ES2837854T3

ES2837854T3 - Composiciones bioactivas derivables de concentrados plaquetarios y procedimientos para prepararlas y utilizarlas

Info

Publication number: ES2837854T3
Application number: ES14766283T
Authority: ES
Inventors: Erik Woods; Christopher Taylor
Original assignee: Cook General Biotechnolgy LLC
Current assignee: Cook General Biotechnolgy LLC
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2034-08-27
Also published as: CA2922205C; US20170319622A1; JP2016529283A; CA2922205A1; AU2014312421A1; KR102313054B1; MX2016002492A; EP3038628A1; US9757430B2; BR112016004510A2; CN105636599A; CN114392274A; WO2015031465A1; JP6649257B2; US20150064133A1; EP3038628B1; KR20160054496A

Abstract

Un procedimiento para preparar una composición bioactiva, que comprende: lisar plaquetas de un concentrado derivado de sangre humana que contenga plaquetas y plasma, para formar una preparación plaquetaria lisada; formar un coágulo de gel a partir de la preparación plaquetaria lisada mediante la adición de un agente de coagulación para convertir fibrinógeno en fibrina en la preparación plaquetaria lisada; comprimir el coágulo de gel para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel y separar el líquido de los sólidos del coágulo de gel, en el que la etapa de compresión comprende presionar el coágulo de gel entre dos o más superficies; en el que no se añade heparina durante la preparación de la composición bioactiva.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones bioactivas derivables de concentrados plaquetarios y procedimientos para prepararlas y utilizarlas ANTECEDENTES

[0001] La presente descripción se refiere generalmente al campo de los materiales bioactivos derivados de productos plaquetarios de sangre animal y procedimientos de preparación y uso de estos.

[0002] La administración de células o composiciones que contienen células para el tratamiento terapéutico se está convirtiendo en una modalidad de tratamiento cada vez más popular. Dichos tratamientos pueden incluir, por ejemplo, la administración de células madre mesenquimatosas (MSC, del inglés Mesenchymal Stem Cells), que tienen la posibilidad de diferenciarse en células de linaje mesenquimatoso, como, por ejemplo, hueso, grasa, cartílago o músculo.

[0003] Para obtener cantidades terapéuticas de células para trasplante, a menudo es necesario expandir una población de células a partir de una población inicial. Los medios de cultivo utilizados para expandir la población de células proporcionan nutrientes esenciales para el metabolismo, el crecimiento y la proliferación celular. El suero fetal bovino (FBS, del inglés Fetal Bovine Serum) se utiliza a menudo como un suplemento para fomentar la expansión de la población. El FBS ha sido un suplemento preferido debido a su bajo nivel de anticuerpos, porque contiene muchos factores de crecimiento que estimulan el crecimiento y la proliferación celular y porque es relativamente barato de fabricar. Sin embargo, el FBS ha presentado desventajas que incluyen el riesgo de transmisión de patógenos tales como en el caso de la encefalopatía espongiforme bovina.

[0004] El lisado plaquetario humano (hPL, del inglés human Patelet Lysate) ha surgido como una posible alternativa no xenógena al FBS. El hPL se deriva de plaquetas que se sabe que contienen una variedad de factores de crecimiento. Además de los factores de crecimiento, las técnicas actuales de aislamiento de hPL habitualmente dan como resultado composiciones que retienen una alta concentración de fibrinógeno, una glicoproteína involucrada en la formación de coágulos. Debido a su contenido de fibrinógeno y su tendencia a coagularse, las composiciones comerciales actuales de hPL a menudo se utilizan junto con uno o más aditivos anticoagulantes, normalmente heparina. Los aditivos anticoagulantes en hPL aumentan el coste de producción y/o uso del hPL y pueden ser problemáticos en situaciones en las que la bioactividad de la heparina sea perjudicial. Además, aunque se ha propuesto una variedad de procedimientos para producir hPL, los intentos de lograr perfiles de composición diana o bioactividades para el producto de hPL a menudo han conducido a la complejidad del procedimiento y/o requisitos de equipos intensivos. La adopción considerable del hPL como un sustituto del FBS requerirá procedimientos económicamente viables que, sin embargo, produzcan composiciones deseables y eficaces.

[0005] En vista de estos antecedentes, existen necesidades para las composiciones de lisado plaquetario humano que sustancialmente no contengan fibrinógeno, que retengan factores de crecimiento beneficiosos para la proliferación celular y que puedan fabricarse fácil y económicamente.

RESUMEN

[0006] Con base en la descripción contenida en esta invención, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición bioactiva, que comprende: lisar plaquetas de un concentrado derivado de la sangre humana que contiene plaquetas y plasma, para formar una preparación plaquetaria lisada; formar un coágulo de gel a partir de la preparación plaquetaria lisada mediante la adición de un agente de coagulación para convertir fibrinógeno en fibrina en la preparación plaquetaria lisada; comprimir el coágulo de gel para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel y separar el líquido de los sólidos del coágulo de gel, en el que la etapa de compresión comprende presionar el coágulo de gel entre dos o más superficies; en el que no se añade heparina durante la preparación de la composición bioactiva.

[0007] El objetivo en cuestión de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

[0008] En términos más generales, se ha descubierto que las fracciones bioactivas ventajosas de concentrados plaquetarios derivados de la sangre, preferentemente humanos, se pueden procesar de forma única a partir de los concentrados. Las fracciones bioactivas pueden tener perfiles de composición novedosos de factores de crecimiento y/u otras sustancias presentes en los concentrados iniciales, y los procedimientos de procesamiento pueden implicar técnicas novedosas para coagular y separar fracciones de los concentrados y/u operaciones de filtración de profundidad novedosas para aclarar fracciones líquidas derivadas de los concentrados.

[0009] En un aspecto de la descripción, un procedimiento para procesar una composición de lisado plaquetario incluye las etapas de lisado plaquetario de un concentrado derivado de la sangre humana que contiene plaquetas y plasma para formar una preparación plaquetaria lisada, formar un gel de coágulo mediante la conversión de fibrinógeno en fibrina en la preparación plaquetaria lisada y comprimir el gel de coágulo para extraer mediante presión líquido del gel de coágulo.

[0010] En otro aspecto, un procedimiento incluye pasar una fracción bioactiva líquida de un concentrado plaquetario derivado de la sangre que comprende componentes naturales del concentrado plaquetario que incluyen fibrinógeno, albúmina, globulina y al menos uno de entre, y opcionalmente todos, TGF-p1, EGF, FGF-beta, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1a y VEGF, en el que el fibrinógeno está presente a un nivel inferior a 20000 ng/ml, a través de al menos un primer filtro de profundidad, para eliminar sólidos suspendidos de la fracción bioactiva. El concentrado plaquetario es preferentemente un concentrado plaquetario humano. En modos preferidos, la fracción bioactiva líquida se hace pasar a través del primer filtro de profundidad y también a través de un segundo filtro de profundidad, donde el segundo filtro de profundidad tiene opcionalmente una clasificación nominal de micrómetros menor que la del primer filtro de profundidad.

[0011] En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende una fracción bioactiva de un concentrado plaquetario derivado de la sangre humana, donde el concentrado plaquetario contiene plaquetas humanas y plasma humano, donde la fracción bioactiva comprende componentes naturales del concentrado plaquetario que incluyen fibrinógeno, albúmina, globulina, TGF-p1, EGF, FGF-beta, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1a o VEGF. La fracción bioactiva puede tener el fibrinógeno presente a un nivel menor que aproximadamente 20000 ng/ml, por ejemplo, en el intervalo comprendido entre aproximadamente 500 ng/ml y aproximadamente 20000 ng/ml, y/o la fracción bioactiva, o un medio de cultivo celular que la contiene, puede no presentar o esencialmente no presentar heparina añadida (es decir, heparina no natural del material de partida del concentrado de plaquetas). La fracción bioactiva puede tener niveles o proporciones de factores de crecimiento como se describe en esta invención. En determinadas realizaciones, la fracción bioactiva es una fracción bioactiva líquida y los componentes nativos incluyen: fibrinógeno a un nivel menor que 20000 ng/ml de la fracción bioactiva líquida, por ejemplo, en el intervalo comprendido entre aproximadamente 500 ng/ml y aproximadamente 20000 ng/ml;

albúmina a un nivel de al menos 2 mg/dl de la fracción bioactiva líquida;

globulina a un nivel de al menos 1 g/dl de la fracción bioactiva líquida;

TGF-p1 a un nivel de al menos 5000 picogramos/ml («pg/ml») de la fracción bioactiva líquida;

EGF a un nivel de al menos 20 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

FGF-beta a un nivel de al menos 5 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-AA a un nivel de al menos 200 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-BB a un nivel de al menos 50 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

SDF-1a a un nivel de al menos 100 pg/ml de la fracción bioactiva líquida; y

VEGF a un nivel de al menos 10 pg/ml de la fracción bioactiva líquida.

