有少于10个碳原子)、以及它们的混合物(例如，辛酸和癸酸的甘油三酯大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、蓖麻油)。在一个优选的实施方式中，将用作液体脂质。在一个优选的实施方式中，所述脂质纳米颗粒的脂质组分是棕榈酸硬脂酸甘油酯(AT05)与辛酸和癸酸的甘油三酯的组合。在本发明第二方面的另一个变型中，当将在室温下为液体的脂质加入到所述纳米颗粒中时，其比例相对于脂质纳米颗粒的总重量为1～30重量％，优选5～15重量％。在另一个实施方式中，比例固体脂质:液体脂质为0.5:10至5:10。
在本发明的第三方面，本发明涉及一种用于制备在上述段落中定义的本发明第一方面的脂质纳米颗粒的方法(本发明的方法1)，其特征在于包含下列步骤：
(i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
(ii)制备包含处于有机溶剂中在室温下为固体的脂质的亲脂性溶液，
(iii)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液，
(iv)蒸发(iii)中获得的乳状液的有机溶剂，和
(v)收集纳米颗粒，
其中，生长因子被加入到溶液(ii)中。
使用这种方法1获得的脂质纳米颗粒是SLN。所述第一步(i)由将非离子表面活性剂溶解于水性溶液优选水中组成。制备亲脂性溶液的第二步(ii)通过将在室温下为固体的脂质溶解于有机溶剂中来进行，其中所述固体脂质的比例相对于有机溶剂的总重量为至少1重量％。将生长因子，优选EGF，且更优选rhEGF，与脂质一起溶解于所述有机溶剂中。有机溶剂的选择在很大程度上取决于脂质组分。在本发明的一个特定的实施方式中，所述有机溶剂选自于二氯甲烷、丙酮、氯仿和它们的混合物，更优选二氯甲烷。
一旦制备了两种溶液，即将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中。然后，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液。随后，通过本领域技术人员已知的任何方法蒸发有机溶剂。在一个特定的实施方式中，所述有机溶剂蒸发步骤是通过将乳状液在机械搅拌下保持至少60分钟，优选至少120分钟来进行的。在除去有机溶剂之后，亲脂性溶液凝固，并且获得纳米颗粒悬浮液，然后通过离心过滤。最后，洗涤所收集的脂质纳米颗粒并且将其再悬浮于纯化水中。
在本发明的第四方面，本发明涉及一种用于制备在上述段落中定义的本发明第二方面的脂质纳米颗粒的方法(本发明的方法2)，其特征在于包含下列步骤：
(i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
(ii)制备亲脂性溶液，其包含固体脂质与液体脂质的共混物，该共混物在高于该液体脂质的熔点的温度下熔融，
(iii)将水性溶液(i)加热至与亲脂性溶液(ii)相同的温度，
(iv)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液，
(v)将乳状液(iv)在5℃±3℃冷却以使得脂质再结晶并且形成纳米颗粒，和
(vi)收集纳米颗粒，
其中，生长因子被加入到溶液(ii)中。
使用这种方法2获得的脂质纳米颗粒是NLC。第一步(i)由将非离子表面活性剂溶解于水性溶液优选水中组成。制备亲脂性溶液的第二步(ii)通过在高于液体脂质的溶点的温度下熔融固体脂质和液体脂质的共混物来进行。生长因子，优选EGF并且更优选rhEGF，与脂质共混物一起溶解。
一旦将水性溶液(i)加热到已经熔融脂质共混物的温度，即将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中。然后，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液。随后，在5℃±3℃的温度下将乳状液(iv)冷却以允许脂质再结晶和纳米颗粒形成。在脂质再结晶之后，获得纳米颗粒悬浮液，通过离心将其过滤。最后，洗涤收集的脂质纳米颗粒并且再悬浮于纯化水中。
第五方面涉及通过方法1获得的脂质纳米颗粒和通过方法2获得的脂质纳米颗粒。
本发明的第一、第二和第五方面的脂质纳米颗粒的特征在于，具有等于或小于1μm的平均颗粒尺寸，它们优选具有处于1nm和1000nm之间的平均尺寸，更优选150nm～400nm。所述平均尺寸可以通过本领域技术人员众所周知的标准方法来测量，并且其被描述于例如以下实验部分中(表1、实施例2)。此外，所述脂质纳米颗粒可以具有表面电荷(通过Z电势测量)，其大小可以为-50mV至+80mV(表1，实施例2)。另外，所述脂质纳米颗粒具有大于40％的封装效率，特别地对于SLN大于70％，并且对于NLC大于95％(表1，实施例2)。
本发明的脂质纳米颗粒的一个重要特征是，它们以持续释放的方式释放所加载的生长因子。加载有生长因子的脂质纳米颗粒提供的释放曲线的特征在于：与表面相关蛋白的百分比有关的初始释放(突发释放(爆发释放，burstrelease))，随后是4小时至24小时的快速释放阶段，最后是24小时至72小时的较慢释放，以释放全部量的生长因子为终止(表3，实施例2)。
这种持续释放特征提供了一个重要的优势，因为与使用游离EGF的那些相比使得治疗更加安全，使用游离EGF的治疗需要持续给药生长因子和更高的剂量以实现相同的治疗效果。此外，通过降低剂量，可以进一步减少不期望的不良副作用，因为给药更高剂量的生长因子不再是必要的，原因在于以较小但更有效的剂量随着时间推移而释放封装的生长因子。最后，生长因子的持续释放允许减少给药的次数，提高患者治疗依从性，并进而提高患者生活质量。
本发明人惊奇地发现，本发明的脂质纳米颗粒，即加载有EGF的脂质纳米颗粒，与游离EGF相比，显示出预料不到的更大的成纤维细胞体外增殖速率(实施例3，第3.1节，图1)。另外，本发明的脂质纳米颗粒，即EGF-SLN和EGF-NLC，能够进入细胞(实施例3，第3.2节，图2)。
有趣的是，体内研究显示，与在4次病灶内施用中给药的300μgrhEGF相比，在伤口闭合(图3.A、C)、炎症解决(图4.A)和再上皮化过程(图4.B)方面，以10和20μg剂量rhEGF的4次局部给药rhEGF-SLN进一步改善了伤口愈合。另外，体内研究显示，与在4次病灶内施用中给药的300μgrhEGF相比，在伤口闭合(图3.B、C)、炎症解决(图4.C)和再上皮化过程(图4.D)方面，以10和20μg剂量rhEGF的4次局部给药rhEGF-NLC进一步改善了伤口愈合。另外，获得的数据表明，与一病灶内剂量75μg的聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)微球rhEGF-MS相比，在伤口闭合方面，在研究的8天和11天后，封装于SLN和NLC中的20或10μgrhEGF大幅度提高了伤口愈合过程。因此，与常见的可生物降解和水解降解的聚合物诸如PLGA的使用相比，将脂质用作纳米颗粒用的基质材料是有利的，因为脂质纳米颗粒允许脂质纳米颗粒中加载的分子的局部给药。
