ES2639561T3

ES2639561T3 - Procedimiento de preparación de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas

Info

Publication number: ES2639561T3
Application number: ES13879335.1T
Authority: ES
Inventors: Satish Mahadeorao Totey; Rachana Rajiv MANIYAR; Lyle Carl FONSECA; Sneha Deepak LAGHATE; Nicole KOSHY
Original assignee: KASIAK RES PVT Ltd; KASIAK RESEARCH PVT Ltd
Current assignee: KASIAK RES PVT Ltd; KASIAK RESEARCH PVT Ltd
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2033-04-22
Also published as: WO2014027362A1; EP2884992A1; EP2884992B1; EP2884992A4; US20150224173A1

Abstract

Un procedimiento de preparación de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas que se pueden administrar por vía intra-dérmica, intra-articular, sub-dérmica o tópica que comprende las siguientes etapas: a. suspender plaquetas humanas en un medio isotónico; b. congelar instantáneamente la suspensión; c. descongelar la suspensión congelada; y d. esterilizar por filtración la suspensión en el que se suspenden un número fijo de plaquetas en un volumen fijo del medio isotónico para obtener la concentración necesaria de factores de crecimiento en el concentrado de factores de crecimiento; la congelación instantánea se lleva a cabo a una temperatura de -120 ºC a -200 ºC; la descongelación se lleva a cabo de 25 ºC a 37 ºC; y los residuos celulares se separan de la suspensión descongelada y la suspensión de factores de crecimiento resultante se diluye con el medio isotónico antes de la esterilización por filtración y opcionalmente se liofiliza con excipientes después de la esterilización por filtración, a condición de que el medio isotónico de la etapa (a) sea plasma, el volumen de plasma no exceda de 5 ml.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de preparacion de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un procedimiento de preparacion de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas. La invencion tambien se refiere al concentrado de factores de crecimiento, una preparacion liofilizada del mismo, una composicion que comprende el concentrado de factores de crecimiento, un procedimiento de tratamiento de afecciones dermatologicas, ortopedicas, neurologicas y endocrinas, y el uso del concentrado de factores de crecimiento.

Antecedentes de la invencion

Se sabe que las plaquetas, al activarse, liberan factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, y protelnas de adhesion. Estos factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, y protelnas de adhesion tienen un papel importante en la reduction de la inflamacion y el aumento de eventos proliferativos que ayudan al remodelado tisular y regeneration del tejido en caso de lesiones o heridas. Sin embargo, in vivo, las metaloproteinasas de la matriz (MMP), que habitualmente tienen un papel importante en el remplazo proteico durante la formation de tejido, tambien pueden producir una degradation tisular no especlfica si esta presente una alta concentration de MMP en el sitio de la herida durante una duration prolongada. Esto puede dar como resultado la destruction 'sin diana' de factores de crecimiento que son esenciales para la cicatrization. Las proteasas presentes en el exudado de la herida y la contamination bacteriana de la herida degradan adicionalmente los factores de crecimiento y pueden hacer que la cicatrizacion de la herida sea imposible dando lugar a una herida cronica, sin curacion.

Con el fin de poner en marcha el proceso de cicatrizacion, se ha adoptado recientemente el uso de factores de crecimiento sintetizados mediante tecnicas recombinantes o derivados de cualquier otra fuente en las practicas medicas. Una de dichas fuentes se encontro ser las propias plaquetas del paciente. La terapia con plasma rico en plaquetas (PRP) se ha desarrollado y esta siendo utilizada habitualmente para distintas indicaciones cllnicas, incluyendo las heridas cronicas. El PRP es, por definition, una volumen de la fraction de plasma de sangre autologa que tiene una concentracion de plaquetas superior a la llnea basal, o un aumento de la concentracion de plaquetas autologas suspendidas en una pequena cantidad de plasma tras la centrifugation. Basicamente, se recolecta la sangre del paciente y se centrifuga a distintas velocidades para obtener el PRP Habitualmente se utilizan dos centrifugaciones para la preparacion de PRP. La primera centrifugacion, tambien conocida como centrifugacion suave se hace a aproximadamente 245 g a 800 g durante 10 minutos, separa la fraccion RBC, la fraccion WBC y la fraccion de plaquetas en el plasma. La segunda centrifugacion, tambien conocida como centrifugacion dura se hace a aproximadamente 1500 g a 3000 g durante 10 minuto, separa las plaquetas del PPP. El material con la gravedad especlfica mas alta, es decir, las plaquetas se asientan en el fondo del tupo, este aglomerado de plaquetas se re- suspende en un pequeno volumen de plasma, generalmente 5 veces menor que el volumen de la sangre total procesada, obteniendo as! una suspension PRP. Inmediatamente antes de la aplicacion, se anade un activador/agonista de plaquetas, tal como trombina bovina y/o un 10 % de cloruro calcico, para activar la cascada de coagulation, produciendo un gel de plaquetas o coagulo. Las plaquetas activadas liberan factores de crecimiento en el plasma. El procedimiento completo tarda aproximadamente 30 a 60 minutos y produce una concentracion de plaquetas de tres a ocho veces la del plasma nativo. (Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 1998; 85:638-646; y Petrungaro PS. Using platelet-rich plasma to accelerate soft tissue maturation in esthetic periodontal surgery. Compend. Contin. Educ. Dent. 2001; 22:729-732, 734, 736 passim; quiz 746).

El PRP contiene no solo un alto nivel de plaquetas, sino que contiene tambien el complemento completo de factores de coagulacion ya que tambien comprende plasma. Para que el PRP sea funcional, las plaquetas se tienen que activar por adicion de trombina y cloruro calcico de manera que los contenidos de las plaquetas se liberen mediante la degranulacion de los granulos alfa de las plaquetas que contienen los factores de crecimiento. Sin embargo, habitualmente se utiliza trombina bovina para este fin lo que puede producir reacciones inmunitarias y tambien conlleva el peligro de la transmision de virus o enfermedades bovinas a los seres humanos. El uso de trombina humana hace que el producto sea inviable economicamente debido a su alto coste.