[0012] La presente descripción también proporciona un procedimiento para preparar una composición bioactiva, que comprende las etapas de: agregar un agente de coagulación a una composición de lisado plaquetario para formar un material coagulado, separar sólidos coagulados del líquido en el material coagulado y someter el líquido a una filtración estéril profunda. En algunas formas, el procedimiento también incluye empaquetar la composición bioactiva en un recipiente estéril.

[0013] En determinadas realizaciones, la fracción bioactiva es una fracción bioactiva líquida y los componentes nativos incluyen:

FGF-2 a un nivel entre aproximadamente 200 pg/ml y aproximadamente 350 pg/ml;

EGF a un nivel entre aproximadamente 1800 pg/ml y aproximadamente 3100 pg/ml;

PDGF-AA a un nivel entre aproximadamente 24000 pg/ml y aproximadamente 28000 pg/ml;

PDGF-BB a un nivel entre aproximadamente 50 ng/ml y aproximadamente 80 ng/ml;

VEGF a un nivel entre aproximadamente 500 pg/ml y aproximadamente 800 pg/ml;

TGF-b a un nivel entre aproximadamente 60 ng/ml y aproximadamente 90 ng/ml; y

fibrinógeno a un nivel menor que 2,5 mg/ml.

[0014] Las realizaciones adicionales descritas en esta invención se refieren a usos de fracciones o composiciones bioactivas descritas en esta invención para cultivo celular, crioconservación o fines terapéuticos.

[0015] Otras realizaciones adicionales, así como también características y ventajas, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de las descripciones en esta invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0016]

La figura 1 ilustra un procedimiento para preparar una fracción bioactiva líquida de una composición de concentrado plaquetario humano.

La figura 2 es una vista en perspectiva de una realización de una fracción bioactiva líquida de la presente descripción en un paquete estéril.

La figura 3 es una vista en perspectiva de una realización de una fracción bioactiva líquida de la presente descripción en un frasco cuentagotas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0017] A los efectos de facilitar una comprensión de los principios de la descripción, ahora se hará referencia a ciertas realizaciones, y se utilizará un lenguaje específico para describirlas. Sin embargo, se entenderá que no se pretende limitar el alcance de la descripción. Cualquier alteración y modificación adicional en las realizaciones descritas, y cualquier aplicación adicional de los principios de la descripción como se describe en esta invención se contemplan como normalmente se le ocurriría a un experto en la materia a la que se refiere la descripción.

[0018] En general, la presente descripción proporciona composiciones bioactivas y procedimientos para hacer composiciones bioactivas, que se pueden usar, por ejemplo, como suplementos de cultivo celular y/o productos terapéuticos. Las composiciones de la presente descripción incluyen composiciones derivadas de fuentes humanas, por lo que se superan problemas asociados con composiciones xenógenas tales como el FBS. Además, las composiciones preferidas de la presente descripción, aunque conservan factores de crecimiento importantes y otras sustancias químicas, tienen un bajo contenido de fibrinógeno y no requieren la adición de anticoagulantes tales como la heparina para impedir la coagulación problemática durante el uso.

[0019] De vuelta ahora a la figura 1, se muestra un procedimiento ilustrativo 100 para preparar una fracción bioactiva a partir de una composición de concentrado plaquetario. El procedimiento incluye las etapas de: obtener un concentrado de plaquetas 01, congelar el concentrado de plaquetas 02, descongelar el concentrado de plaquetas 03, agregar agente de coagulación al concentrado de plaquetas 04, separar los sólidos de coágulo de un líquido 05, filtrar el líquido con un primer filtro de profundidad 06, filtrar el líquido con un segundo filtro de profundidad 07, filtrar el líquido con un filtro estéril 08 y envasar el líquido 09. Los debates que se exponen a continuación amplían en algunos aspectos las opciones para cada una de las etapas generales descritas; Sin embargo, se entenderá que no se requieren todas las etapas generales representadas para todas las realizaciones en esta invención, y que los procedimientos novedosos que incluyen características correspondientes a una, algunas o todas las etapas representadas se contemplan como realizaciones en esta invención.

[0020] Las composiciones de concentrado de plaquetas utilizadas como material base para los procedimientos descritos y las fracciones bioactivas pueden obtenerse de cualquier manera adecuada. Tal como se usa en esta invención, el término concentrado de plaquetas se refiere a una composición líquida que contiene plaquetas que se han concentrado a partir de una fuente de sangre. La fuente de sangre es preferentemente sangre humana, tal como sangre periférica humana completa. El concentrado plaquetario incluye preferentemente tanto plaquetas como proteínas plasmáticas, y puede proporcionarse mediante unidades plaquetarias obtenidas a partir de sangre periférica completa de donantes humanos mediante aféresis. Se prevé que la sangre completa de otras especies, por ejemplo, especies de mamíferos, también se puedan usar como fuente para que los concentrados plaquetarios se procesen como se describe en esta invención. En determinadas realizaciones, las unidades plaquetarias de distintos donantes humanos u otros donantes se pueden agrupar en algún momento durante el procesamiento para obtener la fracción bioactiva. En la práctica típica de hoy, cada unidad plaquetaria aferizada de donante humano tiene un volumen comprendido entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 ml, más habitualmente entre aproximadamente 100 y 400 ml, y contiene aproximadamente entre 100 y 500 x 109 plaquetas junto con plasma aislado con las plaquetas durante el procedimiento de aféresis. Las unidades de plaquetas de aféresis humanas donadas tienen una vida útil relativamente breve para su uso en los centros de atención médica, generalmente aproximadamente cinco días. Las unidades plaquetarias utilizadas en los procedimientos de la presente pueden ser unidades plaquetarias de aféresis humana recientemente caducadas obtenidas de centros de atención médica, y opcionalmente pueden almacenarse congeladas a cualquier temperatura adecuada, por ejemplo, aproximadamente -20 °C, antes de usarse para preparar una fracción bioactiva como se describe en esta invención.

[0021] En la preparación de la fracción bioactiva, el contenido de las plaquetas se puede liberar mediante un procedimiento adecuado. En algunos modos, las plaquetas se lisan sometiéndolas a al menos un ciclo de congelacióndescongelación para liberar el contenido de las plaquetas y opcionalmente múltiples ciclos de congelacióndescongelación (por ejemplo, 2 o 3 ciclos de congelación-descongelación). En el uso de un ciclo de congelacióndescongelación, el concentrado de plaquetas se puede congelar a cualquier temperatura adecuada. En algunos aspectos, el concentrado de plaquetas se congela a una temperatura comprendida entre aproximadamente -10 °C y aproximadamente -80 °C. En realizaciones preferidas específicas, el concentrado de plaquetas se congela a aproximadamente -20 °C. Para lisar las plaquetas, el concentrado de plaquetas congelado se descongela, por ejemplo, en un baño de agua a 37 °C o mediante otros medios eficaces, para formar una composición de lisado plaquetario «bruto». El lisado plaquetario bruto contiene las membranas plaquetarias lisadas y los factores de crecimiento y otras sustancias liberadas de las plaquetas lisadas. Cuando el concentrado plaquetario que se descongela contiene plasma junto con las plaquetas, el lisado plaquetario también contendrá plasma, incluidas proteínas plasmáticas en el mismo. En determinados aspectos en esta invención, se pueden usar otras técnicas para liberar contenido plaquetario, por ejemplo, la activación con trombina. Sin embargo, la congelación-descongelación u otras técnicas mecánicas para lisar las plaquetas se consideran ventajosas, ya que no requieren la adición de una proteína no natural (por ejemplo, trombina) al concentrado de plaquetas, cuya adición aumenta el coste y conduce a la presencia de al menos parte de la trombina en el material procesado posterior.