此外，实施例6(图8-10)所示的体内研究显示，区域和局部给药rhEGF-NLC能够增强伤口愈合，这不仅仅是在伤口愈合速度和愈合的伤口数目(伤口闭合测量)方面，而且还在以新生成的微血管、成纤维细胞迁移、胶原沉积和炎症反应的演化为基础的愈合质量方面。此外，这些结果是非常相关的，因为与使用病灶内给药75μg游离rhEGF治疗的损伤相比，使用20μg局部给药的rhEGF-NLC治疗的动物显著增强了愈合。这些数据与来自封闭伤口和再上皮化的百分比数据一起，表明将rhEGF纳米封装为rhEGF-NLC允许局部给药，并且允许降低剂量，因为封装防止了生长因子在伤口位置处降解。
在趣的是，与石蜡霜相比，EGF-SLN和EGF-NLC显示出改善的皮肤渗透能力(实施例3，第3.4节，图5)。这是一个重要的优势，因为这允许局部给药加载于脂质纳米颗粒中的分子。
因此，本发明的第六方面涉及一种药物组合物，其包含如任何上述段落中所描述的在本发明的第一、第二和第五方面中定义的本发明的脂质纳米颗粒、以及药物载体。在这方面的优选实施方式中，所述药物组合物是局部给药的。其可以凝胶、乳膏、软膏、敷料或作为贴剂的形式进行给药。因此，在一个特定的实施方式中，所述药物组合物进一步包含胶原蛋白、透明质酸、芦荟(aloevera)、纤维蛋白、聚合物和纤维素衍生物。
另外，本发明的第七方面涉及在任何上述段落中描述的本发明第一、第二和第五方面中定义的脂质纳米颗粒，其作为医药的用途。另外，在第八方面，本发明涉及在第六方面中定义的药物组合物，其作为医药的用途。
考虑到上述的体内结果，本发明的另一方面，本发明的第九方面，涉及任何上述段落中描述的本发明第一、第二和第五方面定义的脂质纳米颗粒，其在受试者中促进伤口愈合的用途。优选地，其涉及加载有EGF的SLN，其在受试者中促进伤口愈合的用途，并且涉及加载有EGF的NLC，其在受试者中促进伤口愈合的用途。另外，在第十方面，本发明涉及第六方面定义的药物组合物，其在受试者中促进伤口愈合的用途。如本文中使用的术语“受试者”是指任何脊椎动物，优选哺乳动物，并且更优选人类。在本发明的上下文中，伤口是指慢性伤口、难以愈合伤口、缺血性伤口(ischemicwound)和烧伤。在一个特定的实施方式中，所述伤口选自包含慢性伤口、缺血性伤口、烧伤和它们的组合的组。优选的慢性伤口选自于由糖尿病足溃疡、压迫性溃疡、血管溃疡和它们的混合组成的组。
在本发明的上下文中，慢性伤口被定义为这样的伤口，其历时三个月未能通过有序和及时的修复过程以恢复解剖和功能的完整性。所有的伤口类型都有可能成为慢性，并因此，传统上慢性伤口在病因学上分为三类：压力、糖尿病和血管溃疡(静脉和动脉性溃疡)。压力性溃疡被定义为，由于压力或剪切和/或这些的组合，对皮肤上和/或下层组织局部损坏的区域，通常在骨性突出上。糖尿病足溃疡是糖尿病患者最令人担心的并发症之一，由于其对患者生活质量的影响很高，并且由于各种因素的影响而出现，诸如足骨结构的构造的机械变化、周围神经病变(受损的神经)和周围血管疾病(动脉阻塞)，所有这些都以较高的频率和强度在糖尿病人群中发生。血管性溃疡通常在下肢局部发现。绝大多数血管性溃疡是慢性或复发性的。它们在患有周围血管疾病的患者中引起相当大的发病率。动脉或缺血性伤口是由下肢灌注不良引起的。缺血限制营养物质和氧气的供应、杀死组织和使该区域形成开放的伤口。到伤口部位的血流量减少严重损害愈合反应，产生可导致坏疽的慢性伤口并因此导致截肢。最后，难以愈合伤口的特征是，炎性细胞的慢性持续性、细胞外基质的无序合成与重塑、以及缺乏再上皮化；并且烧伤是由热、火、辐射、阳光、电或化学品作用引起的对皮肤的损伤。
本发明人惊奇地发现，EGF和cathelicidin(一种抗菌肽)抗微生物肽LL37的组合，分别与游离EGF和游离LL37相比，显示出了预料不到的更大的细胞增殖(实施例4，图7)。LL37肽对应于人cathelicidin抗微生物蛋白hCAP18的C-末端片段，hCAP18是先天免疫系统的组分并且具有广谱抗微生物活性(Heilbornetal.,2003,ThecathelicidinantimicrobialpeptideLL37isinvolvedinre-epithelizationofhumanskinwoundsandislackinginchroniculcerepithelium.JInvestDermatol120(3):379-389)。因此，本发明的第十一方面涉及一种组合物(本发明的组合物)，其包含：根据本发明第一方面、第二方面和第五方面所述的脂质纳米颗粒以及包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂和LL37肽的脂质纳米颗粒。在该方面的一个特定实施方式中，所述组合物包含加载有EGF的NLC和加载有LL37的NLC。在另一个特定的实施方式中，所述组合物包含加载有EGF的SLN和加载有LL37的SLN。在该方面的另一特定实施方式中，在本发明的组合物中，加载有生长因子(优选加载有EGF)的脂质纳米颗粒与加载有LL37的脂质纳米颗粒的比率为1:17至1:34。在另一个特定实施方式中，所述组合物包含15ng/ml加载有EGF的脂质纳米颗粒以及0.25～5μg/ml加载有LL37的脂质纳米颗粒。
本发明第十二方面是一种药物组合物，其包含在上一段落中描述的本发明第十一方面的组合物、以及药物载体。在本方面的优选实施方式中，所述药物组合物是局部给药的。因此，在一个特定的实施方式中，所述药物组合物进一步包含胶原蛋白、透明质酸、芦荟、纤维蛋白、聚合物和纤维素衍生物。
此外，本发明的第十三方面涉及第十二方面的药物组合物，其作为医药的用途。
本发明的第十四方面，涉及第十二方面中定义的药物组合物，其在受试者中促进伤口愈合的用途。
本发明的第十五方面，涉及一种脂质纳米颗粒，其包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂和LL37肽。通过将生长因子或EGF替换为LL37肽，本发明第一方面描述的特定实施方式适用于第十五方面的加载有LL37的脂质纳米颗粒。
本发明的第十六方面，涉及第十五方面的脂质纳米颗粒，其进一步包含在室温下为液体的脂质。通过将生长因子或EGF替换为LL37肽，本发明第二方面中描述的特定实施方式适用于本方面的加载有LL37的脂质纳米颗粒。
本发明的第十七方面，涉及一种用于制备根据本发明第十五方面所述的脂质纳米颗粒的方法(下文中为方法3)，其特征在于，具有相同于本发明第三方面中描述的方法1的步骤，但是其中，代替生长因子，向亲脂性溶液(ii)中加入LL37肽。通过将生长因子或EGF替换为LL37肽，为本发明第三方面所述的方法1描述的特定实施方式适用于方法3。