Ademas, el uso cllnico del PRP para lesiones nerviosas y medicina deportiva ha producido resultados contradictorios en los primeros ensayos. De hecho hay pocos ensayos cllnicos controlados que tengan evaluado adecuadamente la seguridad y eficacia de los tratamientos con PRP y estos ensayos en general concluyen que el PRP es una option de tratamiento 'prometedora' pero no probada para las lesiones de articulaciones, tendones, ligamentos y musculos. La razon de dichos resultados contradictorios y resultados negativos para los estudios cllnicos del PRP se asocian con la baja calidad del PRP producido por procedimientos no convencionalizados. Otro problema es que la mayorla de los dispositivos para preparar el PRP no cuentan las plaquetas y producen un PRP con solo un porcentaje fijo de plaquetas que se relaciona directamente con el porcentaje presente en la muestra de sangre original. Por lo tanto, el numero actual de plaquetas en el PRP de diferentes pacientes sera diferente ya que hay una variabilidad inter- individuo significativa en la concentracion de plaquetas del plasma humano. Esta variable puede afectar los

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resultados, ya que, por una parte, la concentracion mayor de factores de crecimiento ha demostrado tener efectos inhibidores y, por otra parte, el PRP con un numero de plaquetas menor puede no mostrar resultados optimos. Por lo tanto, existe la necesidad de un producto con una concentracion fija o convencionalizada de plaquetas o factores de crecimiento que esta disponible en el mercado de manera que se puedan administrar a los pacientes dosificaciones fijas de los mismos para el tratamiento de distintas afecciones de enfermedad.

Uno de los inconvenientes principales de los procedimientos que se utilizan actualmente es que el PRP solo se puede utilizar como terapia autologa y no se puede utilizar como terapia alogenica debido a factores inmunologicos tales como la incompatibilidad ABO en el que el plasma del donante o las membranas celulares de las plaquetas pueden ser inmunogenicas y producir graves eventos adversos en los pacientes. Ademas, cuando se administra el PRP a un paciente, lo que se inyecta son las plaquetas completas intactas y por lo tanto, las membranas celulares de las plaquetas existentes pueden producir alo-inmunizacion y reacciones adversas. Tambien, el PRP puede contener RBC hemolizados o intactos que pueden producir reacciones inflamatorias. La proporcion de leucocitos sangulneos, factores de crecimiento y otros productos qulmicos tales como la trombina presentes en el PRP tambien pueden afectar a la calidad final del PRP. Otro inconveniente del procedimiento existente de preparacion de PRP es que es un procedimiento de extraccion sangulneo para una unica dosis y por lo tanto son necesarias multiples extracciones de sangre en el caso de que se necesiten multiples dosis. Otro inconveniente mas es que el PRP tiene que utilizarse en las cuatro horas del procedimiento y no se puede almacenar debido a que el almacenamiento hace que se formen floculos y coagulos de fibrina en el plasma.

Otra teorla que respalda el por que de que el PRP no funcione tan bien como se esperaba es que la concentracion de plaquetas en el PRP obtenido por maquinas automaticas es baja para alcanzar el efecto cllnico deseado, probablemente porque el 30 a 35 % de las plaquetas se pierden durante el procediendo en maquinas automaticas.

Aunque recientemente se ha desarrollado una nueva sustancia llamado lisado de plaquetas humanas (HPL) que tiene caracterlsticas similares al PRP, no se ha utilizado en aplicaciones cllnicas debido a que tiene varios inconvenientes que incluyen numero de plaquetas y factores de crecimiento variables. La preparacion de HPL consume tiempo ya que conlleva multiples congelaciones-descongelaciones del PRP para que la activacion de las plaquetas libere los factores de crecimiento ya que se libera una pequena cantidad de factores de crecimiento en cada ciclo de congelacion y descongelacion. La congelacion que produce la activacion y la lisis posterior de las membranas celulares de las plaquetas, se hace habitualmente de -20 a -80 °C y puede tardar varias horas. La descongelacion se hace habitualmente a 4 °C o a temperatura ambiente. Las multiples congelaciones- descongelaciones y el almacenamiento a largo plazo producen desnaturalizacion de los factores de crecimiento y tambien produce que se forme un coagulo de fibrina al almacenarlo, haciendo al HPL inadecuado para su uso. La mayorla de los factores de crecimiento se quedan atrapados en el coagulo formado, dejando, de esta manera insuficientes factores de crecimiento para las aplicaciones posteriores en el lisado plasmatico preparado. Recientemente, se ha identificado una tecnologla para retirar la fibrina presente en el plasma, sin embargo, el procedimiento para retirar la fibrina es complicado y consume tiempo y por lo tanto el producto es prohibitivo. Tambien se ha utilizado sangre de animales para fabricar HPL y esto es inadecuado para su uso en seres humanos y puede producir reacciones inmunitarias xenogenicas. Tambien, se utilizo convencionalmente el HPL en medios de cultivo celular y no se utiliza para ninguno de los fines terapeuticos/aplicaciones cllnicas. Ademas, se utilizan a menudo disolventes o detergentes para fabricar los concentrados de plaquetas antes de la lisis, y el uso de dichos disolventes o detergentes tambien hace que estos procedimientos sean inaceptables para el uso de HPL en inyectables para el tratamiento de seres humanos.

Sumario de la invencion

De acuerdo con una realizacion de la invencion se proporciona un procedimiento de preparacion de un concentrado de factores de crecimiento administrable por via intra-dermica, sub-dermica, intra-articular o topica derivado de plaquetas humanas que comprende las siguientes etapas:

a. suspender las plaquetas humanas en un medio isotonico;

b. congelar de manera instantanea la suspension;

c. descongelar la suspension congelada; y

d. esterilizar por filtracion la suspension

en el que, se suspende un numero fijo de plaquetas en un volumen fijo del medio isotonico para obtener la concentracion necesaria de factores de crecimiento en el concentrado de factores de crecimiento; la congelacion instantanea se lleva a cabo a una temperatura de -120 °C a -200 °C;

la descongelacion se lleva a cabo de 25 °C a 37 °C; y se separan los residuos celulares de la suspension descongelada y la suspension de factores de crecimiento resultante se diluye con el medio isotonico antes de esterilizarlo por filtracion y opcionalmente liofilizarlo con excipientes despues de la esterilizacion por filtracion, a condition de que el medio isotonico de la etapa (a) sea plasma, el volumen de plasma no exceda de 5 ml.

De acuerdo con otra realizacion de la invencion mas se proporciona una dosificacion de un concentrado de factores de crecimiento que se puede administrar por via intra-dermica, intra-articular, o topica preparado por un procedimiento de acuerdo con la revindication 1, derivado de aproximadamente 1250 x 106 plaquetas humanas por

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ml, comprendiendo el concentrado aproximadamente 900 a 2000 pg/ml de factor de crecimiento epidermico (EGF), 30 a 300 pg/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf), 20 a 100 pg/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), 40000 a 120000 pg/ml de factor p de crecimiento transformante (TGF-p) y 200000 a 600000 pg/ml de factor AB de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) suspendidos en un medio isotonico, de aproximadamente 875 x 106 plaquetas humanas por ml, comprendiendo el concentrado aproximadamente 800 a 1200 pg/ml de EGF, 20 a 80 pg/ml de VEGF, 15 a 30 pg/ml de b-FGF, 30000 a 40000 pg/ml de TGF-p y 100000 a 200000 pg/ml de PDGF-AB suspendidos en un medio isotonico; de aproximadamente 625 x 106 de plaquetas humanas, comprendiendo el concentrado aproximadamente 500 a 1000 pg/ml de EGF, 10 a 20 pg/ml de VEGF, 10 a 25 pg/ml de b-FGF, 20000 a 30000 pg/ml de TGF-p y 60000 a 150000 pg/ml de PDGF-AB suspendido en un medio isotonico. Se tiene que entender que la descripcion general anterior y la siguiente description detallada de las presentes realizaciones de la invention tienen la intention de proporcionar una vision general o estructura para entender el caracter y naturaleza de la invencion que es reivindica. Las representaciones graficas y pictoricas adjuntas se incluyen para sustanciar la invencion y se incorporan y constituyen una parte de la presente memoria descriptiva.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1A muestra la relation entre la velocidad de centrifugation y la recuperation media de plaquetas tras la 1a centrifugacion.