[0022] El lisado plaquetario bruto contiene múltiples factores de crecimiento del material de partida del concentrado plaquetario. Estos pueden incluir, por ejemplo, factor de crecimiento y transformación beta 1, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor derivado de células estromales 1a y factor de crecimiento endotelial vascular.

[0023] El factor de crecimiento y transformación beta 1 (TGF-p1) es un péptido multifuncional que controla la proliferación, la diferenciación y otras funciones en muchos tipos de células. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) estimula la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia. El factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-b) promueve la angiogénesis y se une a la heparina, que estimula una amplia variedad de células. El factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA) es una glicoproteína dimérica que regula el crecimiento y la división celular y promueve la angiogénesis. El factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB) es una glicoproteína dimérica que regula el crecimiento y la división celular y promueve la angiogénesis. El factor derivado de células estromales 1a (SDF-1a) activa los leucocitos y promueve la angiogénesis.

[0024] El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) contribuye a la vasculogénesis y angiogénesis.

[0025] En determinadas realizaciones, el lisado plaquetario bruto incluye los factores de crecimiento y cantidades de estos siguientes (en función del volumen de concentrado plaquetario original no diluido):

entre aproximadamente 50000 y aproximadamente 150000 pg/ml deTGF-p1, preferentemente entre aproximadamente 70000 y aproximadamente 120000 pg/ml de TGF-p1; y/o

entre aproximadamente 100 y 600 pg/ml de EGF, preferentemente entre aproximadamente 200 y aproximadamente 600 pg/ml de EGF; y/o

entre aproximadamente 5 y aproximadamente 250 pg/ml de FGF-b; preferentemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 pg/ml de FGF-b; y/o

entre aproximadamente 500 y aproximadamente 20000 pg/ml de PDGF-AA, preferentemente entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 15000 pg/ml de PDGF-AA;

y/o

entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 20000 pg/ml de PDGF-BB, preferentemente entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 15000 pg/ml de PDGF-BB;

y/o

entre aproximadamente 400 y 1100 pg/ml de SDF-1a, preferentemente entre aproximadamente 500 y aproximadamente 1000 pg/ml de SDF-1a; y/o

entre aproximadamente 10 y aproximadamente 800 pg/ml de VEGF, preferentemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 600 pg/ml de VEGF.

[0026] En formas preferidas, el lisado plaquetario bruto también incluye uno o más componentes derivados del plasma en el material de partida del concentrado plaquetario, incluidos, por ejemplo, fibrinógeno, globulinas, albúmina, triglicéridos, glucosa, sodio, calcio y/o colesterol. En formas preferidas, el lisado plaquetario bruto incluye los componentes y cantidades siguientes:

entre aproximadamente 0,5 y 2,5 g/dl de globulinas, preferentemente entre aproximadamente 1,5 y 2,5 g/dl de globulinas;

entre aproximadamente 2 y 5 g/dl de albúmina, preferentemente entre aproximadamente 3 y 4 g/dl de albúmina; entre aproximadamente 100 y 200 mmol/l de sodio, preferentemente entre aproximadamente 120 y aproximadamente 160 mmol/l de sodio;

entre aproximadamente 40 y 200 mg/dl de triglicéridos, preferentemente entre aproximadamente 50 y 120 mg/dl de triglicéridos;

entre aproximadamente 150 y 300 mg/dl de glucosa, preferentemente entre aproximadamente 150 y 250 mg/dl de glucosa;

entre aproximadamente 5 y 12 mg/dl de calcio, preferentemente entre aproximadamente 6 y 10 mg/dl de calcio; y/o

entre aproximadamente 1 y 3,5 millones de ng/ml de fibrinógeno, preferentemente entre aproximadamente 1,5 y 2,5 millones de ng/ml de fibrinógeno.

[0027] El lisado plaquetario bruto también puede contener otras sustancias bioactivas, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral. Estas interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral pueden incluir, por ejemplo, una, algunas o todas de entre interleucina (IL)-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, interferón-gama (IFN-gamma) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa).

[0028] En determinadas realizaciones en esta invención, el lisado plaquetario bruto se procesa para eliminar la materia particulada, por ejemplo, se centrifuga y se esteriliza para su uso como un producto de lisado plaquetario. Dicha esterilización puede incluir, por ejemplo, pasar el lisado plaquetario bruto reducido de la materia particulada a través de un filtro estéril.

[0029] En algunas realizaciones en esta invención, el lisado plaquetario bruto se trata para recuperar una fracción de este con una concentración de fibrinógeno reducida. El fibrinógeno puede eliminarse mediante cualquier técnica adecuada, incluida, por ejemplo, mediante conversión a fibrina, que da como resultado la formación de material de coágulo sólido, que puede separarse de una fracción bioactiva líquida. Dicha conversión a fibrina se puede inducir mediante la adición de un agente de coagulación. Según algunas formas de poner en práctica los procedimientos descritos, se puede agregar un agente de coagulación, por ejemplo, una sal de cloruro de calcio, al lisado plaquetario bruto. Ilustrativamente, se puede agregar una sal de cloruro de calcio al lisado plaquetario bruto en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1 g y 2 g por litro de lisado plaquetario bruto. En realizaciones preferidas, se añaden entre aproximadamente 0,4 g y aproximadamente 0,75 g de una sal de cloruro de calcio por litro de lisado plaquetario bruto. El lisado plaquetario combinado con cloruro de calcio u otro agente de coagulación puede colocarse en un agitador o agitarse de otro modo para asegurar la mezcla completa del agente de coagulación con el concentrado. A continuación se permite que la mezcla resultante forme un material de coágulo sólido, en determinadas realizaciones durante un período de al menos aproximadamente 8 horas o al menos aproximadamente 12 horas, y normalmente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 36 horas. En formas preferidas, al menos una cantidad predominante (más del 50 %) del material coagulado resultante, y potencialmente al menos el 80 % o al menos el 90 % del material coagulado resultante, está constituida por un gel de coágulo sustancialmente homogéneo. Dicho gel de coágulo sustancialmente homogéneo puede presentar una fase de gel consistente en todo el material, con líquido en suspensión dentro de una matriz de fibrina continua. Estas formas preferidas de material coagulado son distintas de los materiales concentrados de plaquetas coaguladas en los que una multitud de partículas de coágulos sólidos discretos se suspenden en una fase líquida, como sería deseable para una técnica de separación posterior basada en centrifugación.

[0030] Después de que se haya formado un coágulo, el material líquido se puede separar del material sólido del coágulo. Se puede usar cualquier técnica adecuada para este propósito. En formas preferidas, el material coagulado se presiona entre dos o más superficies para separar los sólidos coagulados del líquido. En los casos en que el material coagulado presenta la forma de un gel de coágulo sustancialmente homogéneo como se explica en esta invención, dicho prensado puede extraer mediante presión el líquido del material de gel mientras comprime y condensa la matriz de fibrina del gel. El prensado del material coagulado puede en algunas formas llevarse a cabo en un recipiente flexible tal como una bolsa de plástico. El gel de coágulo se puede presionar, por ejemplo, manualmente 0 mediante la aplicación forzada de un implemento, a una región (por ejemplo, extremo) de la bolsa u otro recipiente flexible y el líquido extraído mediante presión a partir de la matriz de fibrina sólida se puede acumular en otra región (por ejemplo, extremo) de la bolsa u otro recipiente flexible. Se puede conectar una segunda bolsa u otro recipiente a la primera bolsa donde se produce el prensado, ya sea durante o después del prensado, y el material líquido se puede transferir a la segunda bolsa u otro recipiente. En otros modos, el gel de coágulo puede estar en un recipiente rígido tal como un cubo, y puede presionarse a mano o con la aplicación forzada de un implemento para extraer mediante presión el líquido de la matriz de fibrina sólida y comprimir y condensar la matriz de fibrina.