本发明的第十八方面，涉及一种用于制备根据本发明第十六方面所述的脂质纳米颗粒的方法(下文称为方法4)，其特征在于，具有相同于本发明第四方面中所描述的方法2的步骤，但是其中，代替生长因子，向亲脂性溶液(ii)中加入LL37肽。
本发明的第十九方面，涉及可通过方法3获得的脂质纳米颗粒和可通过方法4获得的脂质纳米颗粒，所述方法3和方法4分别描述于第十七方面和第十八方面中。
关于LL37，这种肽可以使用自动化肽合成仪和用于肽合成的标准方法来合成。另外，其可以商业获得，例如从Sigma-Aldrich。LL37具有的氨基酸序列为SEQIDNO1(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)。
本发明的加载有LL37的脂质纳米颗粒的重要特征是，它们以持续释放的方式释放所加载的LL37。加载有LL37的脂质纳米颗粒提供的释放曲线的特征在于：与表面相关肽的百分比有关的初始释放(突发释放)、随后是4小时至24小时的快速释放阶段、24小时至72小时的较慢阶段，结束时释放总量的LL37(表4，实施例2)。
令人惊奇的是，本发明人证明，与游离LL37相比，加载有LL37的脂质纳米颗粒具有预料不到的更大的成纤维细胞体外增殖速率(实施例3，第3.3节，图6)。因此，本发明的第二十方面涉及本发明的第十五、十六和十九方面的加载有LL37的脂质纳米颗粒，其作为医药的用途。
本发明第二十一方面，涉及本发明第十五、十六和十九方面的加载有LL37的脂质纳米颗粒，其在受试者中促进伤口愈合的用途。
本发明第二十二方面，涉及一种药物组合物，其包含本发明第十五、第十六和第十九方面的加载有LL37的脂质纳米颗粒以及药学上可接受的载体。在本方面的优选实施方式中，所述药物组合物是局部给药的。因此，在一个特定的方面，所述药物组合物进一步包含胶原蛋白、透明质酸、芦荟、纤维蛋白、聚合物和纤维素衍生物。
在第二十三方面，本发明还涉及第二十二方面的药物组合物，其作为医药的用途。
本发明的第二十四方面涉及第二十二方面定义的药物组合物，其在促进伤口愈合中的用途。
最后，本发明的第二十五方面涉及一种试剂盒，其包含本发明第一、第二、第五、第十五、第十六和第十九方面所描述的脂质纳米颗粒的任何一种或它们的混合物。此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含一种药物组合物，该药物组合物是根据本发明的第六、第十二和第二十二方面所描述的药物组合物的任何一种。
下列实施例用来进一步阐明本发明，并且用来为本领域普通技术人员提供本文的脂质纳米颗粒是如何制备和评价的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明的范围。在所述实施例中，除非另有明确说明，量和百分比按重量计，温度单位为摄氏度或为环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例
实施例1：脂质纳米颗粒的制备
通过基于乳化-超声的方法来制备SLN和NLC(Mulleretal.,2002；Cheetal.,2010(Effectsoflipophilicemulsifiersontheoraladministrationoflovastatinfromnanostructuredlipidcarriers:Physicochemicalcharacterizationandpharmacokinetics.EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics74,474-482)。
在加载有rhEGF的SLN的情况下，将10ml1％(v/v)吐温80水溶液加入到2ml含有0.1％(w/v)商业rhEGF和10％(w/w)ATO5的二氯甲烷溶液中。紧接着，在50W(250超声波仪,CT,USA)下将混合物乳化30秒。该步骤产生o/w乳状液，然后将其搅拌2小时以提取有机溶剂并且获得颗粒硬化。然后使用具有100kDa孔尺寸离心过滤器单元(Ultra,Millipore,Spain)在2500rpm离心10分钟以收集SLN，并且使用miliQ水洗涤三次。最后，向水性溶液中加入相对于ATO5为15％的作为冷冻保护剂的海藻糖。
关于加载有rhEGF的NLC的制备，将在40℃下加热1分钟的0.67％(w/v)泊洛沙姆和1.33％(w/v)吐温80的温水性溶液，倒入到200mg也在40℃下加热1分钟的含有2mg商业rhEGF和20mgMiglyol的基于熔融ATO5的混合物中。然后在50W(250超声波仪，CT,USA)下将所得到的共混物乳化15秒，并且在4℃下存储12小时，再结晶所述脂质，以允许NLC形成。最后，收集颗粒，洗涤并且如先前所描述的进行冻干。SLN和NLC中的rhEGF的目标负载为1％(w/w)。
如分别为加载有rhEGF的SLN和加载有rhEGF的NLC所描述的，但是代替rhEGF，使用合成的(Sigma-Aldrich94261)或重组LL37肽，制备加载有LL37的SLN和加载有LL37的NLC。
实施例2：脂质纳米颗粒的表征
2.1.－通过光子相关光谱法测量平均尺寸(z-平均)和多分散指数(PI)。在纳米颗粒冻干之前和之后，每次检测各进行三次。通过多普勒测速仪(Dopplervelocimetry)(LDV)确定Zeta电位(ζ)。使用Zetasizer3000仪器(MalvernInstruments，Worcestershire，UK)评估所有上述测量。通过扫描电子显微镜(SEM；JSM-35CF)和透射电子显微镜(TEM)确定表面外观和球体形态。
2.2.－通过测量由用来收集SLN和NLC的过滤/离心技术除去的游离rhEGF和游离LL37(未封装的)，间接地计算封装效率(EE)。使用含有0.05％(v/v)、吐温20和0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)溶液将每个样品稀释1:10000。使用市售的用于人EGF(人EGFELISA开发试剂盒,Peprotech)和用于人LL37(人LL-37ELISA开发试剂盒,Hycultbiotech)的夹心酶联免疫吸附试验试剂盒，按照生产商的说明，估算游离rhEGF和游离LL37的量。采用以下等式评估封装效率(EE):
所有的测试均进行三次，并且结果报告为这些试验的平均值±S.D.。
表1.－加载有rhEGF的SLN和NLC的表征：
表2.－加载有LL37的SLN和NLC的表征：