La FIG. 1B muestra la relacion entre la velocidad de centrifugacion y la recuperacion media de plaquetas tras la 2a centrifugacion.

La FIG. 2 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento obtenidos por el metodo de la invencion cuando el medio isotonico es una solution isotonica de multiples electrolitos (Ejemplo 2) contra el plasma libre de plaquetas (Ejemplo 1).

La FIG. 3 es una comparacion de los niveles de factores de crecimiento que se obtienen por el procedimiento del Ejemplo 1 y 2 respecto al proceso del Ejemplo 3 segun se determina por ELISA.

La FIG. 4 muestra que los niveles de distintos factores de crecimiento en el GFC se encontraban relacionados linealmente con la concentration de plaquetas de las que se derivaba el GFC.

La FIG. 5 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento obtenidos por el procedimiento de la invencion (GFC), con los factores de crecimiento obtenidos de plaquetas activadas con 150 unidades/ml de trombina bovina en un 10 % de cloruro calcico (PRP).

La FIG. 6 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento por ELISA obtenidos por el procedimiento de la invencion cuando la temperatura de congelation es de -196 °C, en comparacion con multiples congelaciones-descongelaciones a temperaturas de congelacion de -80 °C y -20 °C.

La FIG. 7 es una comparacion fotografica de un sujeto de estudio que presenta arrugas nasolabiales reducidas tras tres meses de recibir una inyeccion intra-dermica de concentrado de factores de crecimiento derivado de 625 x 106 plaquetas por ml.

La FIG. 8 es una comparacion fotografica de un sujeto de estudio que muestra crecimiento del cabello dos meses despues de la finalization del tratamiento con el concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento de tres inyecciones intra-dermicas de concentrado de factores de crecimiento de 875 x 106 plaquetas por ml, aplicandose cada inyeccion posterior con un intervalo de un mes desde la inyeccion previa.

La FIG. 9 es una comparacion grafica puntuacion de la evaluation del codo de tenista considerada por el paciente (PRTEE) de un sujeto de estudio que padecla codo de tenista un mes tras la finalizacion del tratamiento con el concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento en una inyeccion intra-articular de concentrado de factores de crecimiento derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml.

La FIG. 10 es una comparacion fotografica de un sujeto de estudio que muestra una hiperpigmentacion periorbital reducida tres meses tras la finalizacion del tratamiento con el concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento en una inyeccion intra-dermica de concentrado de factores de crecimiento derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml.

La FIG. 11 es una comparacion fotografica de ratas Wistar que muestran la cicatrization de una lesion por quemadura inducida por cera de parafina caliente 20 dlas despues del tratamiento con concentrado de factores de crecimiento en comparacion con el control sin tratar, consistiendo el tratamiento en la aplicacion topica diaria de concentrado de factores de crecimiento derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml obtenidas por el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

Por simplicidad, y con fines ilustrativos, la presente invencion se escribe en referencia principalmente a las

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realizaciones ejemplares de la misma. En la siguiente descripcion, se exponen numerosos detalles especlficos con el fin de proporcionar un entendimiento completo de la presente invention. Sin embargo, sera evidente para un experto habituado en la tecnica que la presente invencion se puede practicar sin limitation a estos detalles especlficos. En otros casos, no se han descrito en detalle los procedimientos bien conocidos de manera que no oscurezcan innecesariamente la presente invencion.

En el contexto de la invencion, la expresion “concentrado de factores de crecimiento” o “GFC” como se utiliza en la memoria descriptiva se refiere a una concentration convencionalizada de factores de crecimiento preparadas de acuerdo con una realization de la invencion, estando derivados los factores de crecimiento de la crio-estimulacion de plaquetas que se han contado, siendo obtenidas las plaquetas de sangre humana. El GFC tambien contiene citocinas, quimiocinas protelnas de adhesion y otros peptidos moduladores.

Tambien, “solution isotonica de multiples electrolitos” como se utiliza en la memoria descriptiva en el contexto de la invencion comprende cloruro sodico (NaCl); gluconato sodico (C6HiiNaO7); acetato sodico trihidrato, (C2H3NaO2^3H20); cloruro potasico (KCl); y 30 mg de cloruro de magnesio ((MgCh^6H2O) y seroalbumina humana. Preferentemente, cada 100 ml de solucion isotonica de multiples electrolitos contiene 526 mg de cloruro sodico, (NaCl); 502 mg de gluconato sodico (C6HiiNaO7); 368 mg of acetato sodico trihidrato, (C2HaNaO2^3H2O); 37 mg de cloruro potasico, (KCl); y 30 mg of cloruro de magnesio, (MgCl2^6H2O) y un 1 a un 5 % de seroalbumina humana. El pH se ajusta con hidroxido sodico a 7,4 (o de 6,5 a 8,0), se esterilizo por filtration y se ensayo en cuento a endotoxinas.

Ademas, la expresion “plasma libre de plaquetas” como se utiliza en la memoria descriptiva en el contexto de la invencion comprende el sobrenadante recolectado del plasma que se ha centrifugado a aproximadamente 17610 g y luego esterilizado por filtracion. La expresion “plasma pobre en plaquetas” o “PPP” como se utiliza en la memoria descriptiva en el contexto de la invencion comprende el sobrenadante recolectado de la sangre completa que se ha centrifugado a aproximadamente 2720 g.

Se pueden recolectar plaquetas recien recolectadas o sangre reciente de donantes o incluso de bancos de sangre para la fabrication de GFC a gran escala. La sangre se transporta preferentemente al laboratorio de procesamiento central a 20-24 °C en una caja de transporte. La sangre se puede recolectar alternativamente de donantes que necesitan tratamiento con el GFC. La sangre se puede recolectar tambien de otras especies de mamlfero tales como un caballo, pero, gato, bufalo, vaca, oveja, cabra, roedores, etc., de la vena yugular o la vena cefalica o la vena femoral. Una parte de la muestra recolectada se procesa rutinariamente para el recuento de sangre completa (CBC), y ensayo de marcadores de enfermedades infecciosas para el virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1,2), virus de la Hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), ensayos de investigation laboratorial de enfermedades venereas (VDRL). La parte restante de la sangre recolectada se envla preferentemente a una sala de ambiente limpio clase B para el procesamiento adicional para producir el GFC. La temperatura de la sala limpia se mantiene preferentemente a 22 °C con una humedad relativa del 55 %.