[0031] Después de la coagulación y separación de los materiales líquidos y sólidos del concentrado plaquetario coagulado, el líquido separado tiene una concentración reducida de fibrinógeno en comparación con el lisado plaquetario bruto antes de la coagulación. En formas preferidas, el lisado plaquetario bruto tiene un contenido de fibrinógeno de al menos un millón de ng/ml, normalmente en el intervalo comprendido entre aproximadamente 1 500000 y 3500000 (1,5 a 3,5 millones) ng/ml, y después de la coagulación y separación el líquido tiene un contenido de fibrinógeno menor que aproximadamente 50000 ng/ml, preferentemente menor que aproximadamente 20000 ng/ml, y más preferentemente menor que aproximadamente 10000 ng/ml. Ilustrativamente, este líquido separado puede tener un contenido de fibrinógeno en el intervalo comprendido entre aproximadamente 500 ng/ml y aproximadamente 20000 ng/ml, o entre aproximadamente 500 ng/ml y aproximadamente 10000 ng/ml. Adicional o alternativamente, este líquido separado puede contener menos de aproximadamente el 5 % del fibrinógeno presente en el concentrado plaquetario antes de la coagulación, preferentemente menos de aproximadamente el 2 %, y más preferentemente menos de aproximadamente el 1 %. Además, este líquido separado puede constituir al menos aproximadamente el 70 % del volumen del lisado plaquetario bruto, preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, y normalmente en el intervalo comprendido entre aproximadamente el 75 % y aproximadamente el 90 %.

[0032] La fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno recuperada después de la coagulación del lisado plaquetario bruto y la separación de un sólido de un líquido contiene múltiples factores de crecimiento del lisado plaquetario bruto. Estos pueden incluir TGF-p1, EGF, FGF-beta, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1a y VEGF. En determinadas realizaciones, esta fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno incluye los factores de crecimiento y cantidades de estos del lisado plaquetario bruto siguientes:

entre aproximadamente 50000 y aproximadamente 150000 pg/ml de TGF-p1, preferentemente entre aproximadamente 70000 y aproximadamente 120000 pg/ml de TGF-p1;

entre aproximadamente 20 y 800 pg/ml de EGF, preferentemente entre aproximadamente 400 y aproximadamente 800 pg/ml de EGF; y/o

entre aproximadamente 5 y aproximadamente 250 pg/ml de FGF-b, preferentemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 pg/ml de FGF-b; y/o

entre aproximadamente 500 y aproximadamente 25000 pg/ml de PDGF-AA, preferentemente entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 18000 pg/ml de PDGF-AA; y/o

entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 25000 pg/ml de PDGF-BB, preferentemente entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 18000 pg/ml de PDGF-BB; y/o

entre aproximadamente 400 y 1000 pg/ml de SDF-1a, preferentemente entre aproximadamente 500 y aproximadamente 900 pg/ml de SDF-1a; y/o

entre aproximadamente 10 y aproximadamente 600 pg/ml de VEGF, preferentemente entre aproximadamente 150 y aproximadamente 450 pg/ml de VEGF.

[0033] En otras realizaciones, la fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno incluye los factores de crecimiento y cantidades de estos del lisado plaquetario bruto siguientes:

FGF-2 (es decir, FGF-b) a un nivel entre aproximadamente 200 ng/ml y aproximadamente 350 ng/ml; y/o EGF a un nivel entre aproximadamente 1800 pg/ml y aproximadamente 3100 pg/ml; y/o

PDGF-AA a un nivel entre aproximadamente 24000 pg/ml y aproximadamente 28000 pg/ml; y/o

PDGF-BB a un nivel entre aproximadamente 50 ng/ml y aproximadamente 80 ng/ml; y/o VEGF a un nivel entre aproximadamente 500 pg/ml y aproximadamente 800 pg/ml; y/o TGF-b a un nivel entre aproximadamente 60 ng/ml y aproximadamente 90 ng/ml.

En algunas formas, la fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno también tiene un contenido de fibrinógeno inferior a 3 pg/ml, preferentemente inferior a 2,5 pg/ml.

[0034] En formas preferidas, esta fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno también incluye uno o más componentes derivados del plasma en el material de partida del concentrado plaquetario, incluidos, por ejemplo, globulinas, albúmina, triglicéridos, glucosa, sodio y/o calcio. Cuando se usa una sal de cloruro de calcio para coagular el lisado plaquetario bruto, el calcio presente en el agente bioactivo líquido separado puede ser tanto del lisado como de la sal de calcio añadida. En determinadas realizaciones, esta fracción bioactiva líquida separada incluye los componentes y cantidades del lisado plaquetario bruto siguientes:

Entre aproximadamente 0,5 y 2,5 g/dl de globulinas, preferentemente entre aproximadamente 1 y 2 g/dl de globulinas;

entre aproximadamente 40 y 70 mg/dl de triglicéridos, preferentemente entre aproximadamente 50 y 65 mg/dl de triglicéridos; y/o

entre aproximadamente 150 y 300 mg/dl de glucosa, preferentemente entre aproximadamente 150 y 250 mg/dl de glucosa.

[0035] Además, cuando se usa una sal de cloruro de calcio como agente de coagulación para el lisado plaquetario bruto, esta fracción bioactiva líquida separada puede en algunas formas incluir calcio a un nivel entre aproximadamente 15 y 35 mg/dl, y preferentemente entre aproximadamente 15 y 25 mg/dl.

[0036] Según algunos modos de poner en práctica la invención, la fracción bioactiva líquida se pasa a través de un filtro estéril. En realizaciones preferidas, el filtro estéril comprende un filtro estéril de 0,2 mm. Después del paso a través del filtro estéril, la fracción bioactiva líquida puede sellarse dentro de un recipiente estéril.

[0037] Determinadas realizaciones de la invención en esta invención incluyen filtrar la fracción bioactiva líquida recuperada después de las etapas de coagulación y separación de un sólido de un líquido, por ejemplo, para eliminar sólidos suspendidos tales como cualquier residuo plaquetario restante, residuo celular y sólidos del coágulo. En modos preferidos, dicho filtrado incluye procesar la fracción bioactiva líquida a través de al menos un filtro de profundidad, y preferentemente múltiples filtros de profundidad, tales como dos o tres filtros de profundidad de posiblemente distintas clasificaciones de micrómetros. En este sentido, como se conoce y como se usa en esta invención, un «filtro de profundidad» o «filtración de profundidad» se refiere a un filtro o una filtración, respectivamente, que utiliza un medio de filtración poroso para retener partículas en todo el medio, en lugar de solo en la superficie del medio. Además, como se conoce y como se usa en esta invención, «clasificación de micrómetros nominal» cuando se aplica a un filtro significa el tamaño de partícula por encima del cual se eliminará el 98 % de todos los sólidos suspendidos a lo largo de la capacidad nominal del filtro. Determinadas variantes de la invención incluyen filtración a través de al menos un filtro de profundidad seguido de al menos un filtro estéril. Las variantes de la invención adicionales incluyen filtración a través de al menos dos filtros de profundidad seguidos de al menos un filtro estéril. En formas preferidas, el filtro de profundidad o los filtros de profundidad utilizados tienen un medio de filtro con una carga superficial positiva.

[0038] En determinadas realizaciones, el primer y segundo filtro de profundidad se utilizan en la filtración de profundidad de la fracción bioactiva líquida. El primer filtro de profundidad tiene una clasificación nominal de micrómetros mayor que la del segundo filtro de profundidad. En algunas formas, el primer filtro de profundidad tiene una clasificación nominal de micrómetros entre aproximadamente 10 y 0,1 micrómetros. En realizaciones preferidas, el primer filtro de profundidad tiene una clasificación nominal de micrómetros entre 5 y 0,1 micrómetros, incluso más preferentemente entre aproximadamente 3 y 0,2 micrómetros. En determinadas realizaciones, el primer filtro de profundidad tiene una membrana de celulosa y un medio de filtro que comprende fibras de celulosa y un auxiliar de filtro inorgánico, tal como tierra de diatomea, con una carga superficial positiva.

[0039] En determinadas realizaciones, el segundo filtro de profundidad tiene un valor nominal de micrómetros menor que el del primer filtro de profundidad, por ejemplo, en algunas formas menor que aproximadamente 0,5 micrómetros. En realizaciones preferidas, el segundo filtro de profundidad tiene una clasificación nominal de micrómetros entre 0,5 y 0,001 micrómetros, y más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 0,001 micrómetros. En determinadas realizaciones, el primer filtro de profundidad tiene una membrana de celulosa y un medio de filtro que comprende fibras de celulosa y un auxiliar de filtro inorgánico, tal como tierra de diatomea, con una carga superficial positiva.