如表1和表2所示的，在冷冻干燥之前和之后的所有制剂中，PDI值均小于0.5，确认了在所有情况下，制剂的粒度分布是均匀的。干颗粒的大小测量的重建并没有出现任何不便，表明除了尺寸增加，不存在颗粒融合或聚集。关于Zeta电位，两个制剂均表现出类似的表面电荷，约为-34mV。此外，ELISA测试表明，NLCEE稍微高于SLNEE。
在两个制剂中，纳米颗粒的表面光滑并且无孔。与此相反，SEM图像和TEM图像均表明，SLN在尺寸上比NLC更规则(数据未示出)。
2.3.－体外释放研究
通过在2ml0.02M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将32mg和23mgSLN或NLC(相当于～200μgrhEGF或LL-37)温育三天，以进行释放研究。在选定的时间间隔，通过过滤/离心除去释放介质并且替换为相同量的PBS。使用第2.2节中描述的方案通过ELISA检测rhEGF和LL37的量。
表3.－随时间释放的rhEGF的累积百分比
时间 从SLN累积释放的rhEGF 从NLC累积释放的rhEGF
30分钟 25.15±3.19 26.88±3.19
4小时 38.50±10.09 44.79±5.02
8小时 57.11±13.44 61.31±5.04
24小时 71.20±17.36 75.87±5.88
48小时 88.27±23.80 86.10±6.23
72小时 102.24±24.59 98.95±8.02
表4.－随时间释放的LL37的累积百分比
时间 从SLN累积释放的LL37 从NLC累积释放的LL37
30分钟 27.60±2.96 31.21±10.56
4小时 45.19±6.82 52.14±4.57
8小时 55.87±4.31 65.18±6.21
24小时 62.51±21.22 74.93±10.20
48小时 89.00±12.41 93.81±5.25
72小时 100.76±19.20 105.70±10.25
表3和表4分别展示了体外rhEGF和LL37释放曲线，表明两个制剂均提供了类似的释放行为。首先，与表面相关蛋白或肽的百分比有关的初始释放(突发释放)，随后是4小时至24小时的快速释放阶段，并且最后是24小时至72小时的较慢阶段，结束时释放全部量的rhEGF和LL37。
实施例3.－纳米颗粒的细胞增殖、细胞摄取和皮肤渗透
3.1.－加载有rhEGF的纳米颗粒对细胞增殖的影响
将24孔板用于增殖试验。将再悬浮于1ml完全培养基(completedculturemedium)(补充有10％FCS的DMEM)中的35000Balb/C3T3成纤维细胞接种于每个孔中。在温育8小时后，将培养基替换为1ml0.2％FCS补充的DMEM，并且将细胞温育过夜。然后，将培养基替换为1ml：(i)0.2％FCS-补充的DMEM，(ii)15ng/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的游离rhEGF，(iii)处于0.2％FCS-补充的DMEM的空SLN，(iv)15ng/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的加载有rhEGF的SLN(rhEGF-SLN)，(v)处于0.2％FCS-补充的DMEM中的空NLC和(vi)15ng/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的加载有rhEGF的NLC(rhEGF-NLC)。
在相同的条件下，将细胞培养24小时、48小时和72小时。实验进行三次。在不同培养时间间隔之后，向每个孔中加入100μlCCK-8(Sigma-Aldrich,SaintLouise,USA)(Zhou,Y.,Qian,M.,Liang,Y.,Liu,Y.,Yang,X.,Jiang,T.,Wang,Y.,2011.EffectsofLeukemiaInhibitoryFactoronProliferationandOdontoblasticDifferentiationofHumanDentalPulpCells.J.Endod.37,819-824)。在温育4小时之后，在作为参考波长的450nm和650nm下读取吸光度。所述吸光度与培养物中的活细胞数目成正比。
在Balb/c3T3细胞中进行的增殖试验表明了rhEGF的有丝分裂的效果。图1显示，在48小时和72小时之后，使用rhEFG(rhEGF-NLC、rhEGF-SLN和游离rhEGF)处理的组中的细胞增殖比对照组的大。显著地，与游离rhEGF相比，在Balb/C3T3成纤维细胞的有丝分裂效果上，封装在脂质纳米颗粒(SLN或NLC)中的rhEGF显示了更大的增加。
3.2.－加载有LL37的纳米颗粒对细胞增殖的影响
使用HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)，如第3.1节中描述的进行实验。所测试的组如下：(i)0.2％FCS-补充的DMEM，(ii)0.5和0.1μg/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的游离LL37，(iii)处于0.2％FCS-补充的DMEM中的空SLN，(iv)0.5和0.1μg/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的加载有LL37的SLN(LL37-SLN)，(v)处于0.2％FCS-补充的DMEM中的空NLC，(vi)0.5和0.1μg/ml处于0.2％FCS-补充的DMEM中的加载有LL37的NLC(LL37-NLC)以及(vii)10％DMSO作为阴性对照。
在HUVEC细胞上进行的增殖测试表明了LL37的有丝分裂效果。图6显示，在48小时之后，对于两个剂量，与对照组相比，使用LL37(LL37-NLC、LL37-SLN和游离LL37)处理的组中具有更大的细胞增殖。
3.3.－尼罗红-SLN和尼罗红-NLC制剂的细胞摄取
单独地将50000Balb/C3T3成纤维细胞和100000HaCaT角质形成细胞(keratynocite)在盖玻片上在完全培养基中培养24小时。然后，使用1ml测试培养基替换所述培养基。测试了下列组：(i)25μg在完全DMEM中的尼罗红-SLN，和(ii)25μg在完全DMEM中的尼罗红-NLC。在温育1小时后，洗涤细胞并且固定。然后，使用DAPI(500ng/ml)将细胞核染色并且将盖玻片安装在载片上用于在荧光显微镜中检查。
图2中给出了从细胞摄取研究中获得的结果。由于SLN和NLC的内在化作用，细胞胞浆(细胞质)变红(图2中的白色箭头)。该图显示了SLN-尼罗红和NLC-尼罗红进入细胞的能力。在SLN和NLC的摄取能力之间未观察到差异。
3.4.-SLN和NLC制剂的皮肤摄取