La estabilidad de las plaquetas en sangre completa (en terminos de niveles de factores de crecimiento) se comprobo para diferentes temperaturas y puntos de tiempo y se descubrio que las plaquetas en sangre completa eran estables entre 15 a 30 °C hasta 24 horas para el fin de la preparation del GFC, es decir, los niveles de factores de crecimiento medidos utilizando un ELlSA tras recuperar las plaquetas a diferentes temperaturas y puntos de tiempo se mantenlan estables hasta 24 horas.

De acuerdo con una realizacion de la invencion, la muestra de sangre que se va a utilizar para la obtencion del GFC se centrifuga de 109 g a 680 g, preferentemente a aproximadamente 382 g durante 15 minutos a 22 °C para el aislamiento de plaquetas. Tras la centrifugation, se observaban tres capas: una capa superior de plasma rico en plaquetas de color amarillo (PRP), una capa media de corpusculos de leucocitos (WBC) y la capa inferior de corpusculos de globulos rojos (RBC). La capa superior se aspiro cuidadosamente para maximizar el rendimiento en plaquetas, mientras que se asegura que no se recogen WBC, y se coloca en otro tubo de centrifuga esteril. El plasma rico en plaquetas recolectado se centrifuga entonces de 680 a 3442 g, preferentemente a aproximadamente 2720 g durante 10 minutos. Esto separa el PRP en un aglomerado de plaquetas y un sobrenadante de plasma pobre en plaquetas. Se recolecta el PPP completo en un tubo de centrifuga esteril y se almacena a temperatura ambiente para un uso posterior. Se podrian preparar de esta manera las plaquetas de cualquier concentracion deseada que no es posible en otros dispositivos conocidos para obtener PRP. Para el uso autologo, el aglomerado de plaquetas se re-suspenden en la cantidad apropiada de medio isotonico. Preferentemente, el medio isotonico es plasma libre de plaquetas, plasma pobre en plaquetas, solucion isotonica de multiples electrolitos o combinaciones de los mismos. Para fines alogenicos, el aglomerado de plaquetas concentradas se puede re-suspender en 1 a 10 ml de solucion isotonica de multiples electrolitos o plasma libre de plasma que se ensaya en cuanto a compatibilidad ABO antes de su uso. Las plaquetas se cuentan entonces y se puede anadir medio isotonico adicional de manera que el numero de plaquetas se ajustan a un recuento de aproximadamente 250 a 5000 x 106 plaquetas por ml; preferentemente aproximadamente 1250 x 106 plaquetas por ml, aproximadamente 875 x 106 plaquetas por ml o aproximadamente 625 x 106. Esta suspension de plaquetas se somete entonces a una activation fisiologica por congelation a -196 °C. El tubo de centrifuga que contiene la suspension de plaquetas concentradas se coloca en nitrogeno liquido durante 120 segundos y luego se somete a una descongelacion rapida. La descongelacion rapida se hace a 37 °C durante 120 segundos. Solo se suficiente un ciclo de congelacion-descongelacion para activar

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fisiologicamente las plaquetas y producir la lisis de las membranas de las plaquetas. Esta congelacion- descongelacion crio-estimula las plaquetas para que liberen los factores de crecimiento. La suspension se puede mezclar entonces con 4 a 15 ml de PPP que se retiro en la etapa anterior o plasma libre de plaquetas o solucion isotonica de multiples electrolitos y se somete a una centrifugacion de alta velocidad a una velocidad de 17610 g durante 30 minutos. La ultima centrifugacion es crltica para retirar todas las membranas plasmaticas o antlgenos de membrana de las plaquetas o los residuos de manera que se obtiene una solucion acelular. Tras la centrifugacion de alta velocidad se aspira el sobrenadante y se transfiere a otro tubo esteril. El GFC es susceptible de liofilizacion tras el mezclado del gFc con 2 a 10 % de manitol, sacarosa y/o glicina que se anaden al GFC como agente de volumen/lioprotector para la liofilizacion. El producto liofilizado se sella con una tapa de tirar para la aplicacion cllnica y es estable durante mas de un ano a 4 °C. El GFC liofilizado se puede reconstituir con 5- 15 ml de solucion electrolltica de multiples electrolitos. Tambien se puede utilizar agua esteril para inyeccion como diluyente para la reconstitucion, con un 1 % de seroalbumina humana. Tambien se puede utilizar plasma coincidente con el grupo sangulneo como diluyente.

En una realizacion de la invencion, el aglomerado de plaquetas se suspende en 1 ml de solucion isotonica de multiples electrolitos y despues de la congelacion-descongelacion, la solucion descongelada se mezcla entonces con 9 ml del plasma que se habla retirado de la capa superior al final de la segunda centrifugacion.

En una realizacion preferida de la invencion, la solucion isotonica de multiples electrolitos se suplementa con excipientes farmaceuticamente aceptables. Preferentemente, los aditivos farmaceuticamente aceptables se selecciona de entre un grupo que comprende solucion A acida de Citrato de dextrosa (ACD-A), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), y Fosfato citrato de dextrosa adenina (CPDA).

El GFC preparado en plasma es util para el tratamiento de afecciones tales como quemaduras y heridas que necesitan las protelnas presentes en el plasma que ayudan a construir un armazon para la cicatrizacion. El GFC preparado en solucion isotonica de multiples electrolitos solo es util para el tratamiento alogenico o para el tratamiento de las afecciones que no necesitan protelnas plasmaticas, tales como el tratamiento de la alopecia androgenica.

El GFC preparado en el plasma de acuerdo con el procedimiento de la invencion tras el almacenamiento durante 2 meses a -20 °C y descongelado a 37 °C en un bano de agua se mantenla como una solucion transparente sin ninguna floculacion. El GFC que no se habla liofilizado se puede almacenar a o por debajo de -20 °C durante un maximo de 6 meses. El GFC se puede utilizar con fines terapeuticos tal como el tratamiento de afecciones dermatologicas, ortopedicas, neurologicas, y endocrinas incluyendo la alopecia androgenica, perdida del cabello, hiperpigmentacion periorbital, arrugas nasolabiales, arrugas faciales, acne, escaras por acne, heridas cronicas, codo de tenista, ulceras del pie diabeticas, fistulas, lesiones por quemaduras y cambios dermatologicos relativos a la edad no deseados.