[0040] En formas preferidas, la fracción bioactiva líquida, después de la filtración de profundidad u otra filtración para eliminar sólidos suspendidos, todavía contiene múltiples factores de crecimiento del lisado plaquetario bruto. Estos pueden incluir TGF-p1, EGF, FGF-beta, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1a y VEGF. En determinadas realizaciones, esta fracción bioactiva líquida filtrada incluye los factores de crecimiento y cantidades de estos derivados del lisado plaquetario bruto siguientes:

entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 75.000 pg/ml de TGF-p1, preferentemente entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 60.000 pg/ml de TGF-p1;

entre aproximadamente 20 y 300 pg/ml de EGF, preferentemente entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 pg/ml de EGF;

entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 pg/ml de FGF-b, preferentemente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 130 pg/ml de FGF-b;

entre aproximadamente 200 y aproximadamente 4000 pg/ml de PDGF-AA, preferentemente entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 3000 pg/ml de PDGF-AA;

entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1000 pg/ml de PDGF-BB, preferentemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 pg/ml de PDGF-BB;

entre aproximadamente 100 y 700 pg/ml de SDF-1a, preferentemente entre aproximadamente 300 y aproximadamente 600 pg/ml de SDF-1a; y/o

entre aproximadamente 10 y 400 pg/ml de VEGF, preferentemente entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 pg/ml de VEGF.

[0041] En formas preferidas, esta fracción bioactiva líquida filtrada en profundidad u otra fracción bioactiva filtrada también incluye uno o más componentes derivados del plasma en el material de partida del concentrado plaquetario, incluidos, por ejemplo, globulinas, albúmina, triglicéridos, glucosa, sodio y/o calcio. De nuevo, cuando se usa una sal de cloruro de calcio para coagular el lisado plaquetario bruto, el calcio presente en el agente bioactivo líquido filtrado puede ser tanto del lisado como de la sal de calcio añadida. En determinadas realizaciones, esta fracción líquida bioactiva filtrada incluye los componentes y cantidades derivadas del lisado plaquetario bruto siguientes: entre aproximadamente 0,5 y 2,5 g/dl de globulinas, preferentemente entre aproximadamente 1 y 2 g/dl de globulinas;

entre aproximadamente 50 y 120 mg/dl de triglicéridos, preferentemente entre aproximadamente 60 y 110 mg/dl de triglicéridos; y/o

[0042] Además, cuando se usa una sal de cloruro de calcio como agente de coagulación para el lisado plaquetario bruto, esta fracción líquida bioactiva separada puede en algunas formas incluir calcio a un nivel entre aproximadamente 15 y 60 mg/dl, y preferentemente entre aproximadamente 20 y 50 mg/dl.

[0043] La fracción líquida bioactiva también puede incluir otras sustancias bioactivas, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral. Estas interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral pueden incluir, por ejemplo, una, algunas o todas de entre interleucina (IL)-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, interferón-gama (IFN-gamma) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa).

[0044] Como se señaló anteriormente, en algunas realizaciones de los procedimientos en esta invención, la fracción bioactiva líquida se pasa a través de al menos un filtro estéril, preferentemente después del paso a través del o los filtros de profundidad u otros filtros para eliminar sólidos suspendidos como se ha explicado anteriormente. Se conocen una variedad de filtros estériles y procedimientos asociados y se pueden usar. Los contaminantes ejemplares que se eliminarán mediante los filtros estériles incluyen, por ejemplo: Staphyloccus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niger, Mycoplasma y/o Bacillus subtilis. El o los filtros estériles pueden seleccionarse para presentar una unión a proteínas relativamente baja. Después de la filtración estéril, en formas preferidas, la fracción bioactiva líquida filtrada estéril puede tener los mismos componentes como se especificó anteriormente para la fracción bioactiva líquida filtrada a profundidad u otra fracción bioactiva líquida filtrada, y también tiene niveles de esos componentes dentro de los intervalos especificados anteriormente para la fracción bioactiva líquida filtrada a profundidad o de otra manera. Sin embargo, se entenderá que puede ocurrir alguna reducción en los niveles de algunos o todos los componentes durante la filtración estéril.

[0045] En determinadas realizaciones preferidas, una composición de fracción bioactiva líquida estéril, que se puede obtener mediante las etapas descritas anteriormente de lisis plaquetaria, reducción de fibrinógeno y filtración de profundidad o de otra manera para eliminar partículas suspendidas, incluye:

fibrinógeno a un nivel menor que 20000 ng/ml de la fracción bioactiva líquida, por ejemplo, en el intervalo comprendido entre aproximadamente 500 ng/ml y aproximadamente 20000 ng/ml;

albúmina a un nivel de al menos 2 mg/dl de la fracción bioactiva líquida;

globulina a un nivel de al menos 1 g/dl de la fracción bioactiva líquida;

TGF-p1 a un nivel de al menos 5000 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

EGF a un nivel de al menos 20 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

FGF-beta a un nivel de al menos 5 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-AA a un nivel de al menos 200 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-BB a un nivel de al menos 50 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

SDF-1a a un nivel de al menos 100 pg/ml de la fracción bioactiva líquida; y

VEGF a un nivel de al menos 10 pg/ml de la fracción bioactiva líquida.

[0046] En algunas formas, las composiciones de fracciones bioactivas líquidas de la presente descripción también tienen las características siguientes:

un nivel de endotoxinas menor que aproximadamente 10 UE/ml;

menos de aproximadamente 25 mg/dl de hemoglobina;

entre aproximadamente 4 y 6 g/dl de proteína total;

una osmolaridad de entre aproximadamente 260 y 340 mmol/kg; y/o

un pH comprendido entre 6,8 y 7,8.

[0047] Estas características pueden estar presentes en la composición de lisado plaquetario bruto (posiblemente también después de la eliminación de sólidos por centrifugación o de otro modo y esterilización), la fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno recuperada después de la coagulación y la separación de un sólido de un líquido (y posiblemente esterilización), o la fracción bioactiva líquida reducida en fibrinógeno después de la filtración de profundidad y/o de otra manera para eliminar sólidos en suspensión (y posiblemente esterilización), como se describió anteriormente. Además, debido a que las formas preferidas de procesamiento no necesitan emplear detergente como agente de procesamiento, estas composiciones pueden no presentar o esencialmente no presentar residuos de detergente.

[0048] En algunos modos de funcionamiento, los procedimientos utilizados para hacer que la composición de fracción bioactiva líquida filtrada (por ejemplo, filtrada a profundidad) y reducida en fibrinógeno de la presente descripción resulte en reducciones de los niveles de factores de crecimiento, interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral identificados en esta invención. Como ejemplos, en determinadas realizaciones, la filtración de profundidad o de otra manera de la fracción reducida en fibrinógeno se lleva a cabo para eliminar sólidos en suspensión y da como resultado:

al menos una reducción del 20 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de uno, algunos o todos de entre TGF-p1, EGF, FGF-b, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1a y VEGF; y/o

al menos una reducción del 50 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de TGF-p1; y/o

al menos una reducción del 30 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de EGF; y/o

al menos una reducción del 20 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de FGF-b; y/o

al menos una reducción del 50 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de PDGF-AA; y/o

al menos una reducción del 50 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de PDGF-BB; y/o

al menos una reducción del 20 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de SDF-1a; y/o

al menos una reducción del 30 % en el nivel (por ejemplo, en pg/ml) de VEGF.

[0049] Adicional o alternativamente, la filtración de profundidad o de otra manera puede resultar en niveles muy importantes de eliminación de interleucina-17 (IL-17). En determinadas realizaciones, el nivel de IL-17 después de la filtración de profundidad o de otra manera para eliminar partículas, y también posiblemente en el producto final de fracción bioactiva líquida esterilizada, es menor que aproximadamente 1 pg/ml, más preferentemente menor que aproximadamente 0,75 pg/ml, e incluso más preferentemente menor que aproximadamente 0,5 pg/ml. La IL-17 es una citocina inflamatoria que también reacciona en cadena al activar la liberación de otras citocinas inflamatorias. Los productos preferidos que tienen niveles bajos de IL-17 como se identifican en esta invención se pueden usar con poca o ninguna actividad inflamatoria derivada de la presencia de IL-17.