通过Küchleretal.,2009(Nanoparticlesforskinpenetrationenhancement–Acomparisonofdendriticcore-multishell-nanotransporterandsolidlipidnanoparticles.EurJPharmBiopharm.；71:243-250)所描述的，进行实验。将相同动物的皮肤用于治疗和对照实验。所测试的组为(n＝3)(i)SLN-尼罗红、(ii)NLC-尼罗红并且(iii)将尼罗红加载的石蜡霜用作参比。所有的制剂具有的尼罗红具有相同的浓度，0.004％。将皮肤在32℃下保持24小时。然后，使用PBS洗涤皮肤，使用冷冻显微切片机Frigocut2800N,Leica,Bensheim,Germany，干燥并且切割成20μm厚的垂直切片(底部至表面)。将切片存储在-20℃下并且在24小时内进行分析，然后经受正常光和荧光。
对于所有的实验，从染料摄取获得的校正的任意像素亮度值ABU与来自尼罗红加载的石蜡霜的摄取数据相关。对于所有皮肤层，计算称为渗透增强效应(PEE)的所得参数。按定义，石蜡霜的值为1(LombardiBorgia,S.,Regehly,M.,Sivaramakrishnan,R.,Mehnert,W.,Korting,H.C.,Danker,K.,Roder,B.,Kramer,K.D.,Schafer-Korting,M.,2005.Lipidnanoparticlesforskinpenetrationenhancement-correlationtodruglocalizationwithintheparticlematrixasdeterminedbyfluorescenceandparelectricspectroscopy.J.Control.Release110,151-163)。
图5中给出了由皮肤切片的校正任意像素亮度(ABU)值所估算的渗透增强效应(PEE)值。PEE值显示，SLN-尼罗红和NLC-尼罗红的染料渗透超过了在所有皮肤载片中使用石蜡霜发现的值。SLN-尼罗红和NLC-尼罗红的PEE值在角质层中增加了四倍(分别为4.74和4.62)并且在表皮中增加了约两倍(分别为2.09和2.03)。在真皮中也观察到了轻微但仍然经常显著增强的渗透(分别为1.29和1.32)。简而言之，超过1的ABU和PEE值表明了与石蜡霜相比的增强的SLN和NLC的皮肤渗透能力。另外，数据也反映了这些纳米颗粒将尼罗红递送至皮肤并由此递送rhEGF和LL37的能力。
实施列4.－rhEGF/LL37/组合rhEGF和LL37的体外增殖
如第3.1节中所描述的，进行实验。在Balb/C成纤维细胞和HaCat角质形成细胞中测试了LL37和rhEGF的协同效应。将24孔板用于增殖测试。将35000个再悬浮于1ml完全培养基(补充有10％FCS的DMEM)中的Balb/C3T3成纤维细胞接种于每个孔中。在温育8小时之后，将培养基替换为1ml0.2％FCS补充的DMEM并且细胞温育过夜。然后，将培养基替换为1ml：(i)0.2％FCS-补充的DMEM，(ii)15ng/ml游离rhEGF，(iii)5、0.5和0.25μg/mlLL37，(iv)15ng/mlrhEGF和5、0.5和0.25μg/mlLL37。在37℃和5％CO2气氛下将细胞培养24小时、48小时和72小时。
在HaCaT(人角质形成细胞)和Balb/C成纤维细胞中进行的增殖测试表明，在48小时之后，与单独的游离rhEGF相比，10和50ng/mlLL37以及15ng/mlrhEGF更高地增强了有丝分裂(图7)。
实施例5.－使用加载有rhEGF的SLN和加载有rhEGF的NLC的体内伤口愈合
针对两个不同的rhEGF制剂，测试了加载有rhEGF的SLN和加载有rhEGF的NLC的体内伤口愈合功效。(i)75μg冻干rhEGF(类似于商业化的)和(ii)使用欧洲专利申请EP12382476中描述的双乳液法，通过组合藻酸盐和聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，在我们的实验室中制备的封装于1％(w/w)加载聚合物微球中的rhEGF，75μg(rhEGF-MS75μg)。简要地，使用0.2ml含有0.05％(w/v)rhEGF、2.5％mg(w/v)人血清白蛋白(HSA)、0.25％(w/v)聚乙二醇400(PEG400)和2.5％(w/v)海藻酸钠MVG(PronovaUP,NovaMatrixFMCBioPolymer,Sandvika,Norway)的内部水相(在miliQ水中)，通过在50W下将2ml含有5％(w/v)PLGA(ResomerRG503)的二氯甲烷:丙酮(3:1)溶液超声处理15秒以进行乳化。将所得到的乳状液(w1/o)倒入到15ml含有5％聚乙烯醇(PVA)和5％NaCl的水性溶液中，并且使用桨式搅拌机乳化60秒以获得双乳液(doubleemulsion)(w1/o/w2)。最后，加入400ml5％NaCl和0.6mM氯化钙的水性溶液，并且搅拌30分钟。然后通过过滤收集微球并且冻干。
5.1.－动物
使用八十只8周龄的雄性db/db小鼠。遗传性糖尿病db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J)获自Javier实验室(SaintBerthevinCedex)。根据巴斯克地区大学的机构动物护理和使用委员会(theInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeoftheUniversityoftheBasqueCountry)批准的协议进行所有的程序。
5.2.－实验程序
通过改编由Michaelsetal.(2007)(db/dbmiceexhibitseverewound‐healingimpairmentscomparedwithothermurinediabeticstrainsinasilicone‐splintedexcisionalwoundmodel.WoundRepairandRegeneration15,665-670)使用的程序进行实验。将动物分成以下十组(n＝8)：(i)未治疗的对照组，(ii)75μg游离rhEGF，(iii)空MS，(iv)空SLN，(v)空NLC，(vi)rhEGF-MS75μg，(vii)rhEGF-SLN10μg，(viii)rhEGF-SLN20μg，(ix)rhEGF-NLC10μg和(x)rhEGF-NLC20μg。
用微量加样器将事先再悬浮于20μl赋形剂(vehicle)(0.5％处于0.9％盐水中的羧甲基纤维素)中的纳米颗粒局部给药一周两次，并且被允许在伤口床(woundbed)上传播。通过将针向下深入伤口中，一周两次病灶内给药再悬浮于0.5ml赋形剂中的游离rhEGF。在伤口诱导的当天，病灶内给药也再悬浮于0.5ml赋形剂中的rhEGF-MS75μg一次。