El GFC comprende una combinacion de factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidermico (EFG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformate-beta (TGF-p), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento-1 tipo insulina (IGF-1), factor de crecimiento del hepatocito (HGF), Factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF-AA), (PDGF-AB, (PDGF-BB); citocinas como RAnTeS, interleucina-1 beta (IL-1 p), proteina inhibidora de macrofagos-1 alfa (MIP-1a), GRO-alfa, ENA-78, MCP-3, NCP, IGFBP-3; proteinas basicas tales como el factor 4 de plaquetas (PF-4), Endostatina, PBP, peptido de activacion de tejido conjuntivo (CTAP), peptido de activacion de neutrofilos (NAP); proteinas adhesivas tales como ECGF, inhibidor del activador de plasminogeno-1, laminina-8, fibrinogeno, fibronectina, trombospondina y agentes antimicrobianos como la trombocidina. Estos factores de crecimiento y otras proteinas tienen propiedades regenerativas y ayudan a iniciar el proceso de cicatrizacion. El GFC solo o junto con excipientes farmaceuticamente aceptable se formula y administra como anti-envejecimiento, trastornos dermatologicos, perdida del cabello, heridas cronicas, trastornos ortopedicos, ulceras del pie diabeticas, fistulas, lesiones por quemadura, trastornos endocrinos, trastornos neurologicos, trastornos oftalmologicos, trastornos musculoesqueleticos, etc. El GFC preparado por el procedimiento de la presente invencion presenta una alta tendencia a la regeneracion o cicatrizacion rapida de heridas.

El producto GFC se ensayo en cuanto a endotoxina para confirmar que el producto era seguro y libre de contaminacion bacteriana. El producto GFC se ensayo tambien en cuanto a enfermedades infecciosas como VIH, VHC, VHB, sifilis, etc. y se descubrio que estaba libre de enfermedad y seguro para las aplicaciones clinicas.

Se llevaron a cabo estudios clinicos de varias indicaciones tales como la alopecia androgenica, hiperpigmentacion periorbital, arrugas nasolabiales y codo de tenista para el GFC preparado con el procedimiento de la presente invencion. En los ensayos clinicos que se llevaron a cabo, la administracion de GFC daba lugar a una mejora significativa de la regeneracion del cabello, disminucion de la hiperpigmentacion periorbital, reduccion de arrugas nasolabiales y aceleracion de la recuperacion del codo de tenista. En los estudios pre-clinicos en ratas Wistar, la administracion de GFC daba lugar a una cicatrizacion acelerada de las heridas por quemadura en comparacion con las ratas no tratadas.

Esta en el ambito de la invencion el uso de otros tipos de celulas humanas, es decir, tambien distintas de la

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plaquetas, para dar lugar al GFC de acuerdo con el procedimiento de la invencion. Esta tambien en el ambito de la invention el uso de otras celulas de mamlfero o placenta para producir el GFC de acuerdo con el procedimiento de la invencion.

Preferentemente, la congelation inmediata se hace en nitrogeno llquido o helio llquido. La descongelacion se puede hacer en un bano de agua a 37 °C. El medio isotonico puede ser una solution isotonica de multiples electrolitos, plasma, plasma libre de plaquetas, plasma pobre en plaquetas o una combination de los mismos. La solucion isotonica de multiples electrolitos se puede suplementar con excipientes farmaceuticamente aceptables. Preferentemente, los excipientes incluyen manitol, sacarosa, glicina o combinaciones de los mismos.

Preferentemente, los residuos celulares se retiran de la suspension descongelada centrifugando la suspension descongelada de 11270 g a 17610 g durante 25 a 35 minutos y aislando el sobrenadante.

Las plaquetas de la etapa (a) del procedimiento se pueden obtener por plaquetoferesis, o por centrifugation de la sangre completa. Las plaquetas de la etapa (a) se obtienen preferentemente mediante:

a. centrifugar al menos 10 ml de sangre humana anticoagulada de 109 g a 680 g durante 5 a 20 minutos;

b. aislar la capa mas superficial que contiene las plaquetas y centrifugar la misma de 680 g a 3442 g durante 5 a 15 minutos; y

c. aislar el aglomerado de plaquetas libre de plasma obtenido al final de la etapa (b). Mas preferentemente, la centrifugacion de la etapa (a) se lleva a cabo a 382 g durante 15 minutos y la centrifugacion en la etapa (b) se lleva a cabo a 2720 g durante 10 minutos.

De acuerdo con otra realization de la invencion, se proporciona un concentrado de factores de crecimiento preparado por un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, para su uso en el tratamiento de afecciones humanas dermatologicas, ortopedicas, neurologicas o endocrinas. Las afecciones pueden incluir la alopecia androgenica, perdida del cabello, hiperpigmentacion periorbital, arrugas nasolabiales, arrugas faciales, acne, escaras de acne, heridas cronicas, lesiones por quemadura, codo de tenista, ulceras del pie diabeticas, fistulas, y cambios dermatologicos relacionados con la edad no deseados.

Preferentemente, la hiperpigmentacion periorbital, heridas cronicas, lesiones por quemadura, codo de tenista, ulcera del pie diabetica y fistulas se tratan con el concentrado de factores de crecimiento derivados de aproximadamente 1250 x 106 plaquetas humanas por ml. Preferentemente, la alopecia androgenica y la perdida del cabello se tratan con el concentrado de factores de crecimiento derivado de aproximadamente 875 x 106 plaquetas humanas por ml. Preferentemente, las arrugas nasolabiales, arrugas faciales, y cualquier afeccion dermatologica relacionada con la edad se tratan con el concentrado de factores de crecimiento derivado de aproximadamente 625 x 106 plaquetas humanas por ml.

De acuerdo con otra realizacion de la invencion, se proporciona una composition terapeutica para administration topica, sub-dermica, intra-articular, o intra-dermica que comprende el concentrado de factores de crecimiento preparado por un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en combinacion con constituyentes suplementarios que incluyen sangre, solucion salina, nanoparticulas de plata, acido hialuronico, peptidos inmunomoduladores, factores de crecimiento, hormonas, antibioticos, anticuerpos monoclonales, receptores recombinantes, vehiculo o combinaciones de los mismos. La composicion puede estar en forma de una crema, gel, solucion acuosa, aerosol en pulverizador o parche transdermico.

Con el fin de que los expertos en la tecnica sean mas capaces de poner en practica la presente divulgacion, se dan los siguientes ejemplos a modo de ilustracion y no a modo de limitation.