[0050] Adicional o alternativamente, la filtración de profundidad o de otra manera de la fracción reducida en fibrinógeno para eliminar sólidos suspendidos puede dar como resultado un producto de fracción bioactiva líquida que tiene una concentración de PDGF-BB menor que 1000 pg/ml, una concentración de PDGF-AA menor que 3000 pg/ml, una concentración de TGF-p1 de al menos 5000 pg/ml y/o una concentración de VEGF menor que 300 pg/ml. Estos valores también pueden estar presentes en un producto esterilizado preparado (por ejemplo, mediante filtración estéril) después de la filtración de profundidad o de otra manera para eliminar sólidos suspendidos.

[0051] Según algunos modos descritos en esta invención, la fracción bioactiva líquida descrita en esta invención se puede procesar para retener beneficiosamente los componentes plasmáticos. Los componentes plasmáticos que pueden retenerse por la fracción bioactiva líquida incluyen: globulinas, albúmina, triglicéridos, glucosa, sodio y/o calcio. En algunas formas, la fracción bioactiva líquida contiene uno o más de dichos componentes plasmáticos, y posiblemente todos ellos, mientras que también tiene las características siguientes:

FGF-2 a un nivel de al menos 200 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

EGF a un nivel de al menos 1800 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-AA a un nivel de al menos 24000 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

PDGF-BB a un nivel de al menos 50 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

VEGF a un nivel de al menos 500 pg/ml de la fracción bioactiva líquida;

TGF-p1 a un nivel de al menos 60 ng/ml de la fracción bioactiva líquida; y

fibrinógeno a un nivel menor que 2,5 pg/ml de la fracción bioactiva líquida.

[0052] En algunas formas, las composiciones de fracciones bioactivas líquidas de la presente descripción se pueden envasar en un paquete estéril para su almacenamiento o administración. La fracción bioactiva líquida se puede envasar en su concentración recuperada completa, o se puede diluir con agua o un medio acuoso para su envasado y uso posterior, por ejemplo, se pueden preparar diluciones del 90 % al 10 % de la concentración original de la fracción bioactiva líquida, y dichas composiciones diluidas, y sus reducciones correspondientes resultantes en los niveles de componente especificados en esta invención, forman realizaciones adicionales descritas en esta invención. Una realización de dicho envase se ilustra en la figura 2. Según algunas formas de poner en práctica la descripción, la composición 200 se almacena en un frasco de medio estéril 210. Los frascos de medios estériles pueden, por ejemplo, tener una capacidad de volumen en el intervalo comprendido entre 50 ml y 5000 ml. Como ejemplos, se pueden usar frascos de 60 ml, 125 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml o 2000 ml. En algunas formas, el tapón 220 del frasco de medios estériles 210 está protegida por un envasado retráctil 230. En algunas formas, el frasco está envuelto con envasado retráctil. En determinadas realizaciones, el frasco está etiquetado con una etiqueta de producto final 240. En algunas formas, el frasco se coloca en una caja de producto con hielo seco.

[0053] En determinadas realizaciones, la composición de fracción bioactiva líquida de la presente descripción puede combinarse con otros ingredientes para formar un medio de cultivo celular. Dicho medio de cultivo celular comprende la fracción bioactiva líquida de la presente descripción mezclada con otros nutrientes o medios para el cultivo celular, incluidos, por ejemplo, los que se encuentran en medios de cultivo celular conocidos tales como medio esencial mínimo (MEM) o medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Un medio de cultivo celular según la presente descripción se formula para proporcionar nutrientes (por ejemplo, factores de crecimiento, etc.) necesarios para el crecimiento o mantenimiento de células como, por ejemplo, células madre y/o progenitoras, tales como células madre mesenquimatosas. Dicho medio de cultivo celular, en formas preferidas, no presenta heparina añadida y, sin embargo, no presenta ningún material coagulado (por ejemplo, como se evidenciaría por la aparición de partículas de coágulo visibles a simple vista, sin ampliación).

[0054] En otras realizaciones, la composición de fracción bioactiva líquida de la presente descripción, o una fracción de esta, puede usarse como una sustancia terapéutica. Por ejemplo, la composición puede usarse como una sustancia terapéutica para tratamientos médicos, incluso para el tratamiento de tejido enfermo o dañado, tal como tejido nervioso, tendón, hueso, músculo, piel (por ejemplo, cicatrización de heridas), conjuntivo, ocular y/o cardiovascular (por ejemplo, corazón o aorta). La fracción bioactiva líquida descrita en esta invención o las composiciones que la incluyen pueden administrarse a estos u otros tejidos mediante cualquier medio adecuado, incluidos, por ejemplo, inyección u otro implante quirúrgico. En determinados usos, en el tratamiento del tejido ocular, la composición bioactiva líquida o una composición que la incluya se aplica a la superficie de un ojo (por ejemplo, en forma de gotas líquidas), por ejemplo, en el tratamiento de defectos o enfermedades de la superficie ocular, tales como la enfermedad injerto contra huésped ocular (EICH ocular), úlceras corneales, ojo seco (queratoconjuntivitis seca) o reparación corneal después de una cirugía o lesión.

[0055] En otras realizaciones, la composición de fracción bioactiva líquida de la presente descripción, o una fracción de esta, puede usarse como una sustancia terapéutica. Por ejemplo, la composición puede usarse como una sustancia terapéutica para tratamientos médicos, incluso para el tratamiento de tejido enfermo o dañado, tal como tejido nervioso, tendón, hueso, músculo, piel (por ejemplo, cicatrización de heridas), conjuntivo, ocular y/o cardiovascular (por ejemplo, corazón o aorta). La fracción bioactiva líquida descrita en esta invención o las composiciones que la incluyen pueden administrarse a estos u otros tejidos mediante cualquier medio adecuado, incluidos, por ejemplo, inyección u otro implante quirúrgico. En determinados usos, en el tratamiento del tejido ocular, la composición bioactiva líquida o una composición que la incluya se aplica a la superficie de un ojo (por ejemplo, en forma de gotas líquidas), por ejemplo, en el tratamiento de defectos o enfermedades de la superficie ocular, tales como la enfermedad injerto contra huésped ocular (EICH ocular), úlceras corneales, ojo seco (queratoconjuntivitis seca) o reparación corneal después de una cirugía o lesión.

[0056] Según determinadas variantes de la invención, la fracción bioactiva líquida de la presente descripción se utiliza para tratar a un paciente mamífero (por ejemplo, humano, canino, felino, equino, etc.). En determinadas realizaciones, la fracción bioactiva líquida es alogénica con respecto al paciente diana, en otras realizaciones, la fracción bioactiva líquida es xenogénica con respecto al paciente diana. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se puede usar una composición de lisado plaquetario derivado de plaquetas humanas para tratar a un paciente canino. También se prevé que una composición de lisado plaquetario derivado de plaquetas caninas se pueda usar para tratar a un paciente canino, y que una composición de lisado plaquetario derivado de plaquetas humanas se pueda usar para tratar a un paciente humano. En algunas formas, el paciente padece queratoconjuntivitis seca. Según determinadas variantes de la invención, la fracción bioactiva líquida de la presente descripción se utiliza para tratar a un paciente canino que padece queratoconjuntivitis seca. El paciente canino puede ser cualquier raza de canino, razas habitualmente afectadas por la queratoconjuntivitis seca incluyen: Cavalier King Charles spaniel, bulldog, shar-pei chino, lhasa apso, shih tzu, West Highland white terrier, pug, perro de San Huberto, Cocker spaniel, pequinés, Boston terrier, schnauzer miniatura y samoyedo.

[0057] En determinadas realizaciones, el lisado plaquetario humano que contiene fracción bioactiva líquida se almacena en un dispositivo de administración de líquido configurado para administrar la fracción bioactiva líquida al ojo de un paciente. En algunas formas, el dispositivo de administración de líquido es un recipiente estéril. La figura 3 muestra una realización de un dispositivo de administración de líquido. En la realización ilustrada, la fracción bioactiva líquida se almacena dentro del dispositivo 300. El dispositivo 30o tiene una porción de almacenamiento 310 y una porción de distribución 320. En la realización ilustrada, la porción de distribución 320 puede cubrirse opcionalmente con la tapa 322. La porción de distribución 320 puede configurarse para dispensar una porción de fracción bioactiva líquida (por ejemplo, gotas individuales). En algunas formas, la porción de almacenamiento 310 comprende un material plástico deformable que puede estrujarse por un usuario. Otros dispositivos de suministro de líquido adecuados incluyen, sin limitarse: goteros oculares y pipetas.