5.3.－伤口愈合评价
在手术当天以及在伤口诱导后的第4、8、11和15天，使用数字式照相机(LumixFS16,Spain)和图像分析程序(BiophotonicsFacility,UniversityofMcMaster,Canada)，通过测量伤口面积(cm2)来评价治疗改善伤口愈合的有效性(图3B)。将伤口闭合表达为初始伤口尺寸的面积百分比。
与其对照组(对于rhEGF-SLN组，其对照是游离rhEGF、空SLN和未治疗的对照；对于rhEGF-NLC组，其对照是游离rhEGF、空NLC和未治疗的对照；和对于rhEGF-MS75μg，其对照为游离rhEGF、空MS和未治疗的对照)相比，从第4天开始，所有的实验组(rhEGF-SLN20和10μg、rhEGF-NLC20和10μg以及rhEGF-MS75μg)提供了更大的伤口面积减少。在两个脂质纳米颗粒制剂(rhEGF-SLN和rhEGF-NLC)之间未发现统计学差异，相比之下，伤口收缩变得显著大于rhEGF-MS75μg和游离rhEGF(p<0.001)。关于对照组，rhEGF-MS75μg也显示出了统计学显著的伤口闭合。到第8天，在所有实验组和它们的对照之间，伤口收缩达到最大差异。再次，在rhEGF-SLN、rhEGF-NLC和rhEGF-MS75μg制剂之间未发现差异。有趣的是，在受伤11天后，与其它实验组(对于rhEGF-SLN10μg、rhEGF-NLC20和10μg，p<0.05，并且对于rhEGF-MS75μg，p<0.001)以及它们的对照组相比，使用rhEGF-SLN20μg治疗的动物显示显著进一步减少了伤口。然而，其它实验组也呈现伤口收缩，但较温和。在研究结束时，到第15天，来自使用所有脂质纳米颗粒制剂治疗的组的伤口几乎全部闭合。惊奇地，与脂质纳米颗粒相比，rhEGF-MS75μg呈现延迟伤口收缩(73.16±3.24％)(～95％)。还显著的是，与纳米配制的rh-EGF组相比，多个游离rhEGF给药在全部对照组之间表现出较少的差异。
表5.－伤口愈合
5.4.－伤口愈合的组织学估计
在第8天和第15天，通过CO2吸入杀死动物。切下伤口及周围组织(～1cm)并且在3.7％低聚甲醛中固定24小时。随后将固定的组织一分为二，包埋在石蜡中并且切割成5-μm厚的层。通过H&E染色处理样品以供形态学观察。
关于炎性恢复期(图4A)和伤口成熟，使用Cotranetal.(2000)描述的标度(Cotran,R.,Kumar,V.,Collins,T.,2000.Reparacióndelostejidos:regeneracióncelularyfibrosis.Patologíaestructuralyfuncional:McGrawHillInteramericana,2000,pp95-120)。以半定量技术在0～4的范围内确定每个伤口的评分。0：不存在炎症反应。1：急性炎症(形成纤维蛋白凝块和化脓性膜；白细胞和多核中性粒细胞的迁移)。2：弥漫性的急性炎症占主导地位(肉芽组织和化脓性膜占主导地位；血管新生)。3：慢性炎症占主导地位(成纤维细胞增殖)。4：消解和治疗(慢性炎症减少或消失，虽偶尔圆形细胞可能持续)。
根据Sinhaetal.(Sinha,U.K.,Gallagher,L.A.,2003.Effectsofsteelscalpel,ultrasonicscalpel,CO2laser,andmonopolarandbipolarelectrosurgeryonwoundhealinginguineapigoralmucosa.Laryngoscope113,228-236)确立的标准，测量再上皮化过程(图4B、D)。0：在伤口的边缘再上皮化。1：再上皮表覆盖小于伤口的一半。2：再上皮化覆盖多于伤口的一半。3：再上皮化以不规则的厚度覆盖整个伤口。和4：再上皮化以正常厚度覆盖整个伤口。
5.5.－统计分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差。基于方差齐性(homogeneityofvariances)的Levene检验结果，通过学生t检验或用于多重比较的单向ANOVA比较平均值。随后，应用Bonferroni或Tamhane事后检验(post-hoctest)。在p<0.05时，将差异认定为显著的。使用SPSS20.0(Inc.,Chicago,IL)进行计算。
到第8天，仅rhEGF-SLN20μg呈现了接近于完全消解(resolution)的慢性炎性状态，其中成纤维细胞增殖占主导(评分3.67±1.15)(表6)。使用rhEGF-NLC20μg治疗的动物，接近慢性状态的急性炎症状态几乎占主导，显示出较低的炎症评分(2.75±0.46)。然而，这些差异无统计学意义。此外，与它们的对照组相比，两个制剂均表现出显著更大的恢复。相反，rhEGF-SLN10μg和rhEGF-NLC10μg没有留下急性炎症状态(<2.00)；尽管如此，在这些组和未治疗对照组中发现了差异(p<0.001)，这显示不存在炎症反应。rhEGF-NLC10μg还表现出与其对照(空NLC)的差异(p<0.05)。
关于脂质纳米颗粒之间的剂量反应(20或10μg)的评价，仅rhEGF-SLN20μg表现出改善的消解(高于rhEGF-SLN10μg)。
组织病理学分析也显示，使用rhEGF治疗的伤口中弥漫性急性炎症状态占主导，炎症评分为2.13±0.64(显著地大于它们的对照组)。这些差异未达到与任何脂质微球的统计学显著性(无论是rhEGF-SLN还是rhEGF-NLC均未)。
如上所述，受伤15天后，差异倾向于降低，在任何组以及它们的对照之间未达到统计学显著性。
关于再上皮化等级，到第8天，获得的数据显示，只有使用脂质纳米颗粒以最高剂量(20μg)治疗的组以及使用rhEGF-MS75μg治疗的动物表现出覆盖多于伤口一半的新上皮(>2.00,与SinhaU.K.(2003)标准相关)。另外，在这些组和它们的对照组(对于rhEGF-SLN20μg，游离rhEGF、空SLN和未治疗的对照，以及对于rhEGF-NLC20μg，流离rhEGF、空NLC和未治疗的对照)之间发现了统计学显著差异(图5)。相比之下，使用脂质纳米颗粒以较低剂量的rhEGF(rhEGF-SLN10μg和rhEGF-NLC10μg)治疗的组中，新上皮没有超过多于伤口的一半。另外，尽管发现了与未治疗组的显著性差异(p<0.01)，但是对于rhEGF-SLN10μg情况下的空SLN以及在rhEGF-NLC10μg情况下的空NLC，这种统计学显著性趋于宽松，尽管10μg加载有rhEGF的脂质纳米颗粒的再上皮化评分较高(图4B)。关于rhEGF-MS75μg，到第8天，再上皮化区域覆盖多于伤口的一半，并且在rhEGF-MS75μg及其对照组(未治疗的组和空MS)之间发现了统计学显著差异。