Ejemplo 1

La sangre humana se extrajo en vacutainers tras obtener el consentimiento informado del paciente. Se recolectaron aproximadamente 50-60 ml de sangre en dos tipos de vacutainers: 50 ml en vacutainers que contenian ACD-A para preparar GFC y 5-10 ml de sangre en tubos con EDTA para el ensayo de marcadores de enfermedades infecciosas y el ensayo de los parametros de sangre completa. Se tomo un minimo de 50 ml de sangre para la preparation de 10 ml de preparacion de GFC. La sangre se transporto de 15 a 30 °C preferentemente a 22 °C a las 4 horas de la extraction. La primera centrifugacion se hizo a 382 g durante 15 minutos ya que la recuperation de plaquetas a 382 g durante 15 minutos es optima con una perdida de solo un 8-10 % de plaquetas como se muestra en la FIG. 1A. La perdida de plaquetas es significativamente mayor a velocidades de centrifugacion mas altas o mas bajas. Al terminar la primera centrifugacion se formaban tres capas. En el fondo estaban comprimidos los globulos rojos, en la media los leucocitos y en la capa superior habia plasma que contenia las plaquetas. El plasma que contenia las plaquetas se aspiro y se transfirio a otro tubo esteril. La segunda centrifugacion se hizo a 2720 g durante 10 minutos ya que la centrifugacion a 2720 g durante 10 minutos daba como resultado la recuperacion de plaquetas a casi el 99,5 % como se muestra en la FIG. 1B. La capa superior tenia el plasma y en el fondo estaba un aglomerado de plaquetas comprimidas. El plasma completo (PPP) se retiro y se coloco en un tubo esteril y se almaceno a temperatura ambiente para su uso posterior. El aglomerado de plaquetas se suspendio en 1 ml de PPP. Entonces se hizo el recuento de plaquetas y se senalo que la concentration de plaquetas por ml de plasma era 12500 x 106. La solucion se congelo inmediatamente en nitrogeno llquido a -196 °C en 2 minutos. La solucion congelada se descongelo

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entonces rapidamente en un bano de agua a 37 °C en dos minutos. Con el fin de convencionalizar la concentracion de factores de crecimiento en la solucion, la solucion descongelada se mezclo entonces con 9 ml de PPP. Esta solucion se transfirio entonces a otro tubo esteril y se sometio a una centrifugacion a alta velocidad a 17610 g durante 30 minutos. El sobrenadante que contenla los factores de crecimiento se recolecto y se esterilizo por filtracion a traves de un filtro de 0,22 micrometros.

Como el volumen final del GFC es de 10 ml, y el numero de plaquetas que se utilizaron para preparar el GFC era de 12500 x 106, la concentracion eficaz de plaquetas utilizada para la preparacion del GFC es de 1250 x 106 plaquetas por ml. De manera similar, se preparo un volumen final de 5 ml en el que el numero de plaquetas que se utilizaron para preparar el GFC era de 6250 x 106, de manera que la concentracion de plaquetas utilizada para preparar el GFC era de 6250 x 106, de manera que la concentracion de plaquetas eficaz que se utilizo para la preparacion del GFC era aun de 1250 x 106 plaquetas por ml.

Ejemplo 2

El procedimiento del Ejemplo 1 se siguio excepto en que el aglomerado de plaquetas se suspendio en 1 ml de solucion isotonica de multiples electrolitos y tras la congelacion-descongelacion, la solucion descongelada se mezclo entonces con 9 ml mas de solucion isotonica de multiples electrolitos. La FIG. 2 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento obtenidos por el procedimiento del Ejemplo 1 frente al Ejemplo 2 para la sangre obtenida del mismo donante. Los graficos muestran que los niveles de distintos factores de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB (PDGF-AB), factor de crecimiento epidermico (EGF), factor beta de crecimiento transformante (TGF-p) como se determino por un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) eran casi comparables en el gFc preparado con plasma (Ejemplo 1) como en el GFC que esta libre de plasma (Ejemplo 2).

Ejemplo 3

Los procedimientos del Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 se siguieron por separado utilizando la sangre obtenida del mismo donante. Ademas, la suspension que contenla el GFC se mezclo con un 10 % de manitol. La solucion entonces se liofilizo. El producto liofilizado se empaqueto entonces en viales con tapas de tirar para hacerlo un producto “disponible para la venta”. La FIG. 3 es una comparacion de los niveles de factores de crecimiento obtenidos por el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2 respecto al proceso del Ejemplo 3 como se determino por un ELISA. ES evidente que los niveles de factores de crecimiento son casi los mismos o reducidos marginalmente en el producto de GFC liofilizado en comparacion con el GFC preparado mediante el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2.

Ejemplo 4

El procedimiento del Ejemplo 1 se repitio excepto porque se prepararon dos concentraciones de GFC mas en las que el numero de plaquetas que se contaba y se suspendla en 1 ml de PPP era de 8750 x 106 plaquetas por ml y 6250 x 106 plaquetas por ml de manera que tras mezclar el sobrenadante que contenla GFC con 9 ml mas de PPP, la concentracion eficaz de plaquetas utilizadas para preparar el GFC era de 875 x 106 plaquetas por ml y 625 x 106 plaquetas por ml respectivamente. Las tres concentraciones de GFC, es decir, GFC derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml como por el Ejemplo 1, y el GFC derivado de 875 x 106 plaquetas por ml y 625 x 106 plaquetas por ml como en el Ejemplo 5, se hicieron utilizando sangre del mismo donante. Los factores de crecimiento principales en el GFC se midieron por ELISA. El GFC se ensayo en cuanto a VEGF, b-FGF, PDGF-AB, EGF y TGF-p. La FIG. 4 muestra que los niveles de distintos factores de crecimiento en el GFC resultaban estar relacionados linealmente con la concentracion de plaquetas a partir de la que se derivaba el GFC.

Ejemplo 5

El procedimiento del Ejemplo 1 se siguio hasta la etapa de recuento de las plaquetas y se hacla una concentracion de 1250 x 106 plaquetas por ml de plasma. Esta concentracion de plaquetas se activo entonces utilizando 150 unidades/ml de trombina bovina en un 10 % de cloruro calcico. Tras diez minutos, se centrifugo el coagulo formado en la solucion. El sobrenadante se separo entonces se determino el nivel de factores de crecimiento en el mismo mediante un ELISA y se comparo con el nivel de factores de crecimiento preparados por el procedimiento del Ejemplo 1 y obtenido de la muestra de sangre del mismo donante. La FIG. 5 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento obtenidos por el procedimiento del Ejemplo 1 respecto al procedimiento del Ejemplo 5. La FIG. 5 muestra que los niveles de VEGF, b-FGF, PDGF-AB, EGF y TGF-p eran mayores o comparables a los del GFC preparado por el procedimiento del Ejemplo 1 en comparacion con los niveles de factores de crecimiento obtenidos en el Ejemplo 5.