[0058] Según determinadas realizaciones, la fracción bioactiva líquida de la presente descripción se formula en un ungüento. En algunas formas, un ungüento que contiene hPL se aplica por vía tópica en una zona afectada (por ejemplo, un ojo de un paciente).

[0059] La composición bioactiva líquida también se puede usar para otros fines, como, por ejemplo, crioconservante para células. En dichos usos crioconservantes, la composición bioactiva líquida se puede incorporar en una composición de suspensión celular, donde la composición de suspensión celular se puede crioconservar para preservar la viabilidad de las células. Las células pueden ser cualquiera de entre una variedad de células, incluidas células madre tales como células madre mesenquimatosas, células progenitoras u otras. La crioconservación se puede llevar a cabo en un recipiente adecuado, tal como una bolsa o vial.

[0060] Además de derivar productos de la fracción bioactiva líquida recuperada derivada del concentrado plaquetario lisado, también se pueden fabricar productos valiosos a partir del material de coágulo sólido formado durante la coagulación y la separación de un sólido de un líquido. En determinados modos, se ha descubierto que el material de coágulo sólido separado también es rico en factores de crecimiento y que contiene cantidades suficientes de fibrinógeno y factores de coagulación para servir como un vehículo coagulable, por ejemplo, en adhesivos biológicos, y/o para servir como un material hemostático para aplicaciones médicas. Para estos u otros fines, el material de coágulo sólido recuperado puede conservarse en una condición refrigerada o congelada y/o puede liofilizarse para formar un material seco que puede reducirse opcionalmente a una forma de polvo. Para aplicaciones médicas, diagnósticas, de investigación u otras, el material de coágulo sólido o fracciones derivadas de este se pueden esterilizar por cualquier medio adecuado, incluidos, por ejemplo, la exposición a radiación o esterilizantes químicos (por ejemplo, óxido de etileno).

[0061] Asimismo, además de la recuperación de la fracción bioactiva líquida, y posiblemente también productos hechos del material de coágulo sólido formado durante la coagulación y separación de un sólido de un líquido explicada anteriormente, las sustancias bioactivas tales como factores de crecimiento u otras proteínas se pueden recuperar individualmente o en mezclas del filtro o filtros utilizados para procesar el lisado plaquetario. Esto puede recuperar valor adicional del material de partida original. Ilustrativamente, un filtro de profundidad utilizado para filtrar la composición de lisado plaquetario (por ejemplo, un filtro de profundidad como se describe anteriormente en esta invención), puede procesarse posteriormente para recuperar uno o más factores de crecimiento u otras sustancias bioactivas atrapadas en el filtro. Esto se puede lograr de cualquier manera adecuada. Ilustrativamente, una o más proteínas, tales como factores de crecimiento, se pueden eluir del filtro mediante el paso de un líquido eluyente a través del filtro para superar la atracción de la o las proteínas hacia el medio filtrante y, de este modo, generar una corriente de eluido que contenga la o las proteínas. Cuando se utiliza un filtro de profundidad cargado (por ejemplo, cargado positivamente), que retiene proteínas basadas al menos en parte en una interacción de carga entre la o las proteínas y el medio de filtrado cargado, la o las proteínas se pueden recuperar del medio de filtrado mediante elución con solución o soluciones salinas, un cambio en el pH del líquido de elución (en relación con el utilizado durante la filtración inicial) o con un medio de elución de afinidad (que contenga un ligando o ligandos para la o las proteínas a eluir). La elución de gradiente (p. ej., con gradientes de sal o pH) se puede usar para eluir secuencialmente fracciones que se purifiquen o enriquezcan en una proteína o proteínas específicas de interés. La o las proteínas recuperadas pueden ser, por ejemplo, cualquiera de las identificadas en esta invención, preferentemente uno o más de los factores de crecimiento, interleucinas, interferones y/o factores de necrosis tumoral identificados en esta invención. Estos pueden usarse, por ejemplo, con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación. Después de la recuperación del medio de filtración, opcionalmente pueden purificarse y/o esterilizarse para estos u otros fines.

[0062] Con el fin de promover una mayor comprensión de los aspectos de la presente descripción y sus características y ventajas, se proporcionan los ejemplos específicos siguientes. Se entenderá que estos ejemplos son ilustrativos, y no limitativos, de realizaciones de la presente descripción.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Preparación de una composición de lisado plaquetario humano

[0063] Unidades plaquetarias humanas aferizadas cribadas por enfermedades (obtenidas de sangre periférica) que acaban de caducar después de una vida útil de 5 días se recogen y congelan a -20 °C en un congelador hasta su uso. Se retiran varias de las unidades (p. ej., aproximadamente 10 unidades) del congelador y se descongelan a temperatura ambiente. Así se lisan las plaquetas y se forma una composición de «hPL bruto». El hPL bruto de las unidades seleccionadas se agrupa en una bolsa. Se añade cloruro de calcio al hPL bruto mezclado a un nivel de 0,7 g/l (aproximadamente 6 mM de CaCh) y a continuación se mezcla a fondo con el hPL bruto en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la mezcla, el hPL bruto tratado con CaCl²se deja coagular durante la noche a temperatura ambiente, durante la cual se forma una masa de gel coagulado firme y sustancialmente homogénea a partir del volumen de hPL bruto.

[0064] Mientras permanece cerrada, la bolsa que contiene el coágulo de gel de hPL bruto se presiona manualmente a mano para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel. Este prensado se realiza a fondo, lo que da como resultado una masa de coágulo sólido en un extremo de la bolsa y un volumen de líquido separado en el otro extremo de la bolsa, adyacente a una boquilla de salida. El líquido separado representa aproximadamente el 75-80 % del volumen del hPL bruto mezclado original, y el material de coágulo sólido representa el resto. El líquido se transfiere de la bolsa a una segunda bolsa refrigerada que tiene un volumen de 100 l. Se lleva a cabo una cantidad suficiente de dichas series de congelación-mezcla-coagulación-extracción mediante presión para llenar la bolsa refrigerada de 100 l con líquido.

[0065] El líquido en la bolsa de 100 l se conecta asépticamente y se procesa a través de un tren de filtros constituido por un primer filtro de profundidad que tiene un medio de filtrado con una carga superficial positiva y una clasificación de micrómetros nominal de entre 3 y 0,2 micrómetros y un segundo filtro de profundidad que tiene un medio de filtrado con una carga superficial positiva y una clasificación de micrómetros nominal de entre 0,1 y 0,001 micrómetros. La filtración se lleva a cabo con una velocidad de flujo de filtrado de aproximadamente 100 litros por metro cuadrado de área de superficie del filtro por hora («LMH»). El primer filtro de profundidad se proporciona a partir de un filtro de profundidad Millistack Pod Filter Grade C0 Series HC, y el segundo filtro de profundidad se proporciona a partir de un filtro de profundidad Millistack Pod Filter Grade X0 Series HC, ambos disponibles comercialmente por Millipore Corporation. Cada uno de estos filtros tiene una membrana compuesta por ésteres mixtos de celulosa y medios de filtrado compuestos por fibras de celulosa con un auxiliar de filtro inorgánico (diatomita). Antes de procesar el material de la bolsa de 100 l, la serie de filtros se ceba con agua destilada estéril. El líquido hPL que sale de la serie de filtros se recoge en una segunda bolsa de 100 l.

[0066] La segunda bolsa de hPL de 100 l se conecta asépticamente y se bombea a través de un filtro estéril a recipientes más pequeños, por ejemplo, frascos de 100 ml o 500 ml (por ejemplo, frascos de Nalgene). Esto se puede hacer en condiciones de llenado estériles. Los frascos pueden envolverse con envasado retráctil para cubrir sus extremos taponados y etiquetados.

[0067] Un producto de hPL producido según este ejemplo tiene un perfil compositivo como se especifica en esta invención y se puede usar como suplemento para medios de cultivo celular sin el requisito de agregar heparina para evitar la formación de coágulos. La adición de este producto hPL a un medio de cultivo celular da como resultado un medio esencialmente sin coágulos, incluso sin la adición de heparina. Los medios de cultivo celular producidos de esta manera presentan excelentes propiedades en el cultivo de células, que incluyen, sin limitarse, células mesenquimatosas de médula ósea, células madre de adipocitos, células madre mesenquimatosas derivadas de placenta y células madre o progenitoras derivadas de músculos, con recuentos celulares o porcentaje de confluencia relativamente altos después de que se pueda obtener un período de cultivo dado en usos preferidos.