因此，再上皮化过程的研究(表7)显示，使用4剂量的75μg游离rhEGF治疗的动物显示出比未治疗的组更高的再上皮化评分(分别为1.25±0.89和0.00±0.00)。令人惊奇地，与从4个局部给药rhEGF-SLN和rhEGF-NLC以及1个病灶内剂量rhEGF-MS75μg所获得的再上皮化改善相比，多个病灶内剂量的游离rhEGF的作用显示出更低的再上皮化改善。
伤口诱导15天之后，再上皮化研究未显示出各组之间差异。
表6.－炎症评分
表7.－再上皮化评分
实施例6.－使用加载有rhEGF的NLC在猪中的体内伤口愈合
6.1.－动物
所使用的所有协议和程序均事先得到了耶稣乌松微创外科中心机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteefromtheJesúsUsónMinimallyInvasiveSurgeryCentre)(JUMISC)的批准。使用了分散于2.90mx1.35m单个围栏中的六只雌性大白猪，在研究开始时的平均重量为26.82±2.90kg。该研究的所有动物随机分配在驯化室中，其中建立了以下圈养条件：12小时的光暗循环，20-25℃的温度，使用HEPA-过滤通风每小时八次换气，并且相对湿度为50-70％。由于围栏环境富集(penenvironmentenrichment)，安装了吊链及咀嚼橡胶玩具作为可咀嚼的元件。经过驯化期后，动物通过耳标记码被识别列入研究当中。
6.2.－伤口模型和外科手术
在固体饥饿12小时以及液体饥饿6小时之后，通过肌肉内注射15mg/kg氯胺酮(ketamine)和0.2mg/kg地西泮(diazepam)，将动物麻醉(使…镇静)。然后，通过丙泊酚(propofol)(3mg/kg)给药诱导麻醉，以允许气管内插管。此后，即刻通过附接到通气机的圆形回路将动物连接到麻醉机，以在1L/min氧气流中供应浓度为2.7％的七氟烷作为麻醉剂。作为镇痛，在手术过程中，通过静脉输液以0.1μg/kg/min的连续输注速率使用瑞芬太尼(remifentanil)。
对每一动物，创建6个伤口(6cmx5cm)，在每一个溃疡之间留下最小1.5-2.0cm，在使用框架在溃疡边缘刺纹(tattooing)之后，以具有初始伤口面积的永久参考。使用单极透热以凝固模式创建溃疡以获得缺血伤口边缘，深度为2mm，留下脂肪脂膜(panniculusadiposus)。在一周期间，通过含有丁丙诺啡透皮贴剂施用术后镇痛并且使用阿莫西林/克拉维酸(20mg/kg)进行全身抗生素治疗。
6.3.－实验组
在伤口诱导24小时后开始治疗给药(研究的第1天)，允许初级止血、血小板粘附和聚集、并激活凝血级联。将动物随机分为三组(n＝2)：(i)空NLC、(ii)20μgrhEGF-NLC和(iii)75μg游离rhEGF。将事先再悬浮于150μl赋形剂(0.5％处于0.9％盐水中的羧甲基纤维素)的纳米颗粒撒在伤口床上，进行局部给药，每周两次。再悬浮于1ml赋形剂中的游离rhEGF病灶内给药，每周两次。
在整个研究中，将伤口覆盖以避免脱水和微生物污染。另外，敷料防止结痂并有助于观察上皮边缘以供愈合伤口的面积测量。为此，使用石蜡纱布覆盖每个伤口以避免绷带粘连，在顶部放置三块消毒棉纱布，用粘性绷带和橡皮膏固定。敷料每周更换两次以连续评估伤口的状态和演变，保持这种方式以高的无菌水平。极其小心地进行清洗过程，使用无菌纱布和盐水溶液消除分泌物和碎屑，重视新形成的肉芽组织的完整性。
6.4.－血液样品
为了监测动物的一般健康状况，收集血液样品以检查伤口诱导的当天、第15天以及研究结束时(第43天)的血液学和生物化学水平。研究参数为：红细胞压积(haematocrit)、血红蛋白、红细胞平均体积(meancorpuscularvolume，MCV)、红细胞平均血红蛋白(meancorpuscularhaemoglobin，MCH)、白细胞、总蛋白和血小板。
此外，从rhEGF-NLC和游离rhEGF治疗的动物收集血浆样品以评估rhEGF全身吸收。通过ELISA(人EGFELISA开发试剂盒,PeproTech)进行rhEGF检测。当预计血浆rhEGF水平较高时，抽取样品。因此，在实验的第1天(治疗给药前)、给药后的4小时和24小时，从使用rhEGF-NLC治疗的动物采集样品。在刚给药之后以及第一次剂量30分钟后，从使用游离rhEGF治疗的动物中获取血浆样品。
6.5.－愈合的伤口的系列伤口分析
在第1、15、25、36和43天，通过测量伤口闭合(闭合初始伤口面积的百分比)来确定创伤愈合动力学。以标准方式评估伤口面积，使用相同的照明并且在伤口旁边放置一透明塑料无菌尺以在照片中引入一个供进一步处理的度量参考，垂直于伤口表面进行拍照。使用图像软件ImageJ计算伤口面积(参见第5.3节)。当闭合高于95％时，认为伤口是愈合的。
6.6.－伤口愈合的组织学评估
使用无菌手术刀(解剖刀)，收集从未愈合伤口的中心至健康边缘的全皮厚度活组织检查样品(2mm)。将所收集的样品立即在4％的福尔马林中固定，包埋于石蜡中并且切割成5-μm厚的层。使用苏木精-伊红(HE)将样品染色以供形态学观察。在第15天对伤口1、2和3收集活组织检查样品并且在第25天和43天对全部伤口采集活组织检查样品。在第36天，拍摄伤口照片，但未采集活组织检查样品以不延迟伤口愈合。
根据Cotranetal.(2000)标准，通过测量新形成的上皮、伤口成熟度和愈合质量，在再上皮化等级方面来确定伤口愈合。
6.7.－血液学分析
在整个研究过程中，血液学分析显示，所有研究的参数均没有任何变化。此外，所有获得的数值均处于健康猪的正常范围内(数据未示出)。
采集使用rhEGF-NLC和游离rhEGF治疗的动物的血浆样品，以评估当预计rhEGF浓度在血浆中较高时，rhEGF向全身循环中的吸收，因为关系到异常上皮生长，rhEGF的全身性使用受到限制。基于EGF半衰期、给药途径和加载于rhEGF-NLC中的生长因子的延迟释放，选择血浆采集时间点。在这一点上，因为预计封装于rhEGF-NLC中的rhEGF由于封装而使得其吸收晚于游离rhEGF，所以在实验的第1天、在rhEGF-NLC给药后的4小时和24小时进行血浆采样，而不是如对使用游离rhEGF治疗的动物在给药后30分钟进行血浆采样。由于人类和猪的显著相似性，预计具有相似的rhEGF血浆浓度。如表8中所阐明的，rhEGF血浆浓度显示出近似0的值，明显地低于基础人类EGF浓度(0.4ng/ml)。这一事实十分惊人，因为几乎不存在全身性吸收，甚至当将游离rhEGF直接注射到伤口中亦如此，这可以使副作用最小化；因此，提高治疗安全性并确保了rhEGF在病变处的局部作用。
表8.rhEGF血浆浓度。数据显示为平均值±S.D.