Ejemplo 6

El procedimiento del Ejemplo 1 se siguio hasta la etapa de recuento de plaquetas y se hacla una concentracion de 1250 x 106 plaquetas por ml de plasma. Esta concentracion de plaquetas se activo entonces utilizando un ciclo de congelacion-descongelacion, dos ciclos de congelacion-descongelacion, y tres ciclos de congelacion-descongelacion en los que la congelacion se hizo a -20 °C, -80 °C y -196 °C seguidos por descongelacion a 27 °C una vez, dos

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veces y tres veces para cada temperatura. Tras la congelacion-descongelacion, se siguio con el resto del procedimiento del Ejemplo 1, a saber dilucion, centrifugacion final, y esterilizacion por filtracion. La FIG. 6 muestra una comparacion de las concentraciones de distintos factores de crecimiento por ELISA obtenida en el Ejemplo 6 para un ciclo de congelacion-descongelacion, dos ciclos de congelacion-descongelacion y tres ciclos de congelacion-descongelacion en los que la congelacion se hizo a -20 °C, -80 °C y -196 °C. A partir de los resultados, es evidente que un ciclo de congelacion-descongelacion a -196 °C es suficiente para liberar los factores de crecimiento en comparacion con las dos o tres congelaciones-descongelaciones a las temperaturas de la tecnica anterior, es decir, -20 °C a -80 °C, que tambien consumen tiempo y no son adecuadas para los objetivos de produccion en los que el tiempo es un factor muy importante. Los resultados mostraban que los niveles de factores de crecimiento aumentaban con el numero de ciclos de congelacion-descongelacion a temperaturas de -20 °C y -80 °C y la temperatura de congelacion optima era -196 °C ya que solo se necesitaba un ciclo de congelacion- descongelacion para la optima liberacion de factores de crecimiento cuando la congelacion se hace a esta temperatura. Tambien, se tiene que senalar que las congelaciones-descongelaciones repetidas no son deseables debido a la desnaturalizacion de las protelnas cuando se someten a congelaciones-descongelaciones repetidas.

Ejemplo 7

Se trataron unos cuantos sujetos de estudio con el GFC preparado de acuerdo con el Ejemplo 4 en el que el GFC se preparo a partir de 625 x 106 plaquetas por ml. La FIG. 7 es una comparacion fotografica de la reduccion de arrugas nasolabiales de un sujeto de estudio tras tres meses de recibir una inyeccion intradermica de GFC derivado de 625 x 106 plaquetas por ml. Es evidente en la figura que la administration de GFC produce una disminucion apreciable de la prominencia de las arrugas nasolabiales.

Ejemplo 8

Unos cuantos sujetos de estudio se trataron con el GFC preparado de acuerdo con el Ejemplo 4 en el que el GFC se preparo a partir de 875 x 106 plaquetas por ml. La FIG. 8 es una comparacion fotografica del crecimiento del cabello a los dos meses tras la finalization del tratamiento con el concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento en tres inyecciones intradermicas de concentrado de factores de crecimiento derivado de 875 x 106 plaquetas por ml, siendo administrada cada inyeccion posterior a un intervalo de un mes de la inyeccion previa. Es evidente en la figura que la administracion del concentrado de factores de crecimiento produce un aumento apreciable del crecimiento del cabello.

Ejemplo 9

Unos cuantos sujetos de estudio se trataron con el GFC preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 en el que el GFC se preparo a partir de 1250 x 106 plaquetas por ml. La FIG. 9 es una comparacion grafica de las puntuaciones PRTEE de un sujeto de estudio que padecla codo de tenista un mes despues de la finalizacion del tratamiento con el concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento en una(s) inyeccion(es) intra-articular de concentrado de factores de crecimiento derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml. Es evidente en la figura que la administracion del concentrado de factores de crecimiento produce una disminucion apreciable de la puntuacion PRTEE.

Ejemplo 10

Unos pocos sujetos de estudio se trataron con el GFC preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 en el que el GFC se preparo a partir de 1250 x 106 plaquetas por ml. La FIG. 10 es una comparacion fotografica de la reduccion de la hiperpigmentacion de un sujeto de estudio tres meses tras la finalizacion del tratamiento con concentrado de factores de crecimiento, consistiendo el tratamiento en una inyeccion intra-dermica de GFC derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml. Es evidente en la figura que la administracion de GFC produce una disminucion apreciable de la hiperpigmentacion periorbital alrededor de los ojos.

Ejemplo 11

Se trataron ratas Wistar con lesiones por quemaduras inducidas por cera de parafina caliente con el GFC derivado de 1250 x 106 plaquetas por ml preparado por el proceso de los Ejemplos 1 y 2. El tratamiento consistla en la aplicacion diaria topica de GFC. La FIG. 11 es una comparacion fotografica de las observaciones el dla 20 tras el tratamiento con GFC. Se observaba cicatrization de las lesiones por quemadura el dla 20 en las ratas tratadas con GFC preparado en los Ejemplos 1 y 2, al contrario que las ratas no tratadas.

Como es evidente a partir de los resultados anteriores, el GFC de la presente invention se derivo de un numero predeterminado de plaquetas dando lugar a cantidades proporcionales de factores de crecimiento que a su vez sirven para proporcionar resultados cllnicos uniformes. Las dosificaciones fijas de GFC se pueden administrar a los pacientes para tratar distintas afecciones dermatologicas, ortopedicas, neurologicas y endocrinas, incluyendo la alopecia androgenica, perdida del cabello, hiperpigmentacion periorbital, arrugas nasolabiales, arrugas faciales, acne, escaras de acne, heridas cronicas, codo de tenista, ulceras del pie diabeticas, fistulas, lesiones por quemaduras, y cambios dermatologicos relacionados con la edad no deseados. Ademas, se pierden menos del 10 % de las plaquetas en el procedimiento de la invencion. Tambien, las plaquetas se activan fisiologicamente sin la

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incorporacion de ningun material adicional o sustancia qulmica, como el cloruro calcico o la trombina bovina, y por lo tanto son seguros. Tambien, la unica congelacion-descongelacion hace que el procedimiento consuma menos tiempo y sea mas adecuado para la produccion a gran escala, y los factores de crecimiento no estan desnaturalizados como en el caso de las multiples congelaciones-descongelaciones.. Ademas, algunas indicaciones cllnicas necesitan una gran cantidad de factores de crecimiento pero algunas indicaciones necesitan muy pocos factores de crecimiento ya que la presencia de receptores de factores de crecimiento varla de un tipo celular a otro y de una indicacion a otra. Por lo tanto, la presente invencion proporciona GFC que tienen concentraciones

convencionalizadas que se pueden diluir segun la necesidad para hacerlo adecuado para las indicaciones cllnicas

especlficas. Otro beneficio del presente procedimiento es que se pueden preparar multiples dosis de GFC a partir de una unica extraccion de sangre, y por lo tanto este procedimiento es barato y no consume tiempo. Ademas, el GFC no muestra ninguna floculacion al almacenarlo a largo plazo de hasta seis meses a -20 °C. A veces se ve un

pequeno floculo que generalmente se disuelve en 2-3 minutos a temperatura ambiente y por lo tanto es posible

utilizar el GFC como un producto “listo para la venta” que se puede almacenar hasta durante seis meses sin ningun problema de perdida de potencia. Tambien, como el GFC es acelular y carente de membranas plasmaticas u otros materiales antigenicos, no provoca reacciones inmunitarias ni formacion de alo-anticuerpos. El GFC se puede producir opcionalmente libre de plasma de manera que se puede utilizar como un agente terapeutico sin ningun problema de plasma incompatible ABO que pueda producir reacciones inmunitarias. De manera alternativa, si los contenidos del plasma serviran como un armazon beneficioso para aplicaciones como la cicatrizacion de heridas, entonces se puede preparar tambien el GFC en plasma coincidente en ABO. El GFC tambien es susceptible a la liofilizacion de manera que el GFC se puede almacenar a temperatura ambiente o en un refrigerador a 4 °C sin ninguna degradation durante mas de un ano. Ademas, el GFC liofilizado se puede hacer en una crema, gel, solution acuosa, aerosol en pulverizador o parche transdermico. En definitiva, el GFC es un producto natural, es decir, no recombinante y el procedimiento proporcionado por la presente invencion para la produccion de GFC es economico. Ademas, el GFC muestra resultados cllnicos mejores debido a su significativamente alto nivel de factores de crecimiento en el GFC en comparacion con el HPL de multiples congelaciones-descongelaciones preparado por los procedimientos conocidos. El GFC tambien sirve para una terapia personalizada para pacientes que necesitan que se les administren concentraciones especlficas de GFC ya que el GFC se puede preparar en cualquier concentracion que se desee.

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de preparacion de un concentrado de factores de crecimiento derivado de plaquetas humanas que se pueden administrar por via intra-dermica, intra-articular, sub-dermica o topica que comprende las siguientes etapas:

a. suspender plaquetas humanas en un medio isotonico;

b. congelar instantaneamente la suspension;

c. descongelar la suspension congelada; y

d. esterilizar por filtracion la suspension

en el que se suspenden un numero fijo de plaquetas en un volumen fijo del medio isotonico para obtener la concentracion necesaria de factores de crecimiento en el concentrado de factores de crecimiento; la congelacion instantanea se lleva a cabo a una temperatura de -120 °C a -200 °C; la descongelacion se lleva a cabo de 25 °C a 37 °C; y los residuos celulares se separan de la suspension descongelada y la suspension de factores de crecimiento resultante se diluye con el medio isotonico antes de la esterilizacion por filtracion y opcionalmente se liofiliza con excipientes despues de la esterilizacion por filtracion, a condicion de que el medio isotonico de la etapa (a) sea plasma, el volumen de plasma no exceda de 5 ml.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, la congelacion se hace en nitrogeno liquido o helio liquido.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, la descongelacion se hace en un bano de agua esteril a 37 °C.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, el medio isotonico es una solucion isotonica de multiples electrolitos, plasma, plasma libre de plaquetas, plasma pobre en plaquetas o una combinacion de los mismos.
5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que, la solucion isotonica de multiples electrolitos se suplementa con excipientes farmaceuticamente aceptables.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, los residuos celulares se retiran de la suspension descongelada centrifugando la suspension descongelada de 11270 g a 17610 g durante 25 a 35 minutos y aislar el sobrenadante.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, los excipientes incluyen manitol, sacarosa, glicina o combinaciones de los mismos.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, las plaquetas de la etapa (a) se obtienen por plaquetoferesis, o por centrifugacion de la sangre completa.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, las plaquetas de la etapa (a) se obtienen por:

a. centrifugar al menos 10 ml de sangre humana con anticoagulante de 109 a 680 g durante 5 a 20 minutos;

b. aislar la capa mas superficial que contiene las plaquetas y centrifugar la misma de 680 g a 3442 g durante 5 a 15 minutos; y

c. aislar el aglomerado libre de plasma de plaquetas obtenidas al final de la etapa (b).
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 en el que, la centrifugacion de la etapa (a) se lleva a cabo a 382 g durante 5 minutos y la centrifugacion de la etapa (b) se lleva a cabo a 2720 g durante 10 minutos.
11. Una dosificacion de concentrado de factores de crecimiento administrable por via intra-dermica, intra-articular, sub-dermica o topica preparado por un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, derivado de aproximadamente 1250 x 106 plaquetas humanas por ml, comprendiendo el concentrado aproximadamente 900 a 2000 pg/ml de factor de crecimiento epidermico (EFG) ), 30 a 300 pg/ml de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), 20 a 100 pg/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico (b-FGF), 40000 a 120000 pg/ml de factor p de crecimiento transformante (TGF-p) y 200000 a 600000 pg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas AB (PDGF-AB) suspendidos en un medio isotonico, de aproximadamente 875 x 106 plaquetas humanas por ml, comprendiendo el concentrado aproximadamente 800 a 1200 pg/ml de EGF, 20 a 80 pg/ml de VEGF, 15 a 30 pg/ml de b-FGF, 30000 a 40000 pg/ml de TGF-p y 100000 a 200000 pg/ml de PDGF-Ab suspendidos en un medio isotonico; de aproximadamente 625 x 106 de plaquetas humanas, comprendiendo el concentrado aproximadamente 500 a 1000 pg/ml de EGF, 10 a 20 pg/ml de VEGF, 10 a 25 pg/ml de b-FGF, 20000 a 30000 pg/ml de TGF-p y 60000 a 150000 pg/ml de PDGF-AB suspendido en un medio isotonico.
12. Una composicion terapeutica que comprende el concentrado de factores de crecimiento administrable por via topica, intra-articular, sub-dermica, o intradermica preparado por el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de afecciones dermatologicas, ortopedicas, neurologicas y endocrinas, en el que se incluyen afecciones tales como alopecia androgenica, perdida del cabello, hiperpigmentacion periorbital, arrugas

nasolabiales, arrugas faciales, acne, escaras de acne, heridas cronicas, lesiones por quemaduras, codo de tenista, ulceras del pie diabeticas, fistulas, y cambios dermatologicos relacionados con la edad no deseados.
13. Una composicion terapeutica que comprende el concentrado de factores de crecimiento administrable por via topica, intra-articular, sub-dermica o intradermica preparado por el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 5 en el que el concentrado de factores de crecimiento esta en combinacion con constituyentes suplementarios que incluyen la sangre, solucion salina, nanoparticulas de plata, acido hialuronico, peptidos inmunomoduladores, factores de crecimiento, hormonas, antibioticos, anticuerpos monoclonales, receptores recombinantes, vehiculos o combinaciones de los mismos.