Ejemplo 2

Preparación de una composición de lisado plaquetario humano

[0068] Unidades plaquetarias humanas aferizadas cribadas por enfermedades (obtenidas de sangre periférica) que acaban de caducar después de una vida útil de 5 días se recogen y congelan a -20 °C en un congelador hasta su uso. Se retiran varias de las unidades (p. ej., aproximadamente 23 unidades) del congelador y se descongelan a temperatura ambiente. Así se lisan las plaquetas y se forma una composición de «hPL bruto». El hPL bruto de las unidades seleccionadas se agrupa en una bolsa. Se añade cloruro de calcio al hPL bruto mezclado a un nivel de 0,75 g/l (aproximadamente 6 mM de CaCh) y a continuación se mezcla a fondo con el hPL bruto en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la mezcla, el hPL bruto tratado con CaCl²se deja coagular durante la noche a temperatura ambiente, durante la cual se forma una masa de gel coagulado firme y sustancialmente homogénea a partir del volumen de hPL bruto.

[0069] Mientras permanece cerrada, la bolsa que contiene el coágulo de gel de hPL bruto se presiona para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel. Este prensado se realiza a fondo, lo que da como resultado una masa de coágulo sólido en un extremo de la bolsa y un volumen de líquido separado en el otro extremo de la bolsa, adyacente a una boquilla de salida. El líquido separado representa aproximadamente el 75-80 % del volumen del hPL bruto mezclado original, y el material de coágulo sólido representa el resto. El líquido se transfiere de la bolsa a una segunda bolsa de llenado que tiene un volumen de 25 l. Se lleva a cabo una cantidad suficiente de dichas series de congelación-mezcla-coagulación-extracción mediante presión para llenar la bolsa de llenado de 25 l con líquido.

[0070] La bolsa de llenado de 25 l se almacena durante la noche en un refrigerador de laboratorio a 4 °C. Se utiliza una bomba peristáltica para transferir el líquido desde la bolsa de llenado de 25 l a través de un prefiltro (25 mm) y un filtro estéril (0,2 mm). El líquido filtrado se agrupa en una bolsa de recogida. El líquido filtrado (hPl) a continuación se alícuota en recipientes estériles (p. ej., frascos de 100 ml o 500 ml de Nalgene). Esto se puede hacer en condiciones de llenado estériles. Los frascos pueden envolverse con envasado retráctil para cubrir sus extremos taponados y etiquetados.

[0071] Un producto de hPL producido según este ejemplo tiene un perfil compositivo como se especifica en esta invención y se puede usar como suplemento para medios de cultivo celular sin el requisito de agregar heparina para evitar la formación de coágulos, y también puede usarse en las otras aplicaciones identificadas en esta invención para fracciones bioactivas líquidas. La adición de este producto hPL a un medio de cultivo celular da como resultado un medio esencialmente sin coágulos, incluso sin la adición de heparina. Los medios de cultivo celular producidos de esta manera presentan excelentes propiedades en el cultivo de células, que incluyen, sin limitarse, células mesenquimatosas de médula ósea, células madre de adipocitos, células madre mesenquimatosas derivadas de placenta y células madre o progenitoras derivadas de músculos, con recuentos celulares o porcentaje de confluencia relativamente altos después de que se pueda obtener un período de cultivo dado en usos preferidos.

Ejemplo 3

Preparación de una composición de lisado plaquetario canino

[0072] Una composición de lisado plaquetario canino (CPL, del inglés Canine Platelet Lysate) puede prepararse sustancialmente como se describió anteriormente. Generalmente, la preparación de la composición de CPL comienza con la preparación de unidades plaquetarias caninas aferizadas cribadas por enfermedad obtenidas a partir de sangre periférica. Tal como se detalló anteriormente, dichas unidades plaquetarias pueden prepararse recientemente o puede obtenerse a partir de unidades plaquetarias caducadas. Las unidades plaquetarias se congelan a -20 °C en un congelador hasta su uso. Se retiran varias de las unidades (p. ej., aproximadamente 10 unidades) del congelador y se descongelan a temperatura ambiente. Así se lisan las plaquetas y se forma una composición de «CPL bruto». La CPL sin procesar de las unidades seleccionadas se mezcla en una bolsa. Se añade cloruro de calcio al CPL bruto mezclado a un nivel de 0,7 g/l (aproximadamente 6 mM de CaCl2) y a continuación se mezcla a fondo con el CPL bruto en un agitador a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la mezcla, el CPL bruto tratado con CaCl2 se deja coagular durante la noche a temperatura ambiente, durante la cual se forma una masa de gel coagulado firme y sustancialmente homogénea a partir del volumen de CPL bruto.

[0073] Mientras permanece cerrada, la bolsa que contiene el coágulo de gel de CPL bruto se presiona manualmente a mano para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel. Este prensado se realiza a fondo, lo que da como resultado una masa de coágulo sólido en un extremo de la bolsa y un volumen de líquido separado en el otro extremo de la bolsa, adyacente a una boquilla de salida. El líquido separado representa aproximadamente el 75-80 % del volumen del CPL bruto mezclado original, y el material de coágulo sólido representa el resto. El líquido se transfiere de la bolsa a una segunda bolsa refrigerada que tiene un volumen de 100 l. Se lleva a cabo una cantidad suficiente de dichas series de congelación-mezcla-coagulación-extracción mediante presión para llenar la bolsa refrigerada de 100 l con líquido.

[0074] El líquido recolectado (p. ej., fracción bioactiva líquida) a continuación se pasa a través de un filtro estéril. En algunas formas, el líquido recolectado se pasa a través de una serie de filtros de profundidad como se describe en el Ejemplo 1. El líquido filtrado (CPL) a continuación se alícuota en recipientes estériles (p. ej., frascos de Nalgene de 100 ml o 500 ml). Esto se puede hacer en condiciones de llenado estériles. Los frascos pueden envolverse con envasado retráctil para cubrir sus extremos taponados y etiquetados.

[0075] Un producto de CPL producido según este ejemplo tiene un perfil compositivo como se especifica en esta invención y se puede usar como suplemento para medios de cultivo celular sin el requisito de agregar heparina para evitar la formación de coágulos, y también puede usarse en las otras aplicaciones identificadas en esta invención para fracciones bioactivas líquidas. La adición de este producto CPL a un medio de cultivo celular da como resultado un medio esencialmente sin coágulos, incluso sin la adición de heparina. Los medios de cultivo celular producidos de esta manera presentan excelentes propiedades en el cultivo de células, que incluyen, sin limitarse, células mesenquimatosas de médula ósea, células madre de adipocitos, células madre mesenquimatosas derivadas de placenta y células madre o progenitoras derivadas de músculos, con recuentos celulares o porcentaje de confluencia relativamente altos después de que se pueda obtener un período de cultivo dado en usos preferidos. La solución de CPL también se puede usar como un agente terapéutico como se describe en esta invención.

[0076] El uso de los términos «un», «uno(a)», «el(la)» y referencias similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) deberá interpretarse como que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en esta invención o el contexto lo contradiga claramente. Se pretende meramente que la enumeración de intervalos de valores en esta invención sirva como un procedimiento abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en esta invención, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en esta invención. Todos los procedimientos descritos en esta invención se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en esta invención o que se contradiga claramente por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (p. ej., «tal como») proporcionado en esta invención, pretende simplemente explicar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva deberá interpretarse como que indica cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar una composición bioactiva, que comprende:

lisar plaquetas de un concentrado derivado de sangre humana que contenga plaquetas y plasma, para formar una preparación plaquetaria lisada;

formar un coágulo de gel a partir de la preparación plaquetaria lisada mediante la adición de un agente de coagulación para convertir fibrinógeno en fibrina en la preparación plaquetaria lisada;

comprimir el coágulo de gel para extraer mediante presión líquido del coágulo de gel y separar el líquido de los sólidos del coágulo de gel, en el que la etapa de compresión comprende presionar el coágulo de gel entre dos o más superficies;

en el que no se añade heparina durante la preparación de la composición bioactiva.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además incorporar la composición bioactiva en una composición en suspensión celular.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además someter la composición de suspensión celular a crioconservación.