6.8.－愈合伤口的系列伤口分析
在第15、25、36和43天，计算每个实验组中愈合伤口的数目，以评价增强的愈合。在实验的第25天，发现了各组之间的最大差异。如图8中所描绘的，到第15天，所有伤口均未完全闭合。至第25天，与空NLC治疗组相比，rhEGF-NLC治疗组的愈合伤口的百分比显著更高。此外，应当指出的是，rhEGF-NLC的治疗与游离rhEGF相比显示出了轻微优越的有效性(分别为50％和40％)。尽管两个组中的愈合伤口的百分比相似，但是这些数据是特别显著的，因为使用rhEGF-NLC治疗的伤口接收每周两次局部给药20μgrhEGF，而使用游离rhEGF治疗的那些伤口接收更高剂量的病灶内给药(75μg，每周两次)。到第36天，几乎所有的伤口均完全愈合；使用rhEGF(rhEGF-NLC和流离rhEGF二者)治疗的伤口均完全闭合并且使用空NLC治疗的伤口达到了90％的愈合。在研究结束时(第43天)，所有的伤口均完全愈合。
6.9.－伤口愈合的组织学评估
6.9.1.－再上皮化等级
如图9A所示的，到第15天，与使用空NLC治疗的那些伤口以及接收75μg病灶内给药的游离rhEGF的那些伤口相比，使用20μg局部给药的rhEGF-NLC治疗的动物中的新上皮的长度显著更大(p<0.001)。与游离rhEGF相比，rhEGF-NLC的提高的再上皮化有效性表明，纳米封装保护生长因子不受伤口微环境的影响并且降低了由伤口区域的蛋白酶和氧化应激所施加的失活。这种保护可能担负了在体内研究中观察到的rhEGF-NLC的增强效用。然而，各组之间的差异在第25天和43天并未达到统计学显著性(图9A)，尽管在第25天获得的使用rhEGF(游离的或封装的)治疗的动物的平均值比空NLC组的高。
6.9.2.－伤口成熟度和愈合质量
由于所创建的病变的程度，根据Cotranetal.(2000)标准，在同一组织样品中可以观察到不同的愈合阶段。如图10A中所描绘的，到第15天，使用rhEGF-NLC治疗的动物不仅显示出了与接收空NLC和游离rhEGF的那些伤口相比统计学显著更低的炎症组织的延伸(2级)，而且显示出显著更高延伸的几乎完全愈合的上皮(4级)(p<0.001)。相比之下，空NLC和游离rhEGF治疗的伤口主要显示出弥漫性急性炎症，存在一些多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils)、肉芽组织形成和血管新生(2级)。
到第25天，因为所有的研究组中，愈合过程继续进行，2级延伸显著小于在第15天所观察到延伸并且3级和4级延伸显著更高(p<0.001)。此外，值得注意的是，尽管在第25天，在各组之间未发现再上皮化长度的差异，但是在伤口成熟度和愈合质量方面仍然存在差异(图9A和图10B)。使用rhEGF-NLC治疗的动物与接收空NLC和游离rhEGF的那些组相比显示出更接近于完全愈合的愈合等级，所述接收空NLC和游离rhEGF的那些组仍然显示出慢性炎症和富有新血管和成纤维细胞增殖的肉芽组织。
此外，如图9B和图10C所示，到第43天，所有实验组的所有伤口均显示了一些慢性炎症(3级和4级)。然而，使用rhEGF-NLC治疗的病变表现出显著改善的愈合等级和伤口成熟度(p<0.001)。

Claims (16)

1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂和一种生长因子。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述生长因子是表皮生长因子。
3.根据权利要求2所述的脂质纳米颗粒，其中所述表皮生长因子是重组人表皮生长因子(rhEGF)。
4.根据前述权利要求任一项所述的脂质纳米颗粒，进一步包含至少一种在室温下为液体的脂质。
5.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包含至少一种在室温下为固体的脂质、至少一种非离子表面活性剂、和cathelicidin抗微生物肽LL37。
6.根据前一权利要求所述的脂质纳米颗粒，进一步包含至少一种在室温下为液体的脂质。
7.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的脂质纳米颗粒和权利要求5或6所述的脂质纳米颗粒。
8.根据权利要求1～6任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求7所述的组合物，其用于作为药物而应用。
9.根据权利要求1～6任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求7所述的组合物，其用于在促进受试者伤口愈合中应用。
10.根据前一权利要求所述的脂质纳米颗粒或组合物，其中所述伤口选自于由糖尿病足溃疡、压迫性溃疡、血管溃疡、缺血性伤口和其组合组成的组。
11.一种药物组合物，包含权利要求1～6任一项所述的脂质纳米颗粒或权利要求7所述的组合物、以及药学上可接受的载体。
12.根据前一权利要求所述的药物组合物，其用于作为药物而应用。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其用于在促进受试者伤口愈合中应用。
14.一种试剂盒，包含权利要求1～6任一项所述的脂质纳米颗粒和/或权利要求7所述的组合物、和/或权利要求11所述的药物组合物，用于促进伤口愈合。
15.一种用于制备权利要求1～3和5任一项所述的脂质纳米颗粒的方法，包括下列步骤：
(i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
(ii)制备亲脂性溶液，其包含处于有机溶剂中的在室温下为固体的脂质，
(iii)将所述水性溶液(i)加入到所述亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液，
(iv)蒸发(iii)中获得的所述乳状液中的有机溶剂，以及
(v)收集所述纳米颗粒，
其中，将生长因子或LL37肽加入到溶液(ii)中。
16.一种用于制备权利要求4或6所述的脂质纳米颗粒的方法，包括下列步骤：
(i)制备包含非离子表面活性剂的水性溶液，
(ii)制备亲脂性溶液，其包含固体脂质和液体脂质的共混物，该共混物在高于所述液体脂质的熔点的温度下熔融，
(iii)将水性溶液(i)加热到与亲脂性溶液(ii)相同的温度，
(iv)将水性溶液(i)加入到亲脂性溶液(ii)中，使所得到的混合物经受超声处理直到获得乳状液，
(v)在5℃±3℃下冷却乳状液(iv)以允许脂质再结晶和纳米颗粒形成，以及
(vi)收集所述纳米颗粒，
其中，将生长因子或LL37肽加入到溶液(ii)中。